CC BY
82
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ ПЕРСПЕКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ... 1 67
УДК 611.231-018:616-092.9:616-089.843
1 1 2 2 2 1 А.Н.Копылов , Н.Ю.Анисимова , Т.Х. Тенчурин , Т.Е. Григорьев , А.Ю. Хоменко , М.В. Киселевский
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ
ДЛЯ СОЗДАНИЯ МАТРИКСА ИМПЛАНТАТА ТРАХЕИ
'ФГБУ «РОНЦим. Н.Н.Блохина» РАМН, Москва 2НИЦ«Курчатовский институт», Москва
Контактная информация:
Копылов Алексей Николаевич, аспирант лаборатории клеточного иммунитета НИИ ЭДиТО ФГБУ «РОНЦ им. Н.Н.Блохина» РАМН
адрес: 115478 Москва, Каширское ш.,24; тел. +7(499)342-27-94 e-mail: lex.kopvlov@gmail.com
Статья поступила 10.12.2013, принята к печати 04.04.2013
Резюме
Целью работы являлось изучение отдельных аспектов биосовместимости материала на основе хитозана в условиях in vivo. Образцы тестируемого материала были созданы на базе НИЦ «Курчатовский институт» методом электроформования. Исследование биосовместимости материала осуществляли посредством подкожной трансплантации его образцов (1*1 см2) 5 линейным мышам линии CBA, по 1 образцу на животное. В период наблюдения (30 суток) проводили мониторинг общего состояния и двигательной активности животных. После изъятия образцов их подвергали макроскопическому осмотру и гистологическому исследованию микроструктуры, а также прилегающих к образцам тканей. Параллельно оценивали общетоксическое действия имплантируемых материалов на организмы мышей. С этой целью осуществляли патоморфологическое исследование внутренних органов животных. Проведенные испытания позволяют отнести образцы из этого материала к биосовместимым и биорезорбируемым, не оказывающим общетоксического воздействия на организм реципиента. По результатам проведенной работы сделан вывод: нетканый материал на основе хитозана из ультратонких волокон (диаметр волокна в среднем 0,6 мкм), полученных по технологии электроспининга, является перспективным для создания матрикса биоимплантата трахеи.
Ключевые слова: трахея, хитозан, матрикс, имплантат, биосовместимые материалы.
A.N. Kopylov1, N.Yu. Anisimova1, T.Kh. Tenchurin2, T.E. Grigoriev2, A.U. Khomenko2, M.V. Kiselevsky1 ADVANCED MATERIALS TO CREATE A MATRIX OF THE TRACHEA IMPLANTAT
1N.N.Blokhin RussianCancerResearchCenter of RAMS, Moscow
2NRC «KurchatovInstitute», Moscow
Abstract
The aim of this research is the studying the aspects of biocompatibility of the material based on chitosan by in vivo experiment. Samples of the studied material were made at Kurchatov institute with electroformation method. Studying of the biocompatibility of the sample was performed by subcutaneous implantation of fragments (1x1 cm) into CBA mice. 1 sample into 1 animal. During 30 days we had been watching the animals and their movement activity and condition. After taking samples out they underwent macroscopic exam and histological study of sample's microstructure and adjacent tissues. In the same time we performed pathomorphological study of organs. Performed studies allow us to consider these samples as biocompatible and biodegradable, non-toxic to recipient's organism. After acquiring the results, we came to the conclusion that material based on chitosan consisting of ultra-thin fibres (average diameter is 0,6 mcm) acquired with electrospinning technology is perspective for creating of tracheal bioimplantat matrix.
Key words: trachea, chitosan, matrix, implantat, biocompatible materials.
Введение
Потребность в замещении фрагментов трахеи и бронхов возникает как вследствие разрушения тканей из-за прогрессирования опухолевого или инфекционного процесса, так и после расширенных травм, предполагающих во время операционных вмешательств резекцию измененных участков. В ряде случаев объем, который необходимо реконструировать, является очень значительным, что препятствует не только нормальному функционированию органа, но и жизнеспособности организма в целом. Разработанные на данный момент подходы для решения этой задачи предусматривают использование имплантатов на основе синтетических и биологических тканей. Оптимальный имплантат должен:
• сохранять биосовместимость,
• не вызывать воспаления,
• сохранять физические свойства исходного образца,
• не обладать канцерогенными свойствами;
если матрикс биорезорбируемый, то скорость резорбции должна совпадать со скоростью восстановления ткани.
В настоящее время в медицине широко используются биодеградируемые и биосовместимые полимеры и сополимеры (хирургия, ортопедия, онкология и т.д). Из этих полимеров можно получать хирургические нити, пленочные материалы как покрытия на раны и ожоги, а также нетканые материалы, ортопедические термопластичные им-планты, пластины, винты, штифты и т.д.
№ 2/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ...
В перспективе полимеры могут быть использованы для изготовления лекарств пролонгированного или направленного (микрокапсулы, нанокап-сулы, вакцины и т.д.) действия [2; 5], прототипиро-вания органов и тканей. Выполняется множество работ по поиску и исследованию новых материалов для возмещения костно-хрящевых дефектов как синтетического, так и органического происхождения [1; 3; 4].
Из существующего в настоящее время широкого ассортимента полимеров в наибольшей степени требованиям, предъявляемым к субстанциям для построения матрикса трахеи, отвечают биоде-градируемые материалы из полисахаридов. Одним из наиболее привлекательных материалов этой группы является хитозан - катионный полисахарид естественного происхождения. Это полимер относят к биоразлагаемым, поскольку он подвержен ферментативной резорбции; он характеризуется антибактериальной активностью и тем, что хорошо поддается обработке [6-10]. Хитозан является производным хитина, основного полимера в составе скелета ракообразных, полученного путем частичного удаления ацетильных групп с атомов азота [9]. Полимерные цепи хитозана построены из остатков К-ацетил-Б-глюкозамина и D-глюкозамина, соединенных Р-(1^4)-гликозидными связями. Хитин является химически инертным, не растворяется в воде и органических растворителях. В зависимости от способа деацетилирования хитина получают образцы с разным содержанием ацетилированных остатков. Степень деацитилирования - один из важных факторов, определяющих физические, химические и биологические характеристики хитозана. Хитозан можно модифицировать через аминогруппу, придавая ему различные биоактивные (функциональные) свойства [7; 11]. Таким образом, уникальный комплекс физико-химических свойств делает хитозан отличным кандидатом для создания материалов биомедицинского применения, в том числе, в качестве основы материала матрикса трахеи [12], однако требуется тщательное исследование его биосовместимости.
Целью работы, рассмотренной в настоящей статье, являлось изучение отдельных аспектов биосовместимости материала на основе хитозана в условиях in vivo. Образцы тестируемого материала были созданы на базе НИЦ «Курчатовский институт» методом электроформования.
Материалы и методы
Материалы для исследований. Сотрудниками НИЦ «Курчатовский институт» для исследований были предоставлены образцы волокнистого материала из хитозана. Размер образцов 10*10 см2. Средний диаметр волокон 0,4 мкм. Для исследований биологических свойств, материал был разрезан на фрагменты размером 1*1 см2. Все образцы были подвергнуты вакуумизации в режиме 4*10-2 тор с целью удаления остаточного растворителя и стерилизации радиационным методом (доза облучения -1,5 Мрад).
Исследование биосовместимости образцов in vivo осуществляли посредством их подкожной трансплантации 5 линейным мышам линии CBA, по 1 фрагменту каждого образца на животное. Манипуляции с лабораторными животными проводились в соответствии с международными рекомендациями по проведению медико-биологических исследований с использованием животных, изло-
женными в «Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых для экспериментальных и научных целей» ЕЭС (Страс-бург,1985), руководствуясь требованиями Хельсин-ской декларации и Всемирной медицинской ассоциации (2000), а также рекомендациями, содержащимися в Директивах Европейского сообщества (86/609 ЕС), Приложении к приказу министра здравоохранения СССР №755 от 12.08.1977, Приказом Минсельхоза РФ №490 от 05.11.2008 «Об утверждении правил проведения лабораторных исследований в области ветеринарии» и Национальным Стандартом Российской Федерации «Принципы надлежащей лабораторной практики» (ГОСТ Р 53434-2009).
В пеотод наблюдения (30 суток) проводили мониторинг общего состояния и двигательной активности животных. После изъятия образцов проводили их макроскопический осмотр и гистологическое исследование микроструктуры, а также прилегающих к образцам тканей. Параллельно проводили оценку общетоксического действия имплантируемых материалов на организмы мышей. С этой целью осуществляли патоморфологическое исследование внутренних органов животных.
Результаты
До имплантации образцов материала животным, осуществляли исследование их микроструктуры с использованием микроскопии в проходящем свете, а также сканирующей электронной микроскопии.
Как продемонстрировано на рис. 1, материал имеет низкую плотность и большое количество связанных друг с другом пор, что, очевидно, обусловлено особенностью методики электроформования. Вследствие этого волокна на стационарном электроде укладываются друг на друга хаотическим образом. Из приведённых изображений видно, что волокна в материалах имеют преимущественно цилиндрическую форму с круглым размером поперечного сечения. Средний размер волокон исследуемого образца из нетканого материала на основе хитозана составляет 0,3 мкм. Нетканые материалы на основе хитозана имеют довольно узкое распределение волокон по размерам, которое находится в интервале от 0,2 до 0,8 мкм. Плотность упаковки материала на основе хитозана составляет 8 %. Средний размер поры в материале на основе хитозана составляет 1,5 мкм.
Для детализации сведений о биологических и токсических свойствах материала из хитозана нами были проведены исследования, направленные на изучение последствий подкожной трансплантации образцов линейным лабораторным мышам. Было отмечено, что у животных после имплантации, начиная с 4 суток наблюдения и в течение последующих 26 суток, не отмечалось признаков развития реакции отторжения образцов как в области имплантации (отек, абсцесс, гной, болезненность), так и на системном уровне (наличие воспалительных процессов, изменение двигательной активности, пищевых предпочтений). За время наблюдения случаев гибели животных не наблюдалось. После выведения животных из эксперимента проводили вскрытие и оценивали макроморфологические изменения со стороны образцов, примерно определяя объем деструкции относительно исходной площади. Были установлены признаки краевой деструкции образцов; площадь деструкции колебалась в
№ 2/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ..
диапазоне 16-30 % относительно исходного размера. Отмечали прочную фиксацию образцов в тканях животных и умеренное их инъецирование кровеносными сосудами (рис. 2).
Рис. 1. Микрофотографии волокнистого образца на основе хитозана:
А: в проходящем свете, увеличение х 400; Б: СЭМ.
Рис. 2. Макрофотографии гистологического образца из нетканого тонковолокнистого материала на основе хитозана через 1 месяц после гетеротопной имплантации мыш.
При изучении микроструктуры образца и окружающих тканей в гистологических препаратах можно констатировать сохранение округлой в сечении структуры отдельных волокон, формирующих образец, на фоне прорастания соединительной тканью реципиента с краев в толщу образца (рис. 3; см. вклейку). Отмечали признаки краевой колонизации экзогенного материала клетками реципиента, наличие гигантских клеток на фоне сохранения волокон образца, развитие по периферии импланта-та мощной краевой фиброзной капсулы. Таким образом, наблюдали медленное замещение объема искусственного экзогенного имплантата соединительной тканью реципиента.
Полученные данные свидетельствуют об отсутствии развития реакции острого отторжения испытуемого материала. Исследуемый образец подвергался инъецированию клетками мыши и вас-куляризации. При этом наблюдалась биорезорбция материала, что, вероятно, опосредовано привлечением гигантских многоядерных клеток реципиента.
Для изучения общей токсичности испытуемого материала после умерщвления у животных-
№ 2/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ...
реципиентов были отобраны образцы внутренних органов: сердца, печени, почек, легких, селезенки. Исследование их морфологии не выявило каких-либо значимых признаков патологического изменения их микроструктуры в сравнении с интактны-ми здоровыми мышами.
В целом, поскольку у животных в процессе наблюдения не наблюдалось каких либо признаков развития системных или локальных изменений, свидетельствующих о токсическом поражении органов с развитием острой органной недостаточности, можно сделать вывод об отсутствии системного острого токсического воздействия исследуемого материала на основе хитозана на организм лабораторных животных.
Обсуждение
Поскольку понятие биосовместимости материала является интегральным, для изучения этого аспекта его свойств необходимо убедиться в отсутствии развития со стороны макроорганизма наряду с реакцией острого отторжения в ответ на внедрение экзогенного материала, также воспалительной реакции и проявлений системного токсикоза. Для решения подобной задачи обоснованно применение морфологического исследования макроскопических характеристик и микроструктурных особенностей гистологических препаратов, приготовленных на основе имплантата и прилежащих тканей.
Биосовместимость экспериментальных образцов in vivo мы тестировали посредством проведения их подкожной имплантации линейным лабораторным животным на срок 30 суток. Полученные данные свидетельствуют об отсутствии развития реакции острого отторжения на имплантацию испытуемых образцов.
Было установлено, что за время пребывания в организме мыши, экзогенный материал был интенсивно колонизирован клетками реципиента, а также наблюдались признаки его васкуляризации, за счет чего образец к концу эксперимента был плотно фиксирован в окружающих тканях. Это, очевидно, также способствовало сравнительно высокой скорости биорезорбции материала в макроорганизме: через 30 суток после имплантации было констатировано уменьшение площади образцов до 30% относительно исходной.
Установленные цитокондуктивные характеристики данного образца микроволокнистого хитозана, вероятно, в значительной степени обусловлены не только его химическим составом, но и структурно-морфологическими характеристиками. Известно, что структура и морфология нетканых материалов полученных методом электроформования, определяется высокой скоростью волокнообразо-вания. Вследствие этого волокна на стационарном электроде укладываются друг на друга хаотическим образом, а нетканые материалы на их основе приобретают низкую плотность упаковки с большим количеством связанных друг с другом пор.
В частности, исследуемый образец имел плотность упаковки от 8 до 12 %, а средний размер диаметра пор в материале составлял 0,7-1,5 мкм. Как следует из приведенных данных световой и электронной микроскопии, волокна в материале имеют преимущественно цилиндрическую форму с круглым размером поперечного сечения. Установленный размер волокон для исследуемого образца соответствовал 0,3 мкм (0,2-0,8). Известно, что определенные органы и ткани могут селективно
накапливать частицы чужеродного организму материала или являться мишенью воздействия эндогенных факторов воспаления, развившегося в результате развертывания реакции отторжения.
К таковым относят легкие, печень, селезенка, почки и сердце.
Вследствие общего токсикоза могут быть отмечены нарушения микроструктуры органов (например, разрушение структуры канальцев почек, печеночных балок, набухание клубочков в почках); разрушение клеток, вызывающее десквамацию эпителия, некроз, появление в клетках апоптотиче-ских телец, пенистости цитоплазмы и т.д.; снижение воздушности легких; изменение клеточного состава органа (например, обеднение белой пульпы селезенки, гистиоцитарная или лейкоцитарная инфильтрация) и т.д., что индуцирует развитие органной и полиорганной недостаточности.
В результате анализа данных исследования микроструктуры внутренних органов мышей, которым имплантировали образцы изучаемого материала, был сделан вывод об отсутствии каких либо патогномоничных признаков.
В целом, поскольку у животных в процессе наблюдения не было симптомов развития системных или локальных изменений, свидетельствующих о токсическом поражении органов с развитием острой органной недостаточности, сделан вывод об отсутствии острого токсического воздействия исследуемого тонковолокнистого материала на основе хитозана.
Заключение
Таким образом, по результатам проведенного исследования ,нетканый материал из ультратонких волокон, полученных по технологии электро-спининга, на основе хитозана, перспективен для создания матрикса биоимплантата трахеи.
Проведенные испытания позволяют отнести образцы из этого материала к биосовместимым и биорезорбируемым, не оказывающим общетоксического воздействия на организм реципиента.
При этом указанный материал обладает такими характеристиками, которые в перспективе позволят его выгодно использовать при создании многослойного матрикса биоимплантата трахеи.
В частности, можно предположить, что нетканый материал на основе хитозана из ультратонких волокон, полученных по технологии электро-спининга, может быть использован как основной срединный слой многослойного биоимплантата, выполняя роль депо и скаффолда для плюрипо-тентных мезенхимальных клеток реципиента, которыми матрикс предполагается заселять перед имплантацией в макроорганизм.
Постепенно резорбируясь и васкуляризиру-ясь, этот материал призван обеспечить возможность постепенного замещения экзогенного материала собственными тканями реципиента с репарацией дефекта данной области.
Таким образом, согласно нашим представлениям указанный тип материала является весьма перспективным для использования в репаративной хирургии в области не только медицины человека, но и ветеринарии.
Работа выполнена при финансовой поддержке Министерства образования и науки РФ (ГК 14.512.11.0103).
№ 2/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ПЕРСПЕКТИВНЫЕ МАТЕРИАЛЫ ДЛЯ СОЗДАНИЯ...
Литература
1. Алексеева И., Кулаков А., Гольдштейн Д., Волков А. и др. Опыт использования тканеинженерной конструкции для увеличения объема костной ткани на верхней челюсти (срок наблюдения до 21 месяца)// Российский биотерапевтический журнал. - 2012. -11(1). -С. 75-7.
2. Дмитриева М., Оборотова Н., Санарова Е., Бунятян Н. Наноструктурированные системы доставки противоопухолевых препаратов// Российский биотерапевтический журнал. - 2012. - 11(4). - С. 21-7.
3. Копылов А., Максимкин А., Анисимова Н., Сенатов Ф., Чуков Д. и др. Сверхвысокомолекулярный полиэтилен как основа пористых имплантатов для восстановления костных дефектов. Исследование in vivo// Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - 4. - С. 39-42.
4. Сенатов Ф., Баранов А., Максимкин А., Копылов А. и др. Перспективный нанокомпозитный материал на основе сверхвысокомолекулярного полиэтилена для замещения дефектов хрящевой ткани// Российский биотерапевтический журнал. - 2011. - 11(2). - С. 47.
5. Юркштович Т., Бычковский П., Голуб Н., Капуцкий Ф. Структурно и химически модифицированные полисахариды в качестве основы для создания систем адресной доставки цитостатических препаратов в организм // Российский биотерапевтический журнал. - 2013. - 12(2). - С. 93.
6. Bae K. and Moon-Moo K.; Applications of chitin and its derivatives in biological medicine // Int. J. Mol. Sci. - 2010. - 11. - P. 5152-64.
7. de Alvarenga E.S. Characterization and properties of chitosan. In: Elnashar M. ed., Biotechnology of biopolymers. - InTech. - 2011. - Chapter 5. - P. 98-108.
8. Jolanta K., Mirko X., Jorg T. and Stepnowski P. Biomedical activity of chitin/chitosan based materials - influence of physicochemical properties apart from molecular weight and degree of n-acetylation // Polymers. - 2011. - 3. - P. 1875-901.
9. Kumar M., Muzzarell, R. Muzzarell C., Sashiwa H., Domb A. Chitosan chemistry and pharmaceutical perspectives // Chem. Rev. - 2004. - 104. - P. 6017-84.
10. Rinaudo M. Chitin and chitosan: properties and applications // Prog. Polym. Sci. - 2006. - 31. - P. 603-32.
11. Shi C., Zhu Y., Ran X. et al. Therapeutic potential of chitosan and its derivatives // J. Surg. Res. - 2006. -133. - P. 185-92.
12. Shi H., Wang W., Lu D. et al. Cellular biocompatibility and biomechanical properties of N-carboxyethylchitosan/nanohydroxyapatite composites for tissue-engineered trachea // Artif. Cells Blood Substit. Immobil. Biotechnol. - 2012. - 40(1-2). - P. 120-4.
Ф
Ф
НАУЧНЫЕ ЖУРНАЛЫ РОНЦ ИМ. Н.Н. БЛОХИНА РАМН
№ 2/том 13/2014
РОССИИСКИИ БИОТЕРАПЕВТИЧЕСКИИ ЖУРНАЛ
При ссылке на главу из книги, написанной коллективом авторов, указывают авторов _
главы и ее название, затем авторов или редакторов книги, название книги, номер издания (может отсутствовать), место издания, издательство (может отсутствовать), год и страницы, например:
Кэш Д. Этические и правовые основы медицинской помощи. Берек Д., Адаши И., Хил-лард П. (ред.). Гинекология по Эмилю Новаку: Пер. с англ. - М.: Практика, 2002. - С. 14-18.
При ссылке на журнал указывают авторов, затем название статьи, названию периодического издания или сборника предшествует символ //. После названия журнала указывается год, том, номер выпуска, первая и последняя страницы работы, например:
Поддубная И. В., Дёмина Е. А. Диагностика и определение распространенности (стади-рование) неходжкинских лимфом // Практическая онкология. - 2004. - № 3. - С. 176-184.
При ссылке на сборник статей указывают авторов, затем название статьи, сборника, место издания, год, страницы, например:
Коненко Г. А. Решение уравнений движения однофазного вязкого закрученного потока в длинной трубе. Отопление и вентиляция. - Иркутск, 1994. - С. 34-36.
При ссылке на тезисы докладов указывают авторов, затем название тезисов конференции, страницы. При ссылке на диссертации или авторефераты указывают автора, затем название диссертации, место и дату написания, страницы. При этом используются следующие сокращения: Дис... канд. мед. наук, Дис... д-ра мед. наук, Авторефер. дис... канд. мед. наук, Авторефер. дис. д-ра мед. наук. Ссылки на интернет-документы следует оформлять так:
Официальные периодические издания: электронный путеводитель / Рос. нац. б-ка, Центр правовой информации. [СПб.], 2005 - 2007. URL: http://www.nlr.ru/lawcenter/izd/index.html (дата обращения: 18.01.2007).
Логинова Л.Г. Сущность результата дополнительного образования детей // Образование: исследовано в мире: междунар. науч. пед. интернет-журн. 21.10.03. URL: http://www.oim.ru/reader.asp?nomer= 366 (дата обращения: 17.04.07).
Рынок тренингов Новосибирска: своя игра [Электронный ресурс]. - Режим доступа: http://nsk.adme.ru/news/2006/07/03/2121.html
В тексте рекомендуется использовать международные названия лекарственных средств, которые пишутся с маленькой буквы. Торговые названия препаратов пишутся с большой буквы.
В конце статьи должны стоять подписи всех авторов. На отдельном листе авторам следует указать почтовый адрес для переписки, включающий почтовый индекс, телефон(ы), факс и адрес электронной почты. Все статьи, поступившие в редакцию, подлежат рецензированию. Рецензенты для каждой статьи назначаются редакционной коллегией. Если рецензенты и редакторы предлагают исправить работу, то копия с таким предложением отправляется автору. Эта копия возвращается вместе с переработанным экземпляром, который представляется на бумаге и в электронном виде.
Редакция оставляет за собой право отклонить работу из-за несоответствия профилю и требованиям журнала, достоверности и объективности данных, наличия ошибок или непод-крепленных достоверными фактами деклараций, противоречащих современным научным представлениям и опыту.
Редакция журнала осуществляет научное и литературное редактирование статей, обязуется информировать авторов обо всех смысловых изменениях, возникающих при редактировании их работ (это не касается литературной правки).
Статьи, ранее опубликованные в других журналах или сборниках, не будут приняты к публикации.
С уважением,
главный редактор А.Ю. Барышников
