CC BY
114
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
DOI: 10.17691 /stm2015.7.3.03
НОВЫЙ БИОСОВМЕСТИМЫЙ МАТЕРИАЛ НА ОСНОВЕ
модифицированного твердофазным методом хитозана для лазерной стереолитографии
УДК 546.824.31:629.74.04 Поступила 21.05.2015 г.
П.С. Тимашев, к.х.н., старший научный сотрудник лаборатории сверхкритических флюидных технологий1; К.Н. Бардакова, научный сотрудник лаборатории лазерной химии и биологии1;
Т.С. Демина, к.х.н., научный сотрудник лаборатории твердофазных химических реакций2;
Г.И. Пудовкина, научный сотрудник лаборатории лазерной химии и биологии1;
М.М. Новиков, зав. лабораторией лазерного синтеза объемных изделий3;
М.А. Марков, научный сотрудник лаборатории лазерного синтеза объемных изделий3;
Д.С. Асютин, к.м.н., научный сотрудник отделения спинальной нейрохирургии4;
Л.Ф. Пименова, ординатор отделения спинальной нейрохирургии4;
ЕА Свидченко, научный сотрудник лаборатории твердофазных химических реакций2;
A. М. Ермаков, к.б.н., старший научный сотрудник лаборатории энергетики биологических систем5;
И.И. Селезнева, к.ф.-м.н., и.о. зав. лабораторией роста клеток и тканей5;
B. К. Попов, д.ф.-м.н., зав. лабораторией сверхкритических флюидных технологий1;
Н.А Коновалов, д.м.н., профессор, зав. отделением спинальной нейрохирургии4;
Т.А. Акопова, д.х.н., ведущий научный сотрудник лаборатории твердофазных химических реакций2;
A. Б. Соловьева, д.х.н., зав. лабораторией модифицированных полимерных систем6;
B. Я. Панченко, д.ф.-м.н., профессор, академик РАН, директор3;
В.Н. Баграташвили, д.ф.-м.н., профессор, руководитель отдела лазерной атомно-молекулярной технологии1
Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, Отделение перспективных лазерных технологий, Москва, Троицк, 192148, ул. Пионерская, 2;
2Институт синтетических полимерных материалов им. Н.С. Ениколопова РАН, Москва, 117393, ул. Профсоюзная, 70;
3Институт проблем лазерных и информационных технологий РАН, Шатура, Московская область, 140700, ул. Святоозерская, 1;
4НИИ нейрохирургии им. академика Н.Н. Бурденко, Москва, 125047, ул. 4-я Тверская-Ямская, 16; 5Институт теоретической и экспериментальной биофизики РАН, Пущино, Московская область, 142290, ул. Институтская, 3;
6Институт химической физики им. Н.Н. Семенова РАН, Москва, 119991, ул. Косыгина, 4
Цель исследования — разработка нового биодеградируемого материала на основе хитозана, синтезированного твердофазным способом, а также создание на его основе трехмерных биосовместимых матриц-носителей клеток методом лазерной стереолитографии.
Материалы и методы. Реакционно-способные системы создавали на основе хитозана с привитыми твердофазным методом ал-лильными группами, полиэтиленгликоля диакрилата и фотоинициатора Irgacure 2959. Структуры получали на установке лазерной стереолитографии ЛС-120 (ИПЛИТ РАН, Россия).
Результаты. Установлено, что частичное замещение аминогрупп хитозана аллильными группами (ХТ-А) и введение в качестве сшивающего агента полиэтиленгликоля диакрилата (ПЭГ-ДА) не снижает биосовместимости материала. Определение метаболической активности клеток линии NCTC L929 с использованием МТТ-теста показало, что исследуемые образцы материалов на основе ХТ-А и ХТ-А со сшивающим агентом ПЭГ-ДА не содержат токсичных для клеток млекопитающих водорастворимых компонентов. Они являются биосовместимыми, поддерживают адгезию, распластывание и пролиферативную активность мезенхимальных стволовых клеток человека, но имеют существенные различия в степени и характере активации экспрессии генов-маркеров дифференцировки по остеогенному пути.
Ключевые слова: твердофазный синтез; лазерная стереолитография; хитозан; трехмерные матриксы; биосовместимые материалы; цитотоксичность; мезенхимальные стволовые клетки человека.
Для контактов: Тимашев Петр Сергеевич, e-mail: [email protected]
20 СТМ J 2015 — том 7, №3 П.С. Тимашев, К.Н. Бардакова, Т.С. Демина, Г.И. Пудовкина, М.М. Новиков В.Н. Баграташвили
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
English
Novel Biocompatible Material Based
on Solid-State Modified Chitosan for Laser Stereolithography
P.S. Timashev, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Supercritical Fluid Technologies1;
K. N. Bardakova, Researcher, Laboratory for Laser Chemistry and Biology1;
Es. Demina, PhD, Researcher, Laboratory of Solid-State Chemical Reactions2;
G.I. Pudovkina, Researcher, Laboratory for Laser Chemistry and Biology1;
М.М. Novikov, Head of Laboratory of Laser Synthesis of 3D Products3;
МА Markov, Researcher, Laboratory of Laser Synthesis of 3D Products3;
D. s. Asyutin, MD, PhD, Researcher, Spinal Neurosurgery Department4;
L. F. Pimenova, Resident Physician, Spinal Neurosurgery Department4;
E. А. svidchenko, Researcher, Laboratory of Solid-State Chemical Reactions2;
А.М. Ermakov, PhD, Senior Researcher, Laboratory of Biological Systems Energetics5;
I.I. selezneva, PhD, Acting Head of Cell and Tissue Growth Laboratory5;
VA Popov, DSc, Head of Laboratory of Supercritical Fluid Technologies1;
NA Konovalov, MD, DSc, Professor, Head of Spinal Neurosurgery Department4;
та Akopova, DSc, Leading Researcher, Laboratory of Solid-State Chemical Reactions2;
А.В. solovieva, DSc, Head of Laboratory for Modified Polymer Systems6;
V.Ya. Panchenko, DSc, Professor, Academician of the Russian Academy of Sciences, Director3;
V.N. Bagratashvili, DSc, Professor, Head of Laser Atomic and Molecular Technologies Department1
Institute on Laser and Information Technologies, Department of Advanced Laser Technologies, Russian Academy of Sciences, 2 Pionerskaya St., Moscow, Troitsk, 192148, Russian Federation;
2Enikolopov Institute of Synthetic Polymeric Materials, 70 Profsoyuznaya St., Moscow, 117393, Russian Federation;
institute on Laser and Information Technologies, Russian Academy of Sciences, 1 Svyatoozerskaya St., Shatura,
Moscow region, 140700, Russian Federation;
4Academician N.N. Burdenko Research Institute of Neurosurgery, 16, 4th Tverskaya-Yamskaya St., Moscow,
125047, Russian Federation;
institute of Theoretical and Experimental Biophysics, Russian Academy of Sciences, 3 Institutskaya St., Pushchino,
Moscow region, 142290, Russian Federation;
6Semenov Institute of Chemical Physics, Russian Academy of Sciences, 4 Kosygina St., Moscow,
119991, Russian Federation
The aim of the investigation was to develop a novel biodegradable material based on chitosan synthesized by solid-state technoogy, and to create based on biocompatible three dimensional cell-carrying scaffolds using laser stereolithography.
Materials and Methods. Reactive systems were developed based on chitosan grafted with allyl, polyethylene glycol diacrylate, and the photoinitiator Irgacure 2959. The structures were obtained using laser stereolithography setting lS-120 (Institute on Laser and Information Technologies, Russian Academy of Sciences, Russia).
Results. Partial replacement of chitosan amino groups by allyl groups (CT-А) and the introduction of polyethylene glycol diacrylate (Peg-Da) as a crosslinking agent were found not to reduce the material biocompatibility. The metabolic activity determination of NCTC l929 cells using MTT assay showed that the samples under study to contain none water-soluble components toxic to mammalian cells. The samples based on CT-A and CT-A with a crosslinking agent PEG-DA are biocompatible and are able to support adhesion, spreading and proliferative activity of human mesenchymal stromal cells, but have significant differences in the extent and nature of the expression activation of gene markers for osteogenic differentiation path.
Key words: solid-state synthesis; laser stereolithography; chitosan; three-dimensional matrices; biocompatible materials; cytotoxicity; human mesenchymal stromal cells.
В последние годы активно развиваются исследования и разработки в области биомедицинского материаловедения, направленные на решение задач регенеративной медицины. Их актуальность, по данным статистики ВОЗ, обусловлена ростом числа травм и повреждений, чья терапия связана с использованием замещающих имплантатов. Известно, что восстановление нормальных функций живой системы посредством
стимулирования роста ткани значительно эффективнее подходов, связанных с применением замещающих структур (протезирование и др.) [1]. Для формирования трехмерных структур, содержащих биоактивные компоненты, используют несколько различных методов, в том числе метод трехмерной печати [2] и метод селективного лазерного спекания [3]. Весьма перспективным для этих целей является метод лазерной стереолито-
Новый биосовместимый материал на основе хитозана для лазерной стереолитографии СТМ J 2015 — ТОМ 7, №3 21
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
графии, основанный на инициировании локальных пространственных сшивок между реакционно-способными звеньями макромолекул под действием лазерного излучения в УФ-области спектра. Этот метод позволяет создавать структуры заданной архитектоники на базе трехмерной компьютерной модели, которая может быть разработана с использованием как специального программного обеспечения, так и данных, полученных методами анализа пространственной структуры объекта in vivo (например, МРТ-данных дефектов тканей при создании соответствующих полимерных имплантатов)
[4]. Методом лазерной стереолитографии уже были получены разнообразные трехмерные матриксы-носители (скаффолды) на основе желатина [5], гиалуроновой кислоты [6], фибрина [7]. Для успешного применения указанного метода в регенеративной медицине необходима разработка широкой номенклатуры новых биосовместимых фотополимеризующихся композиций.
Цель исследования — разработка нового биодеградируемого материала на основе хитозана, синтезированного твердофазным способом, а также создание на его основе биосовместимых трехмерных матриц-носителей клеток методом лазерной стереолитографии.
Материалы и методы
Твердофазное модифицирование хитозана. Твердофазный синтез непредельного простого эфира хитозана — аллилхитозана (ХТ-А) — осуществляли действием на хитозан бромистого аллила (99%; sigma-Aldrich, Германия) в отсутствие жидкой дисперсионной среды в условиях сдвигового деформирования в двухшнековом экструдере BerstorffZE40 (Германия). Экструдер оснащен однонаправленно вращающимися силовыми элементами шнеков, которые обеспечивают сжатие и сдвиг материала в тонком слое. Химическое взаимодействие компонентов в состоянии вынужденного пластического течения в этих условиях приводит к образованию продуктов с высоким выходом [8]. В соответствии с работой [9] использовали хитозан, полученный методом твердофазного синтеза путем щелочного деацетилирования хитина панцирей краба («ВОСТОК-БОР», Россия). Содержание остаточных ацетамидных (хитиновых) звеньев в образце исходного хитозана составляло 10%, средняя степень полимеризации звеньев хитозана в макромолекуле была 360 (Ми=60 ^a). На одно звено хитозана брали 0,5 моля алкилирующего агента и проводили обработку реакционных смесей при температуре -5°С. Продукты промывали изопропанолом и сушили в вакуумном шкафу при 50°С для полного удаления непрореагировавшего мономера.
Приготовление фотоотверждаемой композиции. Для получения фоточувствительной композиции готовили 5% раствор ХТ-А в 4% уксусной кислоте. Нерастворимую фракцию (немодифицированный хитин с высокой степенью кристалличности) отделяли центрифугированием (40 мин, 14 500 об./мин), после чего раствор фильтровали через мембрану с размером пор 0,45 мкм. Далее 120 мл раствора помещали на
1 ч в испарительный бюкс (35°С; 0,2 МПа) для удаления части растворителя, после чего вносили диакрилат полиэтиленгликоля (ПЭГ-ДА, Sigma-Aldrich, Германия) 15% мас. и перемешивали при комнатной температуре 30 мин. В полученный гидрогель вносили фотоинициатор Irgacure 2959, 1% мас. (BASF Kaisten AG, Германия). Перемешивание системы проводили при комнатной температуре в течение 2 ч до получения гомогенного раствора.
Подготовка образцов для клеточных испытаний. Приготовленную композицию наносили на поверхность покровных стекол диаметром 12 мм (площадь поверхности образцов — 1,13 см2). Покровные стекла перед нанесением гидрогеля промывали водой, помещали на 6 ч в 5% водный раствор соляной кислоты, затем в течение 20 мин отмывали в ультразвуковой бане дистиллированной водой. УФ-ин-дуцированную сшивку гидрогелей производили в течение 120 мин при воздействии УФ-ртутной лампы ДРШ-100 (Россия). Были приготовлены материалы двух типов — чистый ХТ-А и ХТ-А со сшивающим агентом ПЭГ-ДА.
Клеточные испытания. Все образцы материалов перед проведением тестов стерилизовали 70% спиртом в течение 3 мин, после чего промывали стерильной культуральной средой DMEM/F-12 с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Исследование биосовместимости в условиях in vitro проводили с использованием вытяжек и путем культивирования клеток на поверхности самих материалов.
Модельной средой для приготовления вытяжек являлась культуральная среда DMЕM/F-12 с добавлением 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина. Вытяжки получали с соблюдением асептики в течение 3 сут при 37°С, на каждый материал делали три пробы. Соотношение площади поверхности материала и объема модельной среды составляло 1,13 см2/1 мл среды. Цитотоксическое действие растворимых примесей, содержащихся в вытяжках материалов, на фибробласты линии NCTC L929 оценивали с помощью МТТ-теста согласно описанной процедуре [10].
Для определения адгезионных характеристик материалов и их взаимодействия с субстратзависимыми клетками были использованы мезенхимальные стволовые клетки (МСК), выделенные из абортивного ау-топсийного материала плодов человека по методике, разработанной ранее [11]. Культивирование клеток проводили в среде DMEM/F-12 (1:1, Life technologies, США), содержащей также: 10% FBS (Fetal Bovine Serum, HyClone, США), 2 ммоля L-глутамина, 100 ЕД/мл пенициллина и 100 мкг/мл стрептомицина, раствор витаминов («ПанЭко», Россия) при 37°С в атмосфере 5% СО2. По мере роста и достижения субконфлюентного состояния клетки обрабатывали 0,25% раствором трипсин-ЭДТА и производили их пересев (пассаж) в новые флаконы (клеточную массу одного флакона разделяли на два флакона). Для проведения исследований использовали клетки на 4-м пассаже.
Клетки высевали на поверхность исследуемых образцов с плотностью 50 тыс./см2 и культивировали в те-
^тшту/ттшу/ттттшту/ттшу/ттттшту/ттшу/ттт^тттттшу/ттшхтттттшу^
22 СТМ J 2015 — том 7, №3 П.С. Тимашев, К.Н. Бардакова, Т.С. Демина, Г.И. Пудовкина, М.М. Новиков В.Н. Баграташвили
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
чение 7 и 23 дней. Оценку морфологии и жизнеспособности клеток проводили на микроскопе Axiovert 200 (Karl Zeiss, Германия) с использованием флюоресцентного окрашивания набором красителей L-7007 LIVE/DEAD Bac Light Bacterial Viability Kit (Invitrogen, США).
По завершении культивирования проводили подготовку образцов для исследования с помощью сканирующей электронной микроскопии (СЭМ), для чего образцы промывали в 0,1 М фосфатно-солевом буфере (рН=7,4) и фиксировали 12 ч при температуре 5°С в 2,5% забуфе-ренном растворе глутарового альдегида. После фиксации образцы геля промывали фосфатным буферным раствором (PBs) и дегидратировали при 4°С последовательно в батарее водного раствора этанола возрастающей концентрации:
50, 75, 80, 90% и в абсолютном этаноле на заключительном этапе. На каждой стадии образцы дважды погружали на 5 мин в соответствующий раствор этилового спирта. Для удаления спирта образцы переносили на 30 мин в гекса-метилдисилазан (HMDs), после чего высушивали на воздухе.
Методика проведения полимеразной цепной реакции в режиме реального времени. Для выделения общей матричной РНК из клеток использовали набор «Выделение полноразмерной поли(А) мРНК на магнитных частицах» («Силекс», Москва). Полученную мРНК применяли для синтеза комплементарной ДНК с помощью набора «Синтез первой цепи кДНК (олиго(дТ)15)» («Силекс», Москва), а кДНК, полученную в результате реакции обратной транскрипции, — в качестве матрицы для проведения полимеразной цепной реакции (ПЦР) в режиме реального времени.
Реакцию ПЦР выполняли на приборе ABI Prism 7500 (Applied Biosystems, США) в присутствии интеркалиру-ющего красителя sybrGreen и референсного красителя ROX. Исследовали экспрессию 22 генов-маркеров, отображающих процесс дифференцировки по остеогенному пути (см. таблицу). Маркерные гены были выбраны из базы данных для PCR Arrays QIAGEN (Германия) для определения остеогенеза (http://www.sabiosciences. com, «human osteogenesis PCR Array» PAHs-026Z), а также базы данных Gene Ontology (ID: 000164) [12, 13]. Праймеры для каждого маркерного гена подбирали с помощью программы PrimerEpress (Applied Biosystems, США).
Концентрация праймеров в реакциях по оптимизации составляла 0,05 пмоль/мкл, концентрация ионов Mg2+ — от 1,5 ммоль, концентрация фермента — 0,2 ед. на 20 мкл реакции. Длина праймеров составляла в среднем 24 нуклеотида. Температура отжига — 60°С, длина амплифицируемого фрагмента — 94-100 пар нуклеотидов. Для проверки специфичности реакции продукты амплификации проверяли электрофорезом в 2% агарозе, а также по кривым температурной диссоциации ампликонов.
Гены, использовавшиеся для оценки уровня дифференцировки по остеогенному типу
Символ Описание Номер в банке генов
BGLAP Bone gamma-carboxyglutamate (gla) protein NMJ99173
BMP1 Bone morphogenetic protein 1 NM_006129
BMPR1A Bone morphogenetic protein receptor, type IA NM_004329
BMP7 Bone morphogenetic protein 7 NM_001719
FGF-2 Fibroblast growth factor 2 (basic) NM_002006
FGFR1 Fibroblast growth factor receptor 1 NM_015850
IGF1 Insulin-like growth factor 1 (somatomedin C) NM_000618
IGF2 Insulin-like growth factor 2 (somatomedin A) NM_000612
EGFR Epidermal growth factor receptor NM_005228
IGFR1 Insulin-like growth factor 1 receptor NM_000875
COL1A1 Collagen, type I, alpha 1 NM_000088
COL3A1 Collagen, type III, alpha 1 NM_000090
ALPL Alkaline phosphatase, liver/bone/kidney NM_000478
SPP1 Secreted phosphoprotein 1 NM_000582
RUNX2 Runt-related transcription factor 2 NM_004348
SMAD2 SMAD family member 2 NM_005901
SMAD4 SMAD family member 4 NM_005359
SMAD5 SMAD family member 5 NM_005903
TWIST1 Twist homolog 1 (Drosophila) NM_000474
VDR Vitamin D (1,25-dihydroxyvitamin D3) receptor NM_000376
TGFBR1 Transforming growth factor, beta receptor 1 NM_004612
TNF Tumor necrosis factor NM_000594
ACT Actin, beta (house keeping) NM_001101
RPLP0 Ribosomal protein, large, P0 (house keeping) NM_001002
GAPDH Glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase NM_002046
Анализ данных, полученных с помощью ПЦР в режиме реального времени, производили по пороговой флюоресценции методом ААС(Т) с помощью web-ресурса для анализа данных PCR Arrays QIAGEN (http:// www.sabiosciences.com).
В качестве референса использовали экспрессию генов актина (ACT), большой субъединицы рибосомаль-ного белка (RPLP0) и глицеальдегид-3-фосфат дегидрогеназы (GAPDH).
Обработка данных. Статистическую обработку результатов клеточных испытаний и набухания проводили с помощью программы Origin, за ошибку принимали среднеквадратичное отклонение от среднего значения, за достоверные данные принимали различия по U-критерию Манна-Уитни при р<0,05.
Лазерная стереолитография. Все образцы были изготовлены на экспериментальном макете лазерного стереолитографа ЛС-120 (ИПЛИТ РАН, Россия) с использованием HeCd-лазера (длина волны — 325 нм, мощность излучения — 15 мВт). Толщина слоя при выращивании образцов составляла 200 мкм. Скорость формирования слоя определяли исходя из мощности лазера и экспериментально установленных технологических параметров отверждения композиции:
Новый биосовместимый материал на основе хитозана для лазерной стереолитографии СТМ J 2015 — ТОМ 7, №3 23
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Ec=50 мДж/см2 (параметр, характеризующий пороговое значение экспозиционной дозы облучения для начала формирования твердой полимерной пленки) и Dp=0,15 мм (параметр, характеризующий критическую толщину пленки).
Определение характеристик набухания. Характеристики набухания трехмерных структур изучали в соответствии с разработанным алгоритмом. Полученные трехмерные структуры (без предварительной осушки) по описанной выше методике помещали на 2 ч в этиловый спирт (ректификат) или 25% водный раствор аммиака. После этого образцы помещали в дистиллированную воду или PBs, в которых их выдерживали в течение 9 дней. За это время происходило набухание скаффолда до максимального значения содержания воды. В процессе набухания растворитель меняли каждые 48 ч для моделирования поведения структур in vivo. Перед взвешиванием структуры на 10 мин помещали на нетканый материал для удаления излишней влаги. Процедуру повторяли для трех идентичных образцов до постоянного значения массы. Степень набухания (sWR) определяли по формуле:
И/ - ИЛ
SWR(%)=swd 100,
где Wd — масса матрицы после проведения процесса лиофильной сушки; Ws — масса набухшей матрицы.
Набухание также измеряли в фосфатно-солевом буфере и дистиллированной воде без использования дополнительных растворителей.
Результаты и обсуждение
Синтез реакционно-способных полимерных систем на основе хитозана. Хитозан — катионный полисахарид, имеющий практически в каждом элементарном звене свободную первичную аминогруппу. Это определяет биологическую активность, а также делает его наиболее интересным объектом в ряду полисахаридов для проведения химического модифицирования. Для того чтобы повысить реакционную способность функциональных групп хитозана в процессах сшивания при воздействии лазерного излучения, в его структуру были введены непредельные группы путем взаимодействия с бромистым аллилом в условиях сдвиговых деформаций в экструдере. Твердофазный синтез, позволяющий проводить процессы химического модифицирования полимеров в отсутствие жидких дисперсионных сред, катализаторов и инициаторов процессов, был выбран как наиболее приемлемый метод для решения проблемы термодинамической несовместимости гидрофильного хитозана и гидрофобного модификатора. Аминогруппы хитозана намного реакционно-способнее его гидроксильных групп в некатализируемых реакциях нуклеофильного замещения, тогда как реакция в щелочной среде приводит к образованию смешанных O- и N-замещенных аллилпроизводных [14, 15]. В выбранных условиях проведения синтеза, по данным ядерно-магнитнорезонансной и ИК-Фурье спектроскопии, замещение происходит в основном по аминогруппам хитозана согласно приведенной ниже схеме:
Анализ спектра протонного магнитного резонанса образца аллилхитозана в растворе D2O с добавлением 1% HCl (полученного на спектрометре Bruker Avance II 300, Германия) показал, что содержание звеньев с аллильными фрагментами составляет 8-10%. Химический сдвиг углерода аллильной метиленовой группы (при 53 м.д.) в 13C-{1H} APT (75,5 МГц) спектре образца свидетельствует о его связи с атомом азота и указывает на преимущественное N-алкилирование субстрата. При этом модифицированный гидрофобными ненасыщенными заместителями хитозан сохранил характерную для исходного полимера растворимость в кислых водных средах. Электронные спектры поглощения 1% растворов образцов исходного хи-тозана и аллилхитозана в 0,1 М HCl регистрировали на спектрофотометре Shimadzu UV 2501 PC (Япония) в кварцевой кювете с длиной оптического пути 1 см. Для полученных спектров было проведено математическое разделение полос, относящихся к поглощению и рэлеевскому рассеянию, а затем выполнено разложение спектров поглощения на отдельные полосы. Спектры поглощения аллилхитозана лежат в области 200-420 нм и содержат три интенсивные полосы с максимумами 264, 301 и 351 нм, соотношение высот которых составляет 0,3/1/0,1 (в спектре исходного хитозана присутствуют полосы 252, 299 и 346 нм с соотношением высот 1/1/0,4). Таким образом, в спектре продукта аллилирования преобладает компонент с максимумом 301 нм, причем его интенсивность увеличена в 2 раза по сравнению с исходным хитозаном, а интенсивность двух других полос значительно снижена. При разбавлении растворов хитозана и аллилхи-тозана форма спектров электронного поглощения не меняется, что свидетельствует об отсутствии агрегации в растворах обоих полимеров в диапазоне концентраций 0,125-1%.
Биосовместимость и биологическая активность композиции на основе хитозана. Исследование метаболической активности клеток линии NCTC L929 в присутствии вытяжек из материалов ХТ-А и ХТ-А с ПЭГ-ДА было проведено с использованием МТТ-тес-та, который основан на способности митохондриальных дегидрогеназ конвертировать водорастворимый 3-(4,5-диметилтиазол-2-ил)-2,5-дифенил-2Н-тетразо-
^тшту/ттшу/ттттшту/ттшу/ттттшту/ттшу/ттт^тттттшу/ттшхтттттшу^
24 СТМ J 2015 — том 7, №3 П.С. Тимашев, К.Н. Бардакова, Т.С. Демина, Г.И. Пудовкина, М.М. Новиков В.Н. Баграташвили
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 1. Метаболическая активность клеток линии NCTC L929 по результатам МТТ-теста при инкубации 48 ч с трехсуточными вытяжками из материалов: 1 — аллилхитозан; 2 — аллилхитозан + ПЭГ-ДA; 3 — на поверхности покровного стекла
Рис. 2. Внешний вид мезенхимальных стволовых клеток человека при инкубации на поверхности аллилхитозана: 1-е сутки инкубации (а, б); 7-е сутки инкубации (в-е). Окраска клеток Syto 9 (а, в); окраска ядер мертвых клеток пропидий йодом (б, г); микрофотографии сканирующей электронной микроскопии (д, е)
Новый биосовместимый материал на основе хитозана для лазерной стереолитографии СТМ J 2015 — том 7, №3 25
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
лиум бромид (МТТ) в формазан, количество которого определяется фотометрически по оптической плотности раствора при облучении источником света с длиной волны 540 нм. Исследование показало отсутствие значимых различий с контролем у трехсуточных вытяжек из образцов, что свидетельствует об отсутствии водорастворимых токсических компонентов в разработанных композициях (рис. 1).
Для определения адгезионных характеристик материалов и их взаимодействия с субстратзависи-мыми клетками были использованы МСК человека. Исследование морфологических особенностей и жизнеспособности МСК человека, культивируемых на поверх-
ности ХТ-А и ХТ-А с ПЭГ-ДА, показало, что клеточная гибель не превышает 1-2%. Клетки распластываются и пролиферируют на поверхности обоих исследуемых материалов. Морфология клеток не имеет существенных различий с контролем, однако плотность клеточного монослоя на покровном стекле на 7-е сутки значительно выше, чем на полимерных пленках (рис. 2-4). Для оценки влияния физико-химических характеристик материалов на дифференцировочную активность МСК человека был определен фенотипический профиль клеток на разных этапах культивирования. Поскольку для отображения процесса дифференцировки по остеогенному пути обычно используют анализ 22 основных
Рис. 3. Внешний вид мезенхимальных стволовых клеток человека при инкубации на поверхности пленки аллилхитозана + ПЭГ-ДА: 1-е сутки инкубации (а, б); 7-е сутки инкубации (в-е). Окраска клеток Syto 9 (а, в); окраска ядер мертвых клеток пропидий йодом (б, г); микрофотографии сканирующей электронной микроскопии Д, е)
^тшту/ттшу/ттттшту/ттшу/ттттшту/ттшу/ттт^тттттшу/ттшхтттттшу^
26 СТМ J 2015 — том 7, №3 П.С. Тимашев, К.Н. Бардакова, Т.С. Демина, Г.И. Пудовкина, М.М. Новиков В.Н. Баграташвили
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 4. Внешний вид мезенхимальных стволовых клеток человека при инкубации на поверхности покровного стекла (контроль): 1-е сутки инкубации (а, б); 7-е сутки инкубации (в-е). Окраска клеток syto 9 (а, в); окраска ядер мертвых клеток пропидий йодом (б, г); микрофотографии сканирующей электронной микроскопии (д, е)
генов-маркеров (см. таблицу) [12, 13], то в настоящей работе методом ПЦР в режиме реального времени изучали их экспрессию.
Уже на 7-е сутки культивирования клеток на стекле и исследуемых полимерах наблюдаются различия в степени активации экспрессии генов-маркеров дифференцировки по остеогенному пути (рис. 5, а). В контроле (культивирование на стекле) и на материале аллилхитозан происходит активация экспрессии и наблюдается повышенный уровень мРНК генов ALPL, FGFR1, TWIsT, BMP1, IGFR1, VDR и TGFBR1. В то же время клетки, культивируемые на материале ХТ-А с ПЭГ-ДА, слабо экспрессируют исследуемые гены, в
них только повышен уровень BGLAP и sMAD 5. На этом этапе культивирования на всех материалах в клетках не обнаруживается транскрипции гена BMP7.
Более длительное культивирование (23 дня) клеток на исследуемых материалах несколько меняет картину уровня транскрипции генов (рис. 5, б). У клеток на всех материалах исчезает экспрессия TNF. На образцах ХТ-А сохраняется высокий уровень экспрессии лишь небольшого числа генов, по сравнению с клетками, культивируемыми на стекле. В контрольной группе в целом сохраняется прежний паттерн транскрипции маркерных генов, но большинство генов его значительно усиливают. При этом количество мРНК генов IGFR1,
Новый биосовместимый материал на основе хитозана для лазерной стереолитографии СТМ J 2015 — ТОМ 7, №3 27
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
min
Ч 2. ип
RUNX2 IGF1 SMAD4 EGFR ALPL FGF-2I SMAD21 COL1A1 IGFR1 VDR ВМР1 IGF2 TGFBR1 COL3A1 BMPR1A FGFR1 TRUST 1 BGLAPI SMADSf SPP1 TNFI
£ и ч
hJ NJ NJ
BMPR1A TGFBR1 BGLAP FGF-2 BMP7 SMAD5 SPP1 RUNX2 COL3A1| TWIST1 FGFR1 SMAD4I IGF2 EGFR VDR ALPL SMAD2| IGF1 BMP1 COL1A1
ll
Magnitude of gene expression
avg
niav
Рис. 5. Уровни экспрессии генов в мезенхимальных стволовых клетках человека, культивируемых в течение 7 сут (а) и 23 сут (б) на поверхности материалов: S и S2 — ХТ-А; T и T2 — ХТ-А с ПЭГ-ДА; контроль — покровное стекло
б
а
VDR и TGFBR1 снижается. Культивирование клеток на образцах ХТ-А с ПЭГ-ДА стимулирует транскрипцию генов c несколько другим паттерном, нежели в контроле. В этих клетках повышен уровень экспрессии BGLAP, FGF-2, sPP1, sMAD5, COL3A, TWIsT1, появляется BMP7, а транскрипция генов IGF2, EGFR и VDR выражена слабо.
Таким образом, аллилхитозан уже на начальных
этапах культивирования клеток индуцирует гены дифференцировки в остеогенном направлении, тогда как материал ХТ-А с ПЭГ-ДА проявляет это свойство только при длительном культивировании клеток.
Матриксы, полученные методом лазерной стереолитографии. Полученные методом лазерной стереолитографии матриксы на основе ХТ-А представляют собой структурно-однородный материал, образцы выполнены в виде скрещенных между собой спиралей (рис. 6) или двух наложенных друг на друга окружностей с лучами, направленными в центр, и отверстием (форма колеса). При слабых недлительных механических воздействиях исходные матриксы полностью восстанавливают свою прежнюю форму. При высыхании прочность образцов возрастает, однако уменьшается упругость и увеличивается хрупкость материала.
Метод регулирования степени набухания разработанных трехмерных структур. Важной задачей при создании материалов для биомедицинских трехмерных структур является разработка композиций, позволяющих регулировать степень набухания матриц на их основе при использовании in vivo [16]. Проведение заместительной терапии при введении таких структур в поврежденные ткани при выполнении хирургической операции может не только стимулировать процесс заживления, но и снижать отечность, забирая из места травмы излишнюю биожидкость [17]. Для представленных в настоящей работе материалов и структур на их основе был разработан подход, позволяющий регулировать степень набухания скаффолдов в пределах от 490 до 630% мас.
Алгоритм исследования набухания представлен в разделе «Материалы и методы». Высокие значения степеней набухания (до 630%) были получены для матриксов, предварительно выдержанных в аммиаке
Рис. 6. Внешний вид структурированных матриксов; 1 деление линейки = 1 мм
28 СТМ { 2015 — том 7, №3 П.С. Тимашев, К.Н. Бардакова, Т.С. Демина, Г.И. Пудовкина, М.М. Новиков, ..., В.Н. Баграташвили
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
Рис. 7. Степень набухания полимерных матриксов в различных растворителях: дистиллированной воде (1), воде после выдерживания в этаноле (2), воде после выдерживания в аммиаке (3), PBs (4), PBs после выдерживания в этаноле (5), PBs после выдерживания в аммиаке (6)
1 2 3 4
Рис. 8. Трехмерные структуры, полученные на основе модифицированного хитозана, в том числе: исходный образец (1), образцы после лиофильной сушки и предварительного выдерживания в PBs (2), NH4OH и PBs (3), ^^ОН и PBs (4); 1 деление линейки = 1 мм
и потом помещенных в дистиллированную воду. При использовании в качестве растворителя PBs для образцов, выдержанных 2 ч в этаноле, среднее значение степени набухания составляло 630%. Статистическая обработка результатов показывает, что эмпирические значения U^ данных образцов находятся в зоне незначимости (рис. 7, столбцы 1, 3, 4 соответственно).
Для снижения степени набухания в буфере образец предварительно обрабатывали аммиаком. При этом хитозан переходил в основную форму. Отсутствие ацетатного противоиона на аминогруппе снижает сорбционную способность матриксов относительно жидкости, помогая тем самым убрать излишнее набухание.
Аналогичное значение sWR было получено для матриксов, набухших в дистиллированной воде после предварительной выдержки в этиловом спирте (рис. 7, столбцы 2 и 5), которая приводила к незначительному сжатию структуры (в сравнении с обработкой аммиаком). Это происходит вследствие вытеснения из поли-
мера молекул «связанной» воды молекулами этанола. Трехмерные структуры, полученные на основе модифицированного хитозана, в том числе исходный образец, а также образцы после лиофильной сушки и предварительного выдерживания в PBs и NH4OH представлены на рис. 8.
Заключение. Созданы реакционно-способные производные хитозана в результате его взаимодействия с бромистым аллилом в условиях сдвиговых деформаций в экструдере при отсутствии растворителей. На основе полученных соединений в ходе проведения УФ-индуцированной сшивки в присутствии фотоинициатора и сшивающего агента сформирован ряд пленок. Исследование метаболической активности клеток линии NCTC L929 с использованием МТТ-теста показало, что рассматриваемые образцы не содержат токсичных для клеток млекопитающих водорастворимых компонентов. Новые материалы аллилхитозан и аллил-хитозан с диакрилатом полиэтиленгликоля являются
Новый биосовместимый материал на основе хитозана для лазерной стереолитографии СТМ j 2015 — том 7, №3 29
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
биосовместимыми, в равной степени поддерживают адгезию, распластывание и пролиферативную активность мезенхимальных стволовых клеток человека, но имеют существенные различия в степени и характере активации экспрессии генов-маркеров дифференци-ровки по остеогенному пути. На основе разработанного материала методом лазерной стереолитографии получены трехмерные матрицы с контролируемой степенью набухания в физиологическом растворе.
Финансирование. Работа выполнена при финансовой поддержке Российского научного фонда — проект №15-13-00140 (в части лазерной стереолитографии и исследований цитотоксичности скаффолдов) и Российского фонда фундаментальных исследований — проект №14-29-07234-офи_м (в части синтеза модифицированного хитозана).
Конфликт интересов. У авторов нет конфликта интересов.
Литература
1. Regenerative Medicine. Editor by steinhoff G. springer science+Business media B.V.; 2011; 1032 p., http://dx.doi. org/10.1007/978-90-481-9075-1.
2. Lam C.X.F., Moa X.M., Teoh s.H., Hutmacher D.W. scaffold development using 3D printing with a starch-based polymer. Materials science and Engineering: C 2002 May; 20(1-2): 49-56, http://dx.doi.org/10.1016/s0928-4931(02)00012-7.
3. Chumnanklang R., Panyathanmaporn T., sitthiseripratip K., suwanprateeb J. 3D printing of hydroxyapatite: effect of binder concentration in pre-coated particle on part strength. Materials science and Engineering: C 2007 May; 27(4): 914-921, http:// dx.doi.org/10.1016/j.msec.2006.11.004.
4. Mankovich N.J., samson D., Pratt W., Lew D., Beumer J. surgical planning using three-dimensional imaging and computer modeling. Otolaryng Clin North Am 1994 Oct; 27(5): 875-889.
5. Koroleva A., Kufelt O., schlie-Wolter s., Hinze U., Chichkov B. Laser microstructured biodegradable scaffolds. Biomedizinische Technik/Biomedical Engineering 2013 Oct; 58(5): 399-405, http://dx.doi.org/10.1515/bmt-2013-0036.
6. Leach J.B., Bivens K.A., Collins C.N., schmidt C.E. Development of photocrosslinkable hyaluronic acid polyethylene glycol-peptide composite hydrogels for soft tissue engineering. J Biomed Mater Res A 2004 Jul; 70A(1): 74-82, http://dx.doi. org/10.1002/jbm.a.30063.
7. Koroleva A., Gittard s., schlie s., Deiwick A., Jockenhoevel s., Chichkov B. Fabrication of fibrin scaffolds with controlled microscale architecture by a two-photon polymerization-micromolding technique. Biofabrication 2012 Mar; 4(1): 015001, http://dx.doi.org/10.1088/1758-
5082/4/1/015001.
8. Prut E.V., Zelenetskii A.N. Chemical modification
and blending of polymers in an extruder reactor. Russian Chemical Reviews 2001; 70(1): 65-79, http://dx.doi.
org/10.1070/RC2001v070n01ABEH000624.
9. Акопова Т.А., Роговина С.З., Вихорева Г.А., Зеленецкий С.Н., Гальбрайх Л.С., Ениколопов Н.С. Образование хитозана из хитина в условиях сдвиговых деформаций. Высокомолекулярные соединения. Серия Б 1991; 32(10): 735-737.
10. Filippov Ya.Yu., Larionov D.s., Putlyaev V.I., sokolov A.V., Koval'kov V.K., Agakhi K.A., selezneva I.I., Nikonova Yu.A.
Reaction-associated resorbable phosphate materials: production and testing in vitro. Glass & Ceramics 2013 Nov; 70(7-8): 306310, http://dx.doi.org/10.1007/s10717-013-9568-8.
11. Селезнева И.И., Савинцева И.В., Вихлянцева Е.Ф., Давыдова Г.А., Гаврилюк Б.К. Иммобилизация и длительное культивирование эмбриональных стволовых клеток мыши в матриксе коллаген-хитозанового геля. Клеточные технологии в биологии и медицине 2006; 3: 135-140.
12. Twine N.A., Chen L., Pang C.N., Wilkins M.R., Kassem M. Identification of differentiation-stage specific markers that define the ex vivo osteoblastic phenotype. Bone 2014 Oct; 67: 23-32, http://dx.doi.org/10.1016/j.bone.2014.06.027.
13. Ho N.C., Jia L., Driscoll C.C., Gutter E.M., Francomano C.A. A skeletal gene database. J Bone Miner Res 2000 Nov; 15(11): 2095-2122, http://dx.doi.org/10.1359/ jbmr.2000.15.11.2095.
14. Нудьга Л.А., Петрова В.А., Денисов В.М., Петропавловский Г.А. Алкилирование хитозана. Журнал прикладной химии 1991; 64(1): 229-232.
15. Xia Y., Guo T., Zhao H., song M., Zhang B., Zhang B. A novel solid phase for selective separation of flavonoid compounds. J sep sci 2007 Jun; 30(9): 1300-1306, http:// dx.doi.org/10.1002/jssc.200600376.
16. Kerker J.T., Leo A.J., sgaglione N.A. Cartilage repair: synthetics and scaffolds: basic science, surgical techniques, and clinical outcomes. sports Med Arthrosc 2008; 16(4): 208-216, http://dx.doi.org/10.1097/JsA.0b013e31818cdbaa.
17. Tollar M., Stol M., Kliment K. surgical suture materials coated with a layer of hydrophilic Hydron gel. J Biomed Mater Res 1969 Jun; 3(2): 305-313, http://dx.doi.org/10.1002/ jbm.820030210.
References
1. Regenerative Medicine. Editor by steinhoff G. springer science+Business Media B.V.; 2011; 1032 p., http://dx.doi. org/10.1007/978-90-481-9075-1.
2. Lam C.X.F., Moa X.M., Teoh s.H., Hutmacher D.W. scaffold development using 3D printing with a starch-based polymer. Materials Science and Engineering: C 2002 May; 20(1-2): 49-56, http://dx.doi.org/10.1016/s0928-4931(02)00012-7.
3. Chumnanklang R., Panyathanmaporn T., sitthiseripratip K., suwanprateeb J. 3D printing of hydroxyapatite: effect of binder concentration in pre-coated particle on part strength. Materials Science and Engineering: C 2007 May; 27(4): 914-921, http:// dx.doi.org/10.1016/j.msec.2006.11.004.
4. Mankovich N.J., samson D., Pratt W., Lew D., Beumer J. surgical planning using three-dimensional imaging and computer modeling. Otolaryng Clin North Am 1994 Oct; 27(5): 875-889.
5. Koroleva A., Kufelt O., schlie-Wolter s., Hinze U., Chichkov B. Laser microstructured biodegradable scaffolds. Biomedizinische Technik/Biomedical Engineering 2013 Oct; 58(5): 399-405, http://dx.doi.org/10.1515/bmt-2013-0036.
6. Leach J.B., Bivens K.A., Collins C.N., schmidt C.E. Development of photocrosslinkable hyaluronic acid polyethylene glycol-peptide composite hydrogels for soft tissue engineering. J Biomed Mater Res A 2004 Jul; 70A(1): 74-82, http://dx.doi. org/10.1002/jbm.a.30063.
7. Koroleva A., Gittard s., schlie s., Deiwick A., Jockenhoevel s., Chichkov B. Fabrication of fibrin scaffolds with controlled microscale architecture by a two-photon polymerization-micromolding technique. Biofabrication
30 СТМ J 2015 — TOM 7, №3 П.С. Тимашев, К.Н. Бардакова, Т.С. Демина, Г.И. Пудовкина, М.М. Новиков В.Н. Баграташвили
ОРИГИНАЛЬНЫЕ ИССЛЕДОВАНИЯ
2012 Mar; 4(1): 015001, http://dx.doi.org/10.1088/1758-
5082/4/1/015001.
8. Prut E.V., Zelenetskii A.N. Chemical modification
and blending of polymers in an extruder reactor. Russian Chemical Reviews 2001; 70(1): 65-79, http://dx.doi.
org/10.1070/RC2001v070n01ABEH000624.
9. Akopova T.A., Rogovina S.Z., Vikhoreva G.A., Zelenetskiy S.N., Gal'braykh L.S., Enikolopov N.S. Formation of chitosan from chitin under shearing strain. Vysokomolekulyarnye soedineniya. Seriya B 1991; 32(10): 735-737.
10. Filippov Ya.Yu., Larionov D.S., Putlyaev V.I., Sokolov A.V., Koval'kov V.K., Agakhi K.A., Selezneva I.I., Nikonova Yu.A. Reaction-associated resorbable phosphate materials: production and testing in vitro. Glass & Ceramics
2013 Nov; 70(7-8): 306-310, http://dx.doi.org/10.1007/s10717-013-9568-8.
11. Selezneva I.I., Savintseva I.V., Vikhlyantseva E.F., Davydova G.A., Gavrilyuk B.K. Immobilization and long-term culture of murine embryonic stem cell in collagen-chitosan gel matrix. Kletochnye tekhnologii v biologii i meditsine 2006; 3: 135-140.
12. Twine N.A., Chen L., Pang C.N., Wilkins M.R., Kassem M.
Identification of differentiation-stage specific markers that define the ex vivo osteoblastic phenotype. Bone 2014 Oct; 67: 23-32, http://dx.doi.org/10.1016/j.bone.2014.06.027.
13. Ho N.C., Jia L., Driscoll C.C., Gutter E.M., Francomano C.A. A skeletal gene database. J Bone Miner Res 2000 Nov; 15(11): 2095-2122, http://dx.doi.org/10.1359/ jbmr.2000.15.11.2095.
14. Nud'ga L.A., Petrova V.A., Denisov V.M., Petropavlovskiy G.A. Chitosan alkylation. Zhurnal prikladnoy khimii 1991; 64(1): 229-232.
15. Xia Y., Guo T., Zhao H., Song M., Zhang B., Zhang B. A novel solid phase for selective separation of flavonoid compounds. J Sep Sci 2007 Jun; 30(9): 1300-1306, http:// dx.doi.org/10.1002/jssc.200600376.
16. Kerker J.T., Leo A.J., Sgaglione N.A. Cartilage repair: synthetics and scaffolds: basic science, surgical techniques, and clinical outcomes. Sports Med Arthrosc 2008; 16(4): 208-216, http://dx.doi.org/10.1097/JSA.0b013e31818cdbaa.
17. Tollar M., Stol M., Kliment K. Surgical suture materials coated with a layer of hydrophilic Hydron gel. J Biomed Mater Res 1969 Jun; 3(2): 305-313, http://dx.doi.org/10.1002/ jbm.820030210.
