CC BY
111
ФОСФОРЕСЦЕНТНЫЕ БИОЧИП - АНАЛИЗАТОРЫ ДЛЯ ЛАБОРАТОРНОЙ КЛИНИЧЕСКОЙ ДИАГНОСТИКИ
Осин Н.С., Соколов А.С., Аслиян С.К., Михайлов В.А., Токмакова Е.В.
ГНЦ ФГУП «Г осударственный научно-исследовательский институт биологического приборостроения» Федерального медико-биологического агентства, Москва, Россия, niibp@dol.ru
Разработаны биочип-анализаторы для мультикомпонентного микроанализа. Регистрация сигнала осуществляется с поверхности дна лунок полистироловых микропланшетов в режиме временного разрешения. В качестве универсального реагента для выявления аналитов используется стрептавидин, маркированный фосфоресцентной меткой Pt-копропорфирином. Время сканирования единичного планшета - 15 мин. Чувствительность - 1 молекула Pt-копропорфирина/мкм2.
Белковые (иммуно-) и ДНК-биочипы все шире начинают использоваться в клинической лабораторной практике. По сравнению с традиционными методами иммунохимического анализа, преимущества мультианалитических систем для клинической диагностики очевидны и связаны не только с повышением производительности и снижением стоимости анализа, но и с качественно новыми возможностями, обусловленными совмещением множества специфичных чувствительных элементов в формате биочипа.
Биочипы с люминесцентными методами регистрации сигнала занимают доминирующее положение. Их преимущества определяются возможностью регистрации предельно низких уровней люминесцентного сигнала на биочипах с высокой плотностью индикаторных элементов. Современные лазерные сканеры обеспечивают детектирование единичных молекул цианиновых люминофоров типа Су-3, Су-5 с поверхности слайда площадью 10 - 20 квадратных микрон. Однако, этих результатов удается достичь только на слайдах из специальных материалов или не люминесцирующих сортов стекла при большой апертуре сбора сигнала люминесценции.
Вместе с тем, наиболее привлекательным для клинической лабораторной практики, особенно для количественных тестов, является микропланшетный формат. Во-первых, увеличивается производительность по сравнению с использованием слайдов, во-вторых, может быть использовано обычное лабораторное оборудование для работы с планшетами (шейкеры, инкубаторы, промыватели и т.п.).
При переходе к микропланшетному формату резко снижается эффективность детектирования слабых сигналов люминесценции: падает апертура сбора и многократно возрастает уровень фоновой люминесценции пластика. С учетом этого, нами разработана техника регистрации сигнала с биочипов, размещенных на поверхности дна лунок микропланшета, в режиме временного разрешения люминесценции. В качестве метчиков используются длительно люминесцирующие соединения - металлопорфирины и хелаты ионов лантаноидов. За счет выделения сигнала в режиме временного разрешения удается существенно снизить пороговый уровень обнаружения таких метчиков в реакциях биоспецифического связывания. Выделение стробов длительной люминесценции полностью исключает влияние короткоживущей фоновой люминесценции примесей и минимизирует уровень фонового сигнала от клинических образцов.
Сигнал фосфоресценции регистрируют в режиме счета фотонов при последовательном сканировании отдельных участков дна лунки микропланшета светодиодом с длиной волны излучения 380 нм. Сканирование осуществляется в режиме выделения длительной люминесценции платина копропорфирина с максимумом фосфоресценции 645 нм и постоянной времени затухания 80 микросекунд или хелатных комплексов ионов европия на длине волны 615 нм с постоянной времени затухания 700 микросекунд. Чувствительность системы
детекции составляет около 106 молекул фосфоресцентной метки в освечиваемой площадке сканирования диаметром около 1 мм. Результаты сканирования регистрируют как число фотоимпульсов от каждой из микрозон. После компьютерной обработки, графическая картина распределения сигнала в микрозонах представляется в виде объемных цветных гистограмм или окрашенных пятен. Интенсивность сигнала в виде цветовой шкалы отражает концентрацию аналита в микрозоне.
Принципы и методики анализа с использованием технологии ФОСФАН подробно описаны в ряде работ [1-3].
На рисунке 1 показан образец фосфоресцентного биочип-анализатоа для лабораторий с небольшим объемом анализов - ИФИС. Кюветное отделение предназначено для размещения 8-ми или 12-луночного стрипа. На рисунке 2 представлен биочип-анализатор для массовых анализов с использованием 96 луночных микропланшетов. Время сканирования 96 образцов не превышает 15 минут.
Биочип-анализаторы планируется использовать совместно с наборами реагентов, тест-системами для решения широкого спектра задач в области клинической лабораторной диагностики инфекционных и соматических заболеваний. В настоящее время специалистами ФГУП ГосНИИБП решаются задачи по созданию тестов для серодиагностики инфекций передающихся иксодовыми клещами, пренатальной диагностики и неонатального скрининга врожденных аномалий развития.
Работа проводится при поддержке проекта МНТЦ 3135.
Рис.1. Индикатор фосфоресценции импульсный стриповый ИФИС.
Рис.2. Индикатор ФОСФАН для клинической лабораторной диагностики с помощью биочипов,
выполненных в микропланшетном формате.
1. Осин Н.С., Храмов Е.Н., Злобин В.Н. Технические средства индикации биопатогенов как основа обеспечения биологической безопасности. Молекулярная медицина.2006, №3, с.24-33.
2. Осин Н.С., Помелова В.Г., Быченкова Т.А., Соколов А.С. Новая технология фосфоресцентного иммуноанализа для обнаружения микроорганизмов и вирусов//Современные технологии в диагностике особо опасных инфекционных болезней. Материалы 4-ой Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ (30 сентября-2 октября 2003 г.Саратов).-2003.-С.138-143.
3. Осин Н.С., Помелова В.Г., Соколов А.С., Быченкова Т.А.,Бекман Н.И., Шарафудинова Т.Ю., Аслиян С.К., Ивановская Н.П., Ларичева С.Ю., Канаева Т.А. Фосфоресцентный микроанализ как новая технологическая платформа для молекулярной диагностики. Вестник РАМН.-2007,вып.№12,с.3-10
PHOSPHORESCENT BIOCHIP ANALYZERS FOR CLINICAL LABORATORY DIAGNOSTICS
Osin N.S., Sokolov A.S., Aslyan S.K., Mikhailov V.A., Tokmakova E.V.
Biochip analyzers have been developed for multicomponent microanalysis. Phosphorescence is registered in time-resolved mode from a microwell bottom of polystyrene microplates. Phosphorescent Pt coproporphyrin-labeled steptavidin is used as unified detection reagent. The period of a single microplate scanning is 15 min. The sensitivity is as low as 1 molecule of Pt coproporphyrin which can be detected from a square micron area.
