CC BY
108
Оригинальные исследования
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2014 УДК 615.281:616-002.5].012
Г.Н. Можокина1*, Н.А. Елистратова1, И.П. Соловьева1, А.С. Гущин2, В.Н. Елохина2
ПЕРСПЕКТИВЫ ИСПОЛЬЗОВАНИЯ НОВЫХ СОЕДИНЕНИЙ КЛАССА ТИОСЕМИКАРБАЗОНОВ С ЦЕЛЬЮ СОЗДАНИЯ ЛЕКАРСТВЕННЫХ ПРЕПАРАТОВ, ОБЛАДАЮЩИХ ПРОТИВОТУБЕРКУЛЕЗНОЙ АКТИВНОСТЬЮ
1ГБОУ ВПО "Первый Московский государственный медицинский университет им. И.М. Сеченова", 119991, г. Москва, Россия; НИИ фтизиопульмонологии, 127994, г. Москва, Россия; 2ОАО "Фармасинтез", 664007, г. Иркутск, Россия
*Можокина Галина Николаевна. E-mail: mojokina@mail.ru
♦ Представлены результаты экспериментального изучения противотуберкулезной активности новой соли тиосеми-карбазона (Phs-205) в сравнении с субстанцией перхлозона (перхлорат-4-тиоуреидоиминометил-пиридиния).
На модели генерализованного туберкулеза мышей оценивали противотуберкулезную активность Phs-205 в дозах 10, 20 и 30 мг/кг и перхлозона в дозе 20 мг/кг по патоморфологическим и микробиологическим критериям. Общетоксическое действие на мышей Phs-205 и перхлозона в использованных дозах оценивали по биохимическим и патоморфо-логическим параметрам.
Установлено, что Phs-205 в дозе 30 мг/кг оказывает наиболее выраженное протективное и терапевтическое действие при экспериментальном туберкулезе, вызванном микобактериями туберкулеза человеческого типа штамма H37Rv. Данные биохимических исследований свидетельствуют о более выраженном токсическом влиянии перхлозона на показатели белкового и липидного обмена.
Ключевые слова: противотуберкулезные препараты; тиосемикарбазоны; перхлозон; экспериментальный туберкулез; противотуберкулезная активность
G.N. Mojokina12, N.A. Elistratova12, I.P. Soloviyeva'2, A.S. Guschin3, V.N. Elokhina3 THE PERSPECTIVES OF APPLICATION OF NEW COMPOUNDS OF TIOSEMICARBAZONES CLASS WITH PURPOSE TO DEVELOP PHARMACEUTICALS WITH ANTI TUBERCULOSIS ACTIVITY
'The I.M. Sechenov first Moscow medical university of Minzdrav of Russia, 119992, Moscow, Russia
2The research institute of phthisiopulmonology, 127994 Moscow, Russia
3"The Pharmasynthesis", 664007 Irkutsk, Russia
♦ The article deals with the results of experimental study of anti tuberculosis activity of new salt tiosemicarbazone (Phs-205) in comparison with substance of perhloson (perchlorate-4-tioureidoiminometyl-pyridinium).
The model of generalized tuberculosis of mice was used to evaluate anti tuberculosis activity of Phs-205 in dosage of 10, 20 and 30 mg/kg and perhloson in dosage of 20 mg/kg according pathomorphological and microbiological criteria. It is established that Phs-205 in dosage of 30 mg/kg has the most expressed protective and therapeutic effect under experimental tuberculosis caused by mycobacterium of tuberculosis of human type H37Rv. The results of biochemical study testify the more expressed toxic effect of perhloson upon indicators of protein and lipid metabolism.
Keywords: anti tuberculosis pharmaceuticals; tiosemicarbazone; perhloson; experimental tuberculosis; anti tuberculosis activity
Распространение штаммов микобактерий с множественной лекарственной устойчивостью на фоне ограниченного арсенала противотуберкулезных препаратов ставит под угрозу успех мероприятий по борьбе с туберкулезом и диктует необходимость создания новых противотуберкулезных средств.
Перспективным путем повышения эффективности лечения туберкулеза является создание противотуберкулезных препаратов на основе химической модификации известных структур. В 50—60-х годах ХХ века были синтезированы соединения из класса тиосемикарбазонов, обладающих противотуберкулезной активностью [1], и созданы лекарственные препараты (тибон, тиоацетазон), которые в настоящее время не используются из-за низкой эффективности и высокой токсичности. В Иркутском институте химии СО РАН разработаны новые соединения производных класса тиосемикарбазонов. На основе перхлорат 4-тиоуреидоиминометилпиридиния был создан лекарственный препарат Перхлозон (ОАО "Фармасинтез", Иркутск), оказывающий выраженное, строго избирательное ингибирующее действие на жизнеспособность мико-бактерий туберкулеза (МБТ), особенно в отношении микобактерий бычьего типа. На моделях экспериментально -
го туберкулеза доказан протективный и терапевтический эффект перхлозона в условиях монотерапии, способность активировать фагоцитарную функцию макрофагов и усиливать лечебные свойства противотуберкулезных препаратов [2, 3]. Препарат разрешен для клинических испытаний и получен первый опыт его применения у больных туберкулезом [4].
В настоящее время при скрининге ряда новых соединений из класса тиосемикарбазонов на противотуберкулезную активность выделен образец с условным обозначением рьб-205, проявивший высокую активность в отношении лабораторных штаммов микобактерий человеческого и бычьего типов.
Целью данного исследования явилось изучение противотуберкулезной эффективности и безопасности рьб-205 в сравнении с таковой перхлозона на модели туберкулеза мышей.
Исследования проведены на 80 белых нелинейных мышах-самках массой 26—32 г (питомник "Андреевка", РАМН), которым внутривенно вводили культуру МБТ лабораторного штамма (И37Яу). Лечение животных начинали на 16-й день от момента заражения после выявления на контрольных вскрытиях макроскопически подтверж-
денных очагов специфического воспаления в легких. Животные были разделены на 5 групп: 4 опытные в соответствии с дозами вводимых препаратов и 1 контрольная — зараженные нелеченые мыши.
Phs-205 испытывали в трех дозах (10, 20 и 30 мг/кг), перхлозон в дозе 20 мг/кг при введении внутрижелудоч-но с помощью атравматического металлического зонда. Навески препаратов готовили ex tempore в 1 % крахмальном геле. Препараты вводили однократно ежедневно, без перерывов, в течение 28 дней. Зараженным нелеченым мышам в течение этого времени вводили изотонический раствор хлорида натрия. В течение исследования проводили осмотр животных, регистрировали поведенческие реакции, потребление кормов и воды. После окончания курса введения препаратов мышей умерщвляли путем декапита-ции с одновременным забором крови для проведения биохимических исследований. Эффективность химиотерапии оценивали по выживаемости мышей, изменению массы тела и весовых индексов внутренних органов, результатам патоморфологического, гистологического и микробиологического исследований. Для оценки общетоксического действия Phs-205 и перхлозона определяли в крови активность трансаминаз (АЛТ, АСТ, ед/л), содержание общего и прямого билирубина (в мкмоль/л), креатинина (в мкмоль/л), холестерина (в мкмоль/л), мочевины (в мкмоль/л). Исследование проводили на биохимическом анализаторе Sapfir-400 с использованием реактивов фирмы Diasys . Для сравнения использовали кровь от зараженных нелеченых и интактных мышей. Проводили статистическую обработку полученных результатов. Достоверность различий между группами наблюдений оценивали по критерию Стьюдента (Г.Ф. Лакин, 1980; Г.Г. Автандилов, 1980).
К концу эксперимента летальность в группе контроля (зараженные, нелеченые животные) составила 60%. Лечение Phs-205 в дозе 30, 20, 10 мг/кг снизило летальность мышей до 6,6, 13,3, 26,6% соответственно. Наиболее высокий индекс эффективности по снижению летальности (89%) отмечен при использовании Phs-205 в дозе 30 мг/кг. При использовании перхлозона в дозе 20 мг/кг летальность снизилась до 40%, а индекс эффективности составил 33,3%.
Защитное действие Phs-205 в дозе 30 мг/кг выражалось в сохранении массы тела мышей. При использовании Phs-205 в дозах 10 и 20 мг/кг и перхлозона отмечено достоверное снижение массы тела мышей по сравнению с исходной. В группе зараженных нелеченых животных потеря массы тела была также значительной.
При вскрытии мышей наименьшие видимые морфологические изменения легких были у мышей, получавших Phs-205 в дозах 30 и 20 мг/кг. При использовании Phs-205 в дозе 10 мг/кг и перхлозона выраженность поражения легких была схожей. Значения весовых индексов внутренних органов мышей из опытных групп, пролеченных Phs-205 или перхлозоном, достоверно не отличались от таковых у нелеченых животных.
При гистологических исследованиях легких зараженных нелеченых мышей выявлены выраженные мелко-, средне- и крупночаговые инфильтративно-пневмониче-ские изменения в виде диффузно-очаговых лимфомакро-фагальных скоплений, расположенных субплеврально, перибронхиально и интерстициально. В некоторых крупных очагах имелись выраженные участки казеоза. В ткани печени, почек и селезенки отмечалась значительная дис-семинация мелких лимфоцитарных гранулем.
В гистологических препаратах легких мышей, получавших лечение Phs-205, отмечено сохранение архитектоники легочной ткани. В перибронхиальной ткани отдельных бронхов, в интерстиции, периваскулярно встречались ограниченные лимфомакрофагальные скопления различных размеров: мелкие — при применении Phs-205 в дозе 30 мг/кг, средние — при дозе 20 мг/кг и разнока-
либерные — при дозе 10 мг/кг. В ткани печени мышей, получавших Phs-205, перивенулярно встречались лим-фоцитарные скопления и немногочисленные лимфоци-тарные мелкие гранулемы. Отмечались проявления дистрофических изменений: от дискомплексации печеночных балок, выраженной белковой дистрофии гепатоцитов при использовании дозы 30 мг/кг до умеренно выраженной гидропической дистрофии гепатоцитов при дозе 10 мг/кг. В селезенке мышей определялись слабовыраженная гиперплазия белой пульпы и единичные в препарате мелкие эпителиоидно-клеточные гранулемы. В ткани почек имела место слабовыраженная гидропическая дистрофия извитых канальцев, проявлений туберкулезной диссеми-нации не выявлено.
В гистологических препаратах легких мышей, получавших перхлозон, также сохранялась архитектоника легочной ткани. Встречались немногочисленные субмикроскопические гранулемы. В перибронхиальной ткани местами отмечено наличие умеренной лимфоцитарной инфильтрации с небольшой примесью плазматических клеток. В ткани печени наблюдались немногочисленные субмикроскопические лимфоцитарные гранулемы на фоне умеренно выраженной гидропической дистрофии гепа-тоцитов. В ткани почек обнаружена слабовыраженная ги-дропическая дистрофия извитых канальцев, проявлений туберкулезной диссеминации не отмечено. В препаратах селезенки определялись слабовыраженная гиперплазия белой пульпы и единичные в препарате мелкие эпителио-идно-клеточные гранулемы.
Установлен дозозависимый эффект при применении Phs-205: с уменьшением дозы препарата увеличивается объемная площадь поражения легких туберкулезным воспалением (с 1,93±0,39 до 6,27±0,85%). Коэффициент терапевтической эффективности по этому показателю был также самый высокий при использовании Phs-205 в дозе 30 мг на 1 кг массы и составил 95,2%. У мышей, получавших перхлозон, коэффициент эффективности составил 33,3%, а объемная площадь поражения легких туберкулезным воспалением существенно не отличалась от таковой у нелеченых животных.
Анализ результатов микробиологических исследований показал, что лечение мышей Phs-205 в дозе 30 мг/кг привело к существенному снижению высеваемости МБТ из всех исследованных органов. Индекс эффективности по снижению высеваемости МБТ по сравнению с зараженными нелечеными животными составил от 58,8 до 70,3% (рис. 1). С уменьшением дозы Phs-205 снижались
индексы эффективности высеваемости из легких, пече-
%
80-,
706050 -40302010-
0-
I ...... .......... I ...... .......... I
phs-205, 30 phs-205, 20 phs-205,10
Легкие |: ■; ■ ;| Печень
Перхлозон Селезенка
Рис сти
. 1. Индекс эффективности (в %) по снижению высеваемо-МБТ из легких, печени, селезенки мышей опытных групп по отношению к зараженным нелеченым мышам.
%
40 1 35 -30 -25 -20 -15 -10 -5 -
0 —
/У/У ^
Т7777\
АСТ
# Ж
/
/
Рис. 2. Отклонение биохимических показателей крови у зараженных нелеченных мышей по отношению к интактным животным.
ни, селезенки: соответственно 46,2, 54,5, 28,5% при дозе 20 мг/кг и 36,6, 25,2, 22,3% при дозе 10 мг/кг. Использование перхлозона привело к достоверному снижению высеваемости МБТ из легких и печени по сравнению с зараженными нелечеными. Индекс эффективности составил 37,4 и 27,1%. По индексу эффективности использование перхлозона было равноценным результату лечения Р^-205 в дозе 10 мг/кг.
Таким образом, наиболее высокий микробиологический эффект наблюдался при использовании рьб-205 в дозе 30 мг/кг.
По данным литературы [5], применение перхлозона у здоровых крыс в дозе 20 мг/кг в течение 2 нед сопровождалось повышением уровня креатинина на 68%, активности АЛТ (на 31%), АСТ (в 1,5 раза), содержания билирубина (на 28%), холестерина (на 64%), мочевины (на 34%). В нашем исследовании применение рьб-205 в дозах 10-30 мг/кг и перхлозона в дозе 20 мг/кг в течение 28 дней привело к изменению изученных биохимических показателей по сравнению с таковыми у зараженных нелеченых и интактных животных (рис. 2—4).
У зараженных нелеченых животных отмечено значительное повышение содержания общего билирубина (на 30,9%), активности АЛТ (на 37,6%), АСТ (на 27%), что свидетельствует о нарушении функционального состояния печени. Различия в показателях белкового и липидно-го обмена по сравнению с интактными животными были менее значимыми: повышение содержания холестерина на 8,3%; креатинина — на 1,2%, мочевины — на 14%.
На фоне экспериментального лечения отмечено значительное снижение по сравнению с зараженными нелечеными мышами показателей активности трансаминаз, особенно у мышей, получавших Р^-205 в дозах 10—30 мг/кг. Так, активность АЛТ снизилась на 23—23,5% при использовании рьб-205 в дозах 30 и 20 мг/кг и на 48,3% при дозе 10 мг/кг. Активность АСТ снизилась на 28—25,8% при использовании рьб-205 в дозах 30 и 20 мг/кг и на 38,2% при дозе 10 мг/кг. При использовании перхлозона активность трансаминаз снизилась незначительно: на 12% АЛТ и на 10% АСТ.
На фоне лечения отмечается повышение содержания холестерина по сравнению с таковым у нелеченых животных, особенно выраженное у мышей, получавших перхлозон (на 82%). Изменение содержания мочевины по сравнению с таковым у нелеченых мышей было неоднозначным: повысилось на 27% при применении перхлозона, снизилось на 3, 14, 20,8% при использовании рьб-205 в дозах 30, 20, 10 мг/кг соответственно.
20 10
%
-10 --20 --30 --40 --50 --60 -
АЛТ
АСТ
Билирубин Билирубин общий прямой
Биохимические показатели
р1~18-205, 30 мг/кг рЬв-205,10 мг/кг
рИа-205, 20 мг/кг Перхлозон
Рис. 3. Отклонение биохимических показателей функциональной активности печени у мышей опытных групп по отношению к зараженным нелеченым животным.
Таким образом, данные биохимических исследований свидетельствуют о более выраженном токсическом влиянии перхлозона на показатели белкового и липидного обмена. Тем не менее в гистологических препаратах печени и почек мышей, получавших Р^-205 во всех дозах, отмечались проявления гидропической дистрофии гепато-цитов от умеренной до слабой степени выраженности и слабовыраженная гидропическая дистрофия извитых канальцев почек. Аналогичные изменения были характерны для печени и почек мышей, получавших перхлозон.
На основании полученных результатов сравнительного изучения Р^-205 и перхлозона можно заключить, что соединение Р^-205 в дозе 30 мг/кг оказывает наиболее выраженное лечебное действие при экспериментальном
%
100 806040 20 0
-20-40-
1— -- -Г
Холестерин Креатинин
Мочевина Биохимические показатели
рИэ-гОб, 30 мг/кг рИэ-гОб, 10 мг/кг
рИэ-гОб, 20 мг/кг Перхлозон
Рис. 4. Отклонение показателей белкового и липидного обмена у мышей опытных групп по отношению к зараженным нелеченым животным.
туберкулезе, вызванном микобактериями туберкулеза штамма H37Rv.
Представляется перспективным дальнейшее изучение Phs-205 в дозе 30 мг/кг в схемах комплексной химиотерапии экспериментального туберкулеза.
ЛИТЕРАТУРА
1. Химия и медицина. Тиосемикарбазоны. М.: Медгиз; 1954.
2. Виноградова Т.И., Александрова А.Е., Ерешко С.В., Елохина В.Н., Нахманович А.С. "Перхлозон" — новое соединение, обладающее выраженной противотуберкулезной активностью. В кн.: Химия лекарственных веществ. СПб.; 1994.
3. Виноградова Т.И., Александрова А.Е., Антоненкова Е.В., Елохи-на В.Н., Нахманович А.С. Конструирование и исследование новых веществ, обладающих противотуберкулезной активностью: оригинальное соединение "перхлозон" как возможное средство этиотропной терапии туберкулеза. Проблемы туберкулеза. 1999; 3: 45—7.
4. Яблонский П.К., Павлова М.В., Виноградова Т.И., Заболотных Н.В., Арчакова Л.И., Малыгина Е.И. и др. Первый опыт применения нового противотуберкулезного препарата Перхлозон® во фтизиатрии. В кн.: Совершенствование медицинской помощи больным туберкулезом: Материалы Всероссийской научно-практической конференции. СПб; 2011: 269—70.
5. Самбуева З.Г., Малханова Г.Н., Павлов И.А., Гуляев С.М., Мон-додоев А.Г., Николаев С.М. и др. Влияние липосомальной фор-
мы перхлозона на морфофункциональное состояние печени и почек у белых крыс. Сибирский медицинский журнал. 2009; 4: 24—6.
REFERENCES
1. Chemistry and medicine. Thiosemicarbazone. Moscow: Medgiz; 1954 (in Russian).
2. Vinogradova T.I., Aleksandrov A.E., Ereshko S.V., Elokhina V.N., Nakhmanovich A.S. et al. "Perhlozon" — a new compound having expressed antituberculosis activity. In: Khimiya lekarstvennykh veshchestv. St. Petersburg; 1994 (in Russian).
3. Vinogradov T.I., Aleksandrova A.E., Antonenkova E.V., Elokhina V.N., Nakhmanovich A.S. et al. Design and investigation of new substances with anti-tuberculosis activity: original connection "perhlozon" as a possible causal treatment of TB. Problemy tuberkuliza. 1999; 3 45—7 (in Russian).
4. Yablonskiy P.K., Pavlov M.V., Vinogradova T.I., Zabolotnykh N.V., Archakova L.I., Malygina E.I. et al. First experience of a new anti-drug PERHLOZON® in phthisiology. In: Sovershenstvovanie meditsinskoy pomoshchi bol'nym tuberkulezom. St. Petersburg; 2011: 269—70 (in Russian).
5. Sambueva Z.G., Malkhanova G.N., Pavlov I.A., Gulyaev S.M., Mondodoev A.G., Nikolaev S.M. et al. Influence of liposomal form perhlozona on morphofunctional state of the liver and kidneys of white rats. Sibirskiy meditsinskiy zhurnal. 2009; 4: 24—6.
Поступила 06.09.13 Received 06.09.13
