CC BY
110
ПЕРЕСТРОЙКИ ПРОТООНКОГЕНА C-RET В КЛЕТКАХ ПАПИЛЛЯРНОГО РАКА ЩИТОВИДНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
МАНЬКОВСКАЯ С.В.*. ДЕМИДЧИК Ю.Е.**
ГУ «Институт физиологии НАН Беларуси»*, Республиканский центр опухолей щитовидной железы **
Резюме. В работе исследована частота перестроек RET/PTC в папиллярном раке щитовидной железы у взрослых. Проанализирована связь данного молекулярного события с клинико-морфологическими
характеристиками опухоли.
Ключевые слова, папиллярный рак щитовидной железы. онкогены. перестройки RET/PTC.
Abstract. In work the frequency of RET/PTC rearrangements in papillary thyroid carcinoma at adults was investigated. The analysis of the given molecular event with the clinical and morphological characteristics of thyroid cancer was carried out.
Адрес для корреспонденции:: 220013.
г.Минск. пр-т Независимости. д. 64. к. 4. Республиканский центр опухолей
щитовидной железы. тел. +375 017 2902971. -Демидчик Ю.Е.
Папиллярный рак щитовидной железы (ПРЩЖ) - самая
распространенная злокачественная опухоль эндокринной системы [1]. Результаты молекулярно-генетических исследований показали. что в карциноме этого вида с высокой частотой встречаются хромосомные перестройки. затрагивающие протоонкоген c-ret [3. 5. 7]. В итоге таких рекомбинаций возникают онкогены RET/РТС. состоящие из тирозинкиназного домена гена c-ret и 5' - части другого гена. который активно экспрессируется в тиреоцитах. Во всех случаях химерные белки способны к спонтанной димеризации и обладают конститутивной активностью тирозинкиназы. и. таким образом. вызывают нерегулируемый поток внутриклеточных сигналов выживания и пролиферации клеток [2. 7].
По данным литературы структурные мутации гена c-ret встречаются только в ПРЩЖ и не найдены в других гистологических типах тиреоидного рака. Однако в нескольких исследованиях сообщалось о наличии онкогенов RET/PTC в фолликулярной аденоме щитовидной железы. Единого мнения о роли данного молекулярного события в доброкачественных образованиях пока нет [5. 7]. Однако практически всегда высказывается предположение о присутствии в этих случаях папиллярной микрокарциномы. как источника вышеуказанной перестройки.
Известно. что белковые комплексы RET/РТС часто обнаруживаются в ПРЩЖ. который связан с радиационным излучением. Это было показано на когортах больных с папиллярной карциномой. получивших ранее терапевтического облучения в области головы и шеи по медицинским показаниям. а также среди пациентов с аналогичным заболеванием. которые проживали на территориях. загрязненных радиоактивным йодом в результате аварии на Чернобыльской АЭС. При чем. по мнению ряда авторов. структурная мутация протоонкогена c-ret - основной молекулярный механизм развития данного вида тиреоидного рака [2. 7. 10].
К настоящему моменту выявлено более десятка перестроек RET/РТС. среди которых варианты RET/РТС1 и RET/РТСЗ встречаются с наибольшей частотой [3. 5. 7].
Четкой взаимосвязи присутствия перестроек RET/РТС с клиническим поведением ПРЩЖ пока не установлено. Показано. что химерные онкогены чаще обнаруживаются в папиллярных раках у больных моложе 30 лет. чем в опухолях. развившихся у взрослых старшей возрастной группы [3. 7. 10]. При этом статистической достоверной разницы между частотой RET/РТС 1 и RET/РТСЗ и возрастом пациента не наблюдается. Однако установлено. что молекулярные изменения соответствуют определенным морфологическим фенотипам: перестройка RET/PTC3 обнаруживаются значительно чаще в ПРЩЖ с солидно-фоликуллярной архитектурой. RET/PTC1. напротив. связана с классическим сосочковым или диффузно-склеротическим вариантом. Фолликулярный вариант папиллярной карциномы характеризуется отсутствием данных хромосомных аберраций протоонкогена c-ret [10].
Результаты несколько исследований продемонстрировали связь онкогенов RET/РТС с экстратиреоидным распространением опухоли [6]. стадией заболевания [10]. ранним метастазированием в регионарные лимфоузлы шеи [10. 11] и отдаленные органы [11]. Однако эти данные не были подтверждены другими научными группами [7. 9].
В данной работе мы проанализировали частоту перестроек RET/PTC в папиллярном раке щитовидной железы у взрослых и изучили взаимосвязь данного молекулярного события с клинико-морфологическими
характеристиками заболевания.
Методы
В исследование включены пунктаты 49 пациентов (11 мужчин и 38 женщин. соотношение м:ж = 1:3.5) с ПРЩЖ. Возраст больных варьировал от 19.1 до 55.8 лет. составляя в среднем 37.2 года. Во всех случаях предоперационная аспирационная биопсия выполнялась под контролем УЗИ. Каждый образец подвергался цитологическому исследованию. а смывы из аспирационной иглы использовались для молекулярных тестов.
Всем пациентам проведено хирургическое лечение. При гистологическом исследовании удаленной опухоли ПРЩЖ был верифицирован во всех случаях. Оценка степени распространения рака щитовидной железы проводилась в соответствии с морфологической классификацией ВОЗ 2004 года [12]. На момент установления диагноза большинство больных не предъявляли жалоб и
имели солитарную опухоль до 2 см в наибольшем измерении, соответствующую категории рТ1 (п=32; 65,3%). В значительном проценте наблюдений отмечалось метастатическое поражение регионарных лимфатических узлов шеи (таблица 1). Отдаленные метастазы диагностированы только в одном случае.
Таблица 1
Основные клинические данные пациентов__________________
Признаки Класс Частоты и средние значения
1. Пол мужской женский 11 (22.4%) 38 (77.6%)
2. Возраст (лет) к началу лечения значение 19.1 - 55.8; средний -37.2
3. Локализация узла в ЩЖ левая доля правая доля перешеек 19 (38.8%) 26 (53.1%) 4 (8.1%)
4. Клинические проявления отсутствуют симптомы (+) 43 (87.8%) 6 (12.2%)
5. Наибольший размер опухоли (мм) значение 3 - 70; средний - 18.6
6. Инвазивный потенциал опухоли интратиреоидный экстратиреодный 44 (89.8%) 5 (10.2%)
7. Характер роста опухоли солитарный мультифокальный 36 (73.5%) 13 (26.5%)
8. Категория Т (ТКМ ШСС) Т1 Т2 Т3 Т4 32 (65.3%) 9 (18.4%) 6 (12.2%) 2 (4.1%)
9. Категория N (ТКМ ШСС) N0 N1 17 (34.7%) 32 (65.3%)
РНК выделена из пунктатов с помощью реагента TRIzol («Invitrogen». США) по методике производителя. Синтез кДНК проводили с использованием MuLV Reverse Transcriptase и рандомических гексамеров (все реагенты «Applied Biosystems». США) при следующих условиях: 41°С - 60 мин. 95°С - 5 мин.
Анализ онкогенов RET/PTC был произведен при помощи полимеразной цепной реакции (ПЦР) с использованием в качестве матрицы 2 мкл кДНК и пары соответствующих праймеров. Структура праймеров и температура отжига представлены в таблице 2. При этом прямые праймеры имели последовательность специфичную либо для H4 гена (в случае перестройки RET/PTC1). либо для ELE1 гена (в случае RET/PTC3). Последовательность обратного праймера в обеих реакциях была специфична к участку гена c-ret. Условия амплификации: 95°С - 10 мин. затем 40 циклов: 94°С - 30 сек. 57°С -30 сек (для RET/PTC3) или 56°С - 30 сек (для RET/PTC1). 72°С - 30 сек.
Таблица 2
Характеристика праймеров, использованных в работе___________
Праймеры Продукт ПЦР Последовательность нуклеотидов в праймере Температура отжига, 0С
PTC3 21Q F - ACCTGCCAGTGGTTATCAAGCT 57
Rinter - CTCTGCCTTTCAGATGGAA
PTC1 255 Finter - GCCTGGAGGAGCTCACCAA 56
Rinter - CTCTGCCTTTCAGATGGAA
Анализ продуктов реакции осуществляли методом горизонтального электрофореза в 1,5% агарозных блоках с последующим окрашиванием бромистым этидием. Наличие целевого продукта определяли по присутствию в геле фрагмента кДНК длиной 255 или 210 п.о., соответственно для перестройки РЕТ/РТС1 или РЕТ/РТСЗ.
Статистическую обработку данных проводили с помощью двустороннего точного теста Фишера.
Результаты
В исследованной группе структурные мутации гена е-Ш зарегистрированы в 9 (18,4%) из 49 случаев ПРЩЖ. На рисунке приведен пример электрофореграммы продуктов амплификации при скрининге хромосомных аберраций РЕТ/РТС.
А Б
Рис. Результат поиска хромосомных аберраций протоонкогена c-ret. A -перестройки RET/PTC1. Б - перестройки RET/PTC3.
Размеры маркера (M) указаны слева, С - отрицательный контроль, образец без кДНК. Амплифицированный фрагмент длинной в 255 п.о., свидетельствующий о наличии онкогенов RET/PTC1, обнаружен в образцах 4-48t, 4-48Ln и 4-7t; образец 4-32t содержал фрагмент длинной в 210 п.о.
соответствующий RET/PTC3.
Анализ клинических данных показал отсутствие взаимосвязи перестроек RET/PTC с полом, возрастом, размером и характером роста опухоли (табл.3).
Таблица 3
Частота распространения RET/PTC в ПРЩЖ у взрослых_____________
Показатель Наличие перестройки RET Количество случаев
Возраст (лет) < 30 /> 30 6/3 p=Q.Q6 18/31
Симптомы заболевания есть/нет 2/7 p=Q.3Q 6/43
Размер опухоли (мм) < 10/> 10 1/8 p=Q.14 17/32
Капсула узла есть/нет Q/9 p=Q.Q9 11/38
Мультифокальность есть/нет 2/7 p=1.QQ 13/36
Экстратиреодное распространение есть/нет 3/6 p=0,04 5/44
Стадия заболевания - Ш-1У есть/нет 2/7 p=1.QQ 12/37
Регионарные метастазы есть/нет 9/Q p=0,02 32/17
Отдаленные метастазы есть/нет 1/8 p=Q.18 1/48
Метастазы в регионарные лимфатические узлы шеи обнаружены во всех RET/PTC-положительных карциномах (p=Q.Q2; табл.3). Более того. оказалось. что образцы этих лимфоузлов содержат хромосомную перестройку идентичную той. которая была найдена в опухолевом образовании.
Установлено также. что наличие в клетках папиллярного рака перестроек гена c-ret сопровождается более агрессивным клиническим поведением -наклонностью к инвазии за пределы капсулы щитовидной железы (p=Q.Q4).
Парацентрические инверсии RET/PTCl и RET/PTC3 выявлены в 4 (8.2%) и 5 (1 Q.2%) ПРЩЖ. соответственно. При этом амплификация онкогена RET/PTCl отмечена в карциномах с преобладанием папиллярных структур. в то время как RET/PTC3 - в солидно-фолликулярных раках. Других отличий в клинико-морфологических характеристиках RET/PTCl- и RET/PTC3-положительных случаях не установлено (данные не показаны).
Обсуждение
Протоонкоген c-ret картирован в локусе 1 Qq11.2 генома человека и кодирует мембранный рецептор тирозинкиназу. В ПРЩЖ выявляется активированная форма RET. образованная вследствие хромосомных перестроек
- инверсий и транслокаций. В результате таких стуктурных мутаций
происходит замена трансмембранного и внеклеточного доменов гена c-ret на фрагменты посторонних генов и появление онкогенов, в общем случае называемых RET/PTC (PTC, от англ. Papillary Thyroid Carcinoma). При этом химерные белки, обладающие тирозинкиназной активностью, в большом количестве накапливаются в цитоплазме, что в конечном итоге приводит к постоянной стимуляции сигнального каскада Ras/Raf/MEK/MAPK [2, 7].
Среди известных в настоящее время различных вариантов перестроек вышеуказанного гена наиболее распространены RET/PTC1 и RET/PTC3. Оба нарушения характеризуются разрывом двойной спирали ДНК с последующей репарацией путем внутрихромосомной сбалансированной парацентрической инверсией длинного плеча хромосомы 10 и ошибочной рекомбинацией ДНК. При RET/PTC1 внутриклеточный домен гена c-ret сливается с геном H4, локализованном в локусе 10q21. Биологическая функция белка H4 не установлена, но предполагается, что он является компонентом цитоскелета клетки. В онкогене RET/PTC3 обнаружено слияние с геном ELE1 (коактиватор транскрипции андрогенного рецептора), который располагается в районе 10q11.2 [3, 5, 7].
По данным литературы, частота перестроек RET/PTC в ПРЩЖ варьирует в пределах 0-60% в спорадических и от 29 до 86% - в индуцированных радиацией случаях [3, 5, 7, 10]. Подобный разброс может быть отчасти связан с неоднородностью исследованных групп по полу, месту проживания, гистологическому варианту опухолей, этническому составу, а также, с чувствительностью молекулярно-генетических методик, использованных в различных лабораториях. Вместе с тем, установлено, что ионизирующее излучение и ранний возраст пациентов считаются независимыми факторами риска, повышающими частоту образования активированной формы RET [7, 10].
Хотелось бы обратить внимание на тот факт, в спорадическом ПРЩЖ превалируют онкогены RET/PTC1 [3, 5]. В радиогенных карциномах характер мутации зависит от типа радиационного воздействия. Так внутреннее облучение тиреоцитов за счет радиоизотопов йода (постчернобыльские опухоли) способствует образованию онкогенов RET/PTC3, в то время как прочие факторы - внешнее облучение и таковые, природа которых до сих пор не выяснена, приводят к преимущественному возникновению RET/PTC1 [2, 7, 10]. Заметим также, что большинство редких структурных мутаций гена RET было выявлено именно в тиреоидном раке у детей из Беларуси и у больных, получивших ранее лучевую терапию по медицинским показаниям [7].
В нашей работе перестройки протоонкогена c-ret зарегистрированы в 9 (18,4%) из 49 случаев папиллярной тиреоидной карциномы у взрослых, при чем варианты RET/PTC1 и RET/PTC3 найдены в 4 (8,2%) и в 5 (10,2%) образцах, соответственно.
Из таблицы 3 видно, что частота мутации RET/PTC имела тенденцию к снижению с увеличением возраста пациентов, однако статистическая достоверность не была достигнута (p=0,06). Тем не менее, полученные результаты согласуются с ранее опубликованными данными, свидетельствующими о том, что химерные белки преимущественно
обнаруживаются в группе больных молодого возраста. В этой связи уместно упомянуть о значительной доле перестроек RET/PTC в ПРЩЖ у детей и подростков, подвергшихся облучению во время Чернобыльской аварии [7, 10]. Предполагается, что такая закономерность распространения данного генетического нарушения отражает различия в биологических особенностях развития опухолевого процесса в разных возрастных группах.
Заметим, что по некоторым сведениям онкогены RET/PTC в большом количестве случаев (42 - 77%) выявляются при папиллярной микрокарциноме щитовидной железы [4, 7]. По мнению авторов, такой вид структурных мутаций может быть ранним событием в молекулярном патогенезе ПРЩЖ. В нашем исследовании из 17 (34,7%) опухолей с размером меньше 10 мм только в 1 (2,0%) образце найдена хромосомная аберрация протоонкогена c-ret, что не позволяет нам сделать аналогичное заключение.
По данным литературы метастазы в регионарные лимфатические узлы шеи были частой находкой в папиллярных раках, имеющих перестройки RET/PTC. В изученной группе установлена связь между вышеуказанным молекулярным событием и метастатическим поражением лимфоузлов. Отдельно отметим, что у пациента с метастазами в легкие была зарегистрирована мутация RET/PTC3.
Существуют наблюдения относительно различий гистологических характеристик ПРЩЖ в зависимости от присутствия конкретного типа активированной формы белка RET [7, 8, 10]. Действительно, выявленные нами онкогены RET/PTC1 обнаружены в одном случае диффузно-склерозирующего варианта папиллярного рака и в трех опухолях преимущественно папиллярного строения, а перестройки RET/PTC3 - в одном образце высококлеточного варианта и в четырех карциномах с преобладанием солидно-фолликулярных компонентов. Полагают, что такие морфологические особенности опухолевой ткани связаны со структурой партнерского полипептида, входящего в состав химерного комплекса RET/PTC. В модельных экспериментах на культуре клеток было показано, что мутация RET/PTC3 имеет более сильный митогенный потенциал, чем RET/PTC1 [8]. В ряде публикаций продемонстрировано, что RET/PTC3-положительные новообразования характеризуются более агрессивным течением, например, экстратиреоидным распространением, быстрым ростом и частым метастазированием [6, 7, 10]. За исключением гистологических особенностей ПРЩЖ, сравнительный анализ, проведенный в данной работе, не выявил других клинико-морфологических различий между опухолями, несущими перестройки RET/PTC1 и RET/PTC3. Более того, во всех трех RET/PTC-положительные случаях с инвазией капсулы щитовидной железы выявлен онкопротеин RET/PTC1. На наш взгляд, для более определенного заключения о роли этих молекулярных нарушений в течение ПРЩЖ требуется обобщение результатов исследований большого количества однородных по гистологическому строению карцином данной локализации. При этом анализ полученного экспериментального материала не только позволит расширить существующее представление о механизмах трансформации тиреоцитов в злокачественные клетки, но и сможет найти
адекватное применение в практической медицине - в разработке новых дополнительных критериев диагностики папиллярного рака и индивидуализации лечения.
Заключение
1. В исследованной серии ПРЩЖ у взрослых частота перестроек протоонкогена c-ret не превышала 20% с одинаковой распространенностью вариантов RET/PTC1 и RET/PTC3.
2. RET/PTC-положительные новообразования характеризуются
эктратиреоидным распространением и повышенной частотой метастатического поражения регионарных лимфатических узлов шеи. Такая особенность данного вида карциномы требует проведения тотальной тиреоидэктомии с обязательной шейной лимфодиссекцией, даже в случаях с непальпируемыми или плохо визуализированными лимфоузлами.
3. Установлено отсутствие взаимосвязи структурных мутаций RET/PTC с полом, возрастом, размером, стадией заболевания и характером роста опухоли.
Литература
1. Валдина, Е. А. Заболевания щитовидной железы / Е. А. Валдина. -СПб.: Питер, 2006. - 368 с.
2. High prevalence of activating ret proto-oncogene rearrangements in thyroid tumors from patients who had received external radiation / A. Bounacer [et al.] // Oncogene. - 1997. - Vol. 15. - P. 1263-1273.
3. Prevalence and distribution of ret/ptc 1, 2 and 3 in papillary thyroid carcinoma in New Caledonia and Australia / E. L. Chua [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 2000. - Vol. 85. - P. 2733-2739.
4. Frequent RET rearrangements in thyroid papillary microcarcinoma detected by interphase fluorescence in situ hybridization / R. Corvi [et al.] // Lab. Invest. - 2001. - Vol. 81. - P. 1639-1645.
5. Lam, K. Y. High prevalence of RET proto-oncogene activation (RET/PTC) in papillary thyroid carcinomas / K. Y. Lam, C. Y. Lo, P. S. Leung // Eur. J. Endocrinol. - 2002. - Vol. 147. - P. 741-745.
6. RET/PTC may be associated with local invasion of thyroid papillary carcinoma / H Miki [et al.] // J. Surg. Oncol. - 1999. - Vol. 71. - P.76-82.
7. Nikiforov, Y. E. The molecular pathways induced by radiation and leading to thyroid carcinogenesis / Y. E. Nikiforov// Cancer Treat. Res. - 2004. - Vol. 122. - P. 191-206.
8. The RET/PTC3 oncogene: metastatic solid-type papillary carcinomas in murine thyroids / D. J. Powell [et al.] // Cancer Res. - 1998. - Vol. 58. - P. 55235528.
9. RET/PTC activation does not influence clinical and pathological features of adult papillary thyroid carcinomas / E. Puxeddu [et al.] // Eur. J. Endocrin. - 2003.
- Vol. - 148. - P. 505-513.
10. Pattern of radiation-induced RET and NTRK1 rearrangements in 191 post-Chernobyl papillary thyroid carcinomas: biological. phenotypic and clinical implication / H. M Rabes [et al.] // Clin. Cancer Res. - 2000. - Vol. 6. - P.1093-1103.
11. Distinct multiple RET/PTC gene rearrangements in multifocal papillary thyroid neoplasia / S. L. Sugg [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab. - 1998. - Vol. 83.
- P. 4116-4122.
12. WHO Classification of Tumors. Pathology and Genetics of Tumors of Endocrine Organs / eds. R. A. DeLellis, P. U. Hetz. C. Eng. - Lyon: IARC Press. -2004.
