CC BY
53
ИННОВАЦИИ № 6 (116), 2008
Пептидная наностратегия
новое направление в молекулярной эндокринологии
А. О. Шпаков,
д. биол. н., ведущий научный сотрудник
М. Н. Перцева,
д. биол. н., профессор, зав. Лабораторией молекулярной эндокринологии, заслуженный деятель науки РФ
Институт эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова Российской академии наук, Санкт-Петербург
В статье обсуждается новое, динамично развивающееся, направление в молекулярной эндокринологии — пептидная наностратегия, в основе которой лежит синтез, изучение и внедрение в клиническую практику сравнительно коротких пептидов, соответствующих функционально важным участкам сигнальных белков. Рассмотрены преимущества пептидной наностратегии перед другими подходами, используемыми в молекулярной эндокринологии, перспективы ее применения для решения таких актуальных проблем фундаментальной биологии и практической медицины, как создание высоко селективных негормональных регуляторов клеточных процессов, направленно воздействующих на компоненты гормональных сигнальных систем, и нанодиагностика нарушений в этих системах при гормонозависимых заболеваниях. На основе анализа результатов, полученных авторами и их зарубежными коллегами, представлены достижения пептидной наностратегии и намечены пути дальнейшего ее развития.
In this paper, we discuss peptide nanostrategy - a new direction currently developing in molecular endocrinology. This strategy is based on the synthesis, study, and clinical implementation of relatively short synthetic peptides corresponding to functionally important sites of signaling proteins. The advantages of peptide nanostrategy over the other approaches used in molecular endocrinology are considered. Possible applications of this strategy for solving some urgent problems in fundamental biology and medicine are discussed. The list of these problems includes the creation of highly selective nonhormonal regulators of cell processes addressed to the components of hormonal signaling systems, and the nanodiagnostic of their impairments due to endocrine diseases.
Based on our results and literature data, the achievements of peptide nanostrategy are described, and directions of it’s further development are outlined.
Истоки и перспективы развития пептидной наностратегии
Большинство процессов в организме человека и животных регулируются с помощью высоко специфичных химических сигналов — гормонов, которые секретируются эндокринными железами. Гормоны связываются с расположенными на поверхности клеток рецепторами и через них запускают сложно организованную сеть внутриклеточных сигнальных каскадов. Результатом действия гормонов являются изменения метаболизма, роста, дифференцирования и других жизненно важных клеточных процессов. Имеются многочисленные данные в пользу того, что нарушение гормональной сигнализации приводит к тяжелым эндокринным патологиям, образованию злокачественных опухолей, развитию широкого спектра заболеваний нервной, сердечно-сосудистой и репродуктивной систем. В связи с этим, изучение молекулярных механизмов действия гормонов и структурно-функциональной организации информационных систем, через которые осуществляется передача гормональных сигналов в клетку, является одним из ма-
гистральных направлений современной фундаментальной биологии и практической медицины. На протяжении последних тридцати лет сформировалась самостоятельная, динамично развивающаяся наука — молекулярная эндокринология, главными задачами которой являются расшифровка сложнейших молекулярных ансамблей, обеспечивающих гормональную чувствительность отдельной клетки и организма в целом, и применение полученных знаний для диагностики и лечения гормонозависимых заболеваний.
Многие десятилетия гормоны природного происхождения и их синтетические аналоги широко применяются в медицине. Однако это сопряжено со многими проблемами, главной причиной которых является широкий спектр действия большинства гормонов. Наряду с требуемым полезным действием, они вызывают множество побочных эффектов, поскольку действуют на ткани и физиологические процессы, которые не являются мишенями гормональной терапии. В результате возникают тяжелые осложнения, зачастую более опасные, чем само заболевание. Причина столь драматичных последствий применения гормональной терапии состоит в том, что гормонов в
организме меньше ста, а рецепторов свыше тысячи. Другими словами, один гормон обычно связывается сразу с несколькими типами рецепторов, через которые активируются различные сигнальные пути, что, в конечном итоге, приводит к совершенно разным, зачастую противоположным, биологическим эффектам. Без разработки методологии адресной активации сигнальных путей невозможно регулировать отдельно взятые биохимические процессы в клетке, а значит, и направленно лечить больных. На рубеже ХХ-ХХ1 вв. появилось и интенсивно развивается новое, нанобиотехнологическое, направление в молекулярной эндокринологии — пептидная стратегия. Ее применение и внедрение позволяет с высокой селективностью, используя принцип «точечных» воздействий, контролировать активность вполне определенной информационной системы или отдельных ее блоков, не затрагивая другие, функционально сходные с ней, системы. Пептидная наностратегия впитала в себя самые передовые достижения современной био-органической химии, биохимии и молекулярной биологии. Каковы ее основные принципы и в чем ее преимущества перед другими направлениями?
Каждая информационная система состоит из нескольких блоков, представляющих собой сигнальные белки, структурно и функционально связанные между собой. Большинство чувствительных к гормонам сигнальных систем включает три блока. Первый из них — рецептор (сенсор), семь раз пронизывающий клеточную мембрану, который специфически опознает поступающий извне гормональный сигнал. Второй — G-белок (трансдуктор), преобразующий входящий сигнал в форму, удобную для дальнейшей его переработки. Третий блок — усилитель сигнала, представленный либо ферментом-генератором вторичных посредников, либо ионным каналом, который в сотни и тысячи раз повышает интенсивность первоначального сигнала и обеспечивает, таким образом, адекватный ответ клетки на действие гормона.
Участки сигнальных белков, ответственные за их взаимодействие, а, следовательно, и за передачу гормонального сигнала, сравнительно небольшие. В начале 1990-х годов было показано, что синтетические пептиды, структурно соответствующие этим участкам, могут функционально заменять значительные по размеру молекулы сигнальных белков и сами, в отсутствие гормона, запускать сигнальный каскад на более поздних, пострецепторных, этапах передачи сигнала. Так родилась пептидная наностратегия. Ее основными задачами являются разработка и синтез пептидов, соответствующих функционально важным участкам сигнальных белков, и дальнейшее применение этих пептидов в фундаментальной биологии в качестве функциональных зондов для изучения процессов передачи гормонального сигнала и в практической медицине, как новое поколение высоко селективных и высоко эффективных негормональных регуляторов сигнальных систем.
Основным преимуществом пептидной стратегии перед молекулярно-биологическими и иммунохими-ческими подходами, которые широко применяются для изучения гормональных сигнальных систем, яв-
ляется ее практическая направленность и легкость внедрения синтетических пептидов в клиническую практику и диагностику. Длина пептидов, соответствующих участкам сигнальных белков, не превышает 20-25 аминокислотных остатков, что делает их синтез экономически выгодным и позволяет нарабатывать пептиды в количествах, достаточных для их практического использования. Структуру пептидов можно модифицировать, что дает возможность направленно менять эффективность и селективность их действия, создавать на их основе принципиально новые вещества и композиты с заданными свойствами. Модификация пептидов гидрофобными радикалами или включение их в мембраноактивные нанокомплексы обеспечивает транспорт пептидов в клетку непосредственно к белкам-мишеням. Введение в молекулы пептидов фотоаффинных и радиоактивных меток позволяет создать высоко чувствительные биосенсоры, которые могут быть использованы для нанодиагностики и нанодетекции. Синтетические пептиды, производные структуры сигнальных белков, незаменимы в случаях, когда один и тот же гормон запускает разные сигнальные каскады, или когда один и тот же сигнальный белок с помощью различных участков своей структуры взаимодействует с несколькими партнерами, различающимися по своим функциям в клетке.
Практические результаты разработки и применения пептидной наностратегии
Теперь остановимся на некоторых практических результатах разработки и применения пептидной наностратегии, полученных как российскими, так и зарубежными коллегами. Исследования, посвященные развитию пептидной наностратегии, ведутся в десятках лабораторий мира на протяжении последних пятнадцати лет. В 2001 г. в эту работу включалась и Лаборатория молекулярной эндокринологии Института эволюционной физиологии и биохимии им. И. М. Сеченова РАН (зав. Лабораторией, д. б. н., проф. М. Н. Перцева). Работа ведется в тесном контакте с Лабораторией биологически активных полимеров Института высокомолекулярных соединений РАН (зав. Лабораторией, д. х. н., проф. Г. П. Власов), в которой осуществляется синтез пептидов. Результаты проводимых исследований подробно изложены в 20 научных статьях (www.ncbi.nlm.nih.gov) и обобщены в двух обзорах, опубликованных в престижном издании «Signal Transduction Research Trends» [1] и в «Журнале эволюционной биохимии и физиологии» [2].
Одним из магистральных направлений пептидной наностратегии применительно к сигнальным системам является синтез и изучение пептидов, которые соответствуют участкам рецепторов, взаимодействующим с G-белками. Эти пептиды действуют подобно гормонам, но в отличие от них активируют только тот сигнальный путь, который начинается с рецептора, от которого они произошли. Поэтому их действие высоко селективно. Так, например, пептид, соответствующий участку серотонинового рецептора 1А-типа, запускает сигнальный путь, который регулируется исключительно этим рецептором, и не затрагивает сигналь-
ИННОВАЦИИ № 6 (116), 2008
ИННОВАЦИИ № 6 (116), 2008
Активность фермента аденилатциклазы, %
240
80 т-----------1-----------1-----------1--
0 1 10 100
Концентрация ЬСИТ-пептида, мкмоль/л
Рис. 1. Стимуляция LGR7-пептидом активности аденилатциклазы в миокарде крысы в отсутствие гормона
ные пути, контролируемые другими серотониновыми рецепторами (а их 15 типов!) [3]. В то же время сам гормон серотонин или его синтетические аналоги, которые часто применяются в качестве лекарственных препаратов, могут активировать сразу несколько серотонино-вых рецепторов, в связи с чем их биологические эффекты не всегда непредсказуемы.
В настоящее время на основе рецепторов разработаны пептиды, которые регулируют артериальное давление, снижают скорость сердечных сокращений, способствуют восстановлению сосудов, обладают мочегонным действием [4, 5]. Пептиды регулируют только те физиологические процессы, контроль которых осуществляется через рецепторы, производными которых они являются. Исследования на животных не выявили у них побочных эффектов. К тому же, выполнив свою функцию, они быстро разрушаются в организме.
Авторами статьи в одном из рецепторов полипеп-тидного гормона релаксина (LGR7-рецепторе), который играет важную роль в регуляции многих физиологических процессов в организме человека и является одним из наиболее перспективных лекарствен-
Стимулирующий аденилатциклазу эффект релаксина, %
т т
І I без ЬС117-пептида
І I в присутствии пептида в миокарде
І I в присутствии пептида в скелетных мышцах
Рис. 2. Ингибирование LGR7-пептидом стимуляции аденилатциклазы релаксином в миокарде, где гормон действует через LGR7-рецептор, и неэффективность пептида в скелетных мышцах, где релаксин связывается с другим рецептором
ных препаратов для лечения заболеваний репродуктивной, сердечно-сосудистой и нервной систем, обнаружен участок, отвечающий за его взаимодействие с G-белком. Соответствующие ему пептиды в отсутствие гормона активируют сигнальные пути, которые запускаются LGR7-рецептором [6, 7] (рис. 1). Кроме того, LGR7-пептиды селективно блокируют стимуляцию этих сигнальных путей релаксином, причем на эффекты гормона, в которых LGR7-рецептор не участвует, наши пептиды не влияют (рис. 2). Таким образом, создан молекулярный инструмент для эффективного контроля над сигнальными путями, включающими LGR7-рецептор. В перспективе это позволит создать на основе LGR7-пептидов высоко селективные препараты для регуляции этих путей и зависимых от них клеточных процессов. В настоящее время в Лаборатории приступили к созданию таких же селективных пептидов для серотониновых рецепторов, что очень важно для разработки лекарств, направленных на лечение шизофрении, болезни Альцгеймера, мигрени, депрессии.
Рис. 3. Селективное снижение стимулирующего эффекта изопротеренола С-концевым пептидом, производным а-субъединицы G-белка стимулирующего типа (а), и ослабление ингибирующего эффекта соматостатина С-концевым пептидом, производным a-субъединицы G-белка ингибирующего типа (б)
Наряду с пептидами, производными рецепторов, создаются и пептиды, производные G-белков. В качестве примера приведем данные в отношении синтезированных нами пептидов, соответствующих С-концевым участкам а-субъединиц G-белков стимулирующего и ингибирующего типов. Обнаружено, что С-концевые пептиды эффективно блокируют передачу гормонального сигнала через тот тип G-белка, производным которого они являются. Так С-конце-вой пептид G-белка стимулирующего типа блокирует передачу стимулирующего гормонального сигнала к ферменту аденилатциклазе, которая осуществляется через этот G-белок, но не влияет на эффекты гормонов, в которых участвуют другие типы G-белков. В свою очередь, С-концевой пептид G-белка ингибирующего типа ослабляет передачу только ингибирующего гормонального сигнала [8, 9] (рис. 3).
Имеются многочисленные примеры разработки пептидов, являющихся производными ферментов-генераторов вторичных посредников и ионных каналов, которые влияют на их активность. Однако по своему практическому значению они пока уступают пептидам, производным рецепторов и G-белков.
Перспективы и проблемы
Несмотря на значительные достижения пептидной наностратегии, ее развитие находится на том этапе, когда еще не выработана единая концепция, позволяющая создавать конечный продукт — синтетические пептиды, которые можно широко применять в клинической практике для лечения или коррекции гормонозависимых заболеваний. Все работы в основном ограничиваются стенами лабораторий и экспериментальными животными.
Что мешает практическому внедрению пептидов? Основная проблема состоит в том, что мало кто целенаправленно занимается разработкой подходов для создания на их основе лекарственных форм. Для этого необходимо преодолеть некоторые трудности, которые находятся в фокусе нашего внимания. Синтетические пептиды должны легко проникать в клетку и концентрироваться в зоне их взаимодействия с белками-мишенями. В этом плане большие надежды возлагаются на модификацию пептидов гидрофобными радикалами, что было продемонстрировано как нами, так и другими авторами [6, 7, 10]. Для обеспечения транспорта пептидов через мембрану к ним могут быть присоединены мембраноактивные поликатионные пептидные фрагменты, образующие спиральные или разветвленные структуры [11]. Перспективным подходом является разработка нанокомплексов, способных связывать и транспортировать пептиды, что позволит обеспечить их адресную доставку к тканям-мишеням. Имеются и другие пути модификации пептидов, позволяющие повысить их биологическую активность, например, замены отдельных аминокислот для придания пептидам устойчивости к протеолитическому расщеплению или конструирование на их основе циклических структур.
Многообещающим направлением является применение пептидов, производных рецепторов и G-белков, в качестве диагностических зондов для выявле-
ния нарушений в гормональных сигнальных системах при гормонозависимых заболеваниях, что необходимо для дифференциальной диагностики и лечения. В пользу эффективности применения пептидов для нанодиагностики и нанодетекции свидетельствуют наши данные по идентификации нарушений в функционировании гормональных сигнальных систем в условиях сахарного диабета, приобретающего в мире эпидемический характер [12].
В настоящее время ученые во многих странах мира в полной мере осознают важность и уникальность пептидной наностратегии не только для изучения гормональных сигнальных систем в пробирке, но и для нужд практической медицины. Наша задача заключается в том, чтобы активно развивать это приоритетное нанобиотехнологическое направление в нашей стране, ориентируясь на создание продуктов мирового уровня.
Литература
1. A. O. Shpakov, M. N. Pertseva. The peptide strategy as a novel approach to the study of G protein-coupled signaling systems// In «Signal Transduction Research Trends» (Ed. N.O. Grachevsky). N. Y.: Nova Science Publishers, Inc. 2007.
2. А. О. Шпаков, М. Н. Перцева. Использование пептидной стратегии для изучения молекулярных механизмов передачи гормонального сигнала в клетку// «Журнал эволюционной биохимии и физиологии», т. 41, № 5, 2005.
3. Q. Q. Sun, N. Dale. G-proteins are involved in 5-HT receptor-mediated modulation of N- and P/Q- but not T-type Ca2+ channels//J. Neurosci, V. 19, 1999.
4. S. R. George, G. Y. Ng, S. P. Lee, T. Fan, G. Varghese, C. Wang, C. M. Deber, P. Seeman, B. F. O’Dowd. Blockade of G protein-coupled receptors and the dopamine transporter by a transmembrane domain peptide: novel strategy for functional inhibition of membrane proteins in vivo//J. Pharmacol. Exp. Ther, V. 307, 2003.
5. T. Light, L. Tsirulnikov, H. Reuveni, T. Yarnitzky, S. A. Ben-Sasson. Induction of pro-angiogenic signaling by a synthetic peptide derived from the second intracellular loop of S1P3 (EDG3)// Blood, V. 102, 2003.
6. А. О. Шпаков, М. Н. Перцева, И. А. Гурьянов, Г. П. Власов. Влияние пептидов, производных третьей цитоплазматической петли релаксинового рецептора 1 типа, на стимуляцию релаксином GTP-связывающей активности G-белков//Биол. мембраны, т. 22, № 6, 2005.
7. A. O. Shpakov, I. A. Gur’yanov, L. A. Kuznetsova, S. A. Plesneva, E.
A. Shpakova, G. P. Vlasov, M. N. Pertseva. Studies of the molecular mechanisms of action of relaxin on the adenylyl cyclase signaling system using synthetic peptides derived from the LGR7 relaxin receptor//Neurosci. Behav. Physiol, V. 37, № 7, 2007.
8. А. О. Шпаков, И. А. Гурьянов, Л. А. Кузнецова, С. А. Плеснева,
B. И. Корольков, М. Н. Перцева, Г. П. Власов. Использование С-концевых пептидов a-субъединиц G-белков для исследования их функционального сопряжения с рецепторами биогенных аминов в тканях крыс и моллюсков//Биол. мембраны, т. 21, № 6, 2004.
9. A. O. Shpakov, V. N. Shipilov, V. M. Bondareva. Sensitivity of adenylyl cyclase signaling system of the mollusk A. cygnea ganglions to serotonin and adrenergic agonists//Ann. N.Y. Acad. Sci. V. 1040, 2005.
10. L. Covic, A. L. GresserJ. Talavera, S. Swift, A. Kuliopulos. Activation and inhibition of G protein-coupled receptors by cell-penetrating membrane-tethered peptides//Proc. Natl. Acad. Sci. USA. V. 99, 2002.
11. А. О. Шпаков, И. А. Гурьянов, Г. П. Власов, М. Н. Перцева. Молекулярные механизмы взаимодействия поликатионных пептидов с рецепторами серпантинного типа и гетеротримерны-ми G-белками в тканях крыс//«Журнал эволюционной биохимии и физиологии», т. 42, № 4, 2006.
12. А. О. Шпаков, Л. А. Кузнецова, С. А. Плеснева, И. А. Гурьянов, Г. П. Власов, М. Н. Перцева. Идентификация нарушений в гормоночувствительной аденилатциклазной системе в тканях крыс с диабетом 1-го и 2-го типов с использованием функциональных зондов и синтетических наноразмерных пептидов// Технологии живых систем, т. 4. № 5-6, 2007.
ИННОВАЦИИ № 6 (116), 2008
