CC BY
69
© ШКУРУПИЙ В. А., НАДЕЕВ А. П., ПРИСТАВКА А. А., ТРАВИН М. А.
УДК 616.61 - 616-002.7
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКИЕ ИЗМЕНЕНИЯ ПОЧЕК ПРИ СИСТЕМНОМ КАНДИДОЗЕ У МЫШЕЙ ОППОЗИТНЫХ ЛИНИЙ И ПРИ ЛЕЧЕНИИ КОМПОЗИЦИЕЙ АМФОТЕРИЦИНА В С ОКИСЛЕННЫМ ДЕК-
СТРАНОМ
В.А. Шкурупий, А. П. Надеев, А. А. Приставка, М. А. Травин Новосибирский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.О. Маринкин; Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, директор - акад. РАМН В. А. Шкурупий.
Резюме. При лечении системного кандидоза композицией амфотерицина В с окисленным декстраном (КАД) его терапевтическая эффективность была существенно выше, чем амфотерицина В (АмВ) вне композиции, о чем судили по более раннему и динамичному уменьшению количества кандидозных гранулем в почках. КАД в большей степени снижал нефротоксические эффекты C. albicans и стимулировал репаративные процессы в почке, чем АмВ. Принадлежность к одной из оппозитных линий мышей (СВА и С57В1/6) была сопряжена с различиями между ними по степени морфологических проявлений гранулема-тоза в почках и выраженности репаративных процессов.
Ключевые слова: кандидозный гранулематоз, почки, композиция амфотерицина В с окисленным декстраном, межлинейные различия.
Надеев Александр Петрович - д.м.н., проф. каф. патологической анатомии НГМУ; e-mail: nadeevngma@mail.ru.
Шкурупий Вячеслав Алексеевич - акад. СО РАМН, зав. каф. патологической анатомии НГМУ, директор научного центра клинической и экспериментальной медицины, г. Новосибирск; e-mail: sck@soramn.ru.
Приставка Анатолий Анатольевич - старший преподаватель каф. фармацевтической химии НГМУ; тел.: 8(383) 2269811.
В клинической практике для лечения системного кандидоза используют достаточно эффективный антибиотик полиенового ряда - амфотерицин В (АмВ), позволяющий снизить смертность больных в несколько раз [4, 5, 14]. Показано, что АмВ присущи токсические свойства даже при использовании терапевтических доз, что проявляется выраженной гепато- и нефротоксичностью [4, 5, 14], масштабы которых в значительной степени, по-видимому, могут быть генетически обусловлены [7]. Ранее показано, что композиция амфотерицин В с окисленным декстраном (КАД) с лизосомотропными свойствами проявляет высокую терапевтическую активность в лимфатических узлах, печени и легких у мышей с системным кандидозом, обладает способностью уменьшать деструктивные процессы в этих органах [10, 12].
Целью работы являлось исследование терапевтической эффективности, неф-ротоксичности композиции амфотерицина В с окисленным декстраном, а также репаративной регенерации в паренхиме почек при системном кандидозе на мышах оппозитных по ряду биологических характеристик линий CBA и C57B1/6.
Материалы и методы
Работа выполнена на 100 мышах-самцах линии СВА и С57В1/6 двухмесячного возраста, массой 20-22 г., различающихся по ряду генетически обусловленных параметров организма [13] и являющихся оппозитными по реагированию на воздействия различных инфекционных агентов [2, 3, 7]. Животных получали из питомника Института цитологии и генетики СО РАН (Новосибирск). Мыши каждой линии были разделены на 5 групп, в каждой группе по 10 особей. Животным 1-х групп однократно вводили суточную культуру С. albicans в дозе 2,5 х109 микробных тел на животное в объеме 0,2 мл изотонического водного раствора NaCl, интраперитонеально [6]. Животным 2-х групп че-
рез сутки после инфицирования С. albicans вводили препарат АмВ, интрапери-тонеально, в дозе 250 ЕД/кг массы тела в 0,2 мл 5% раствора глюкозы. Животным 3-х групп через сутки после инфицирования С. albicans вводили КАД, ин-траперитонеально, в дозе 250 ЕД/кг массы тела в 0,2 мл окисленного декстрана. Животные 4-х групп были представлены только одной линией - СВА, которым через сутки после инфицирования С. albicans вводили 0,2 мл окисленного дек-страна, интраперитонеально. Курс введения АмВ, КАД и окисленного декстрана составил 10 инъекций в режиме «через день». Интактные животные каждой из линий составили 5-е группы. КАД был синтезирован в Институте ядерной физики СО РАН ( Новосибирск) методом радиационного окисления декстрана с молекулярной массой 30-40 кДа и последующего его смешивания с амфотери-цином В.
Объектом исследования служили почки. Органы от мышей получали на 10, 28, 56 сут после инфицирования животных, которых выводили из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе под эфирным наркозом. Образцы органов фиксировали в 10% нейтральном формалине, обезвоживали в спиртах, заливали в парафин. Гистологические срезы толщиной 3-5 мкм окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом [1]. Подсчитывали численную
5 2
плотность (Nai) гранулем в ткани почек в тестовой площади 1,56*10 мкм [2, 8] и объемную плотность (Vv) деструктивно измененных клеток в паренхиме почек (очаги микронекрозов и зон с дистрофическими изменениями эпителиоци-тов канальцев), соотношение объемных плотностей (Vv) очагов микронекрозов и дистрофически измененных гепатоцитов в начале и по завершению эксперимента. Вероятность достоверности различий сравниваемых средних величин определяли на основании критерия Стьюдента. Различия между средними величинами считали достоверными при р<0,05.
Результаты и обсуждение
При гистологическом исследовании кандидозное воспаление у мышей обеих линий проявлялось образованием макрофагально-эпителиоидноклеточных гранулем и макрофагальных инфильтратов в печени, легких, региональных лим-
фоузлах, почках, то есть кандидоз носил системный характер. При гистологическом исследовании почек мышей обеих линий 1-х групп во все периоды наблюдения обнаруживали: выраженное полнокровие клубочков, эпителиоциты проксимальных и дистальных канальцев были в состоянии средне-, крупновакуольной дистрофии, выявляли очаговые микронекрозы эпителиоцитов, отек интерстиция, десквамацию щеточной каемки эпителиоцитов проксимальных канальцев; у мышей линии СВА наблюдали эпителиоидноклеточные и макро-фагальные гранулемы и инфильтраты в интерстиции, а у мышей линии С57В1/6 они встречались в единичных количествах. В почках мышей линии СВА 2-й группы на 28 и 56 сутки наблюдения макрофагальные и эпителиоидноклеточные гранулемы были единичными, у мышей линии С57В1/6 они отсутствовали. В почках мышей обеих линий 3-х групп (леченные КАД) во все периоды наблюдения отмечали неравномерное полнокровие клубочков, эпителиоциты канальцев были в состоянии мелковакуольной дистрофии, очаговые микронекрозы эпителиоцитов. При этом у мышей линии СВА обнаруживали единичные макрофагальные инфильтраты, тогда как у мышей линии С57В1/6 их не выявляли.
В почках у мышей линии СВА в 3-й группе (леченных КАД) численная плотность гранулем на 10 сутки после инфицирования (рис. 1) была меньшей, в сравнении с величиной аналогичного показателя в 1-й группе в 3 раза; численная плотность гранулем в почках во 2-й группе животных (леченных АмВ) этой линии была на 50% большей, чем у леченных КАД (3-я группа). Численная плотность гранулем у мышей 4-й группы (леченные окисленным декстраном) соответствовала величине аналогичного показателя у мышей 3-й (леченные КАД) группы, что свидетельствовало о самостоятельном антимикотическиом эффекте окисленного декстрана. Поскольку у мышей линии С57В1/6 макрофа-гальных гранулем и инфильтратов даже у нелеченных мышей (1-я группа) было мало, метод морфометрии как статистический не использовали. Однако, ранее было показано, что у мышей линии С57В1/6 в печени кандидозные гранулемы обнаруживали в достаточном количестве, но при «спонтанном» развитии кан-
дидозного гранулематоза их количество к 56 суткам наблюдения уменьшалась в 2 раза, в сравнении с величиной этого показателя на 10-е сутки после инфицирования [12].
Таким образом, при системном кандидозе гранулематозное воспаление в почках существенно менее выражено, чем в иных органах [10, 12], видимо, в связи с относительно малой концентрацией в них резидентных макрофагов -центров гранулемообразования. Известно, что в разных органах концентрация резидентных макрофагов существенно различается, и она является максимальной в печени. Вероятно, что при интраперитонеальном введении С. albicans возбудитель эффективно захватывался резидентными макрофагами печени и легких, чем почек, что, видимо, определило в последних незначительное количество центров гранулемообразования в виде макрофагов, захвативших грибы.
Объем деструктивных изменений (состояния дистрофии и некроза) и их динамика в эпителиоцитах проксимальных и дистальных канальцев в почках у мышей обеих линий в различные периоды наблюдения и при использовании обоих средств (КАД и АмВ), при сравнении их по соответствующим группам в основном были сходными (табл. 1): при применении КАД масштабы деструктивных изменений эпителиоцитов канальцев были существенно меньшими, начиная с 10 суток после инфицирования, в сравнении с величинами аналогичных показателей мышей 1-й, 2-й и 4-й групп. Полученные данные указывают на чрезвычайную токсичность метаболитов грибов С. albicans, а также на то, что их токсические эффекты, проявляющиеся деструктивными процессами в различных органах [10, 12], не сопряжены с наличием гранулем и их количеством в органе, а, по-видимому, опосредованы продуктами метаболизма грибов, проявляясь, в частности модуляцией процессов стероидгенеза [12]. Эти данные также подтверждаются тем, что объем деструктивных процессов у животных обеих линий, леченных АмВ, не только не увеличился ни в одном из периодов наблюдений, но и был несколько меньшим (табл.1).
Ранее было показано [11], что в динамике развития БЦЖ-гранулематоза, в шестимесячном эксперименте, уменьшение количества дистрофически изме-
ненных гепатоцитов не сопровождалось увеличением доли некротически измененных гепатоцитов. Это, в соответствии с концепцией Д.С. Саркисова [1], в рассматриваемой экспериментальной ситуации может свидетельствовать о возможности внутриклеточной регенерации в гепатоцитах с умеренными изменениями по типу вакуольной дистрофии. В почках животных линии СВА 2-й (леченные АмВ) и особенно 3-й группы (леченные КАД) процессы внутриклеточной репаративной регенерации в эпителиоцитах канальцев были выраженными, в то время как у мышей 1-й группы эти процессы были подавлены (рис. 2а). У мышей линии С57В1/6 (рис. 2б) наблюдали иную тенденцию: у мышей, леченных КАД, доля микронекрозов возрастала к концу эксперимента, также как и у мышей 1-й группы, однако доля деструктивных изменений эпителиоцитов у мышей линии С57В1/6, леченных КАД, была существенно меньшей (табл. 1).
Таким образом, КАД обладает более значительным терапевтическим эффектом, чем АмВ. Это проявлялось более динамичным у мышей, леченных КАД, чем у леченных АмВ, уменьшением количества гранулем (мыши линии СВА), индуцируемых живыми грибами C. albicans, свидетельствующих о величине градиента хематтрактантов, индуцируемого возбудителем и создаваемого клетками гранулем. Кроме того, уменьшение деструктивных изменений при лечении КАД не было сопряжено со снижением токсичности АмВ, а, вероятнее, с элиминацией грибов из клеток гранулем в других органах [10, 12], где их концентрация до лечения была большей, и, следовательно, со снижением эффектов токсических факторов грибов C. albicans. Возможно, что это связано со способностью декстрана с молекулярной массой 30-40 кДа [9] и 60-70 кДа [11] стимулировать пластические процессы, реализующиеся внутриклеточной регенерацией, что привело к сокращению очагов деструкции, и активировать неспецифические клеточные механизмы, направленные на элиминацию вне- и внутри-клеточно расположенных грибов. Кроме того, полученные данные свидетельствуют о том, что масштабы гранулематозного воспаления в значительной степени могут быть детерминированы генотипом животного, определяющего осо-
бенности структурно-функциональных параметров органов и систем, участвующих в процессах гранулемообразования при системных кандидозах.
PATHOMORPHOLOGICAL CHANGES IN KIDNEYS IN MICE OF OPPOSITE LINES WITH SYSTEMIC CANDIDIASIS AFTER TREATMENT BY AMPHOTERICIN B WITH DEXTRAN OXIDE
V.A. Shkurupiy, A. P. Nadeev, A.A. Pristavka, M. A. Travin, Novosibirsk state medical university Scientific center of clinical and experimental medicine SB RAMS
Abstract. Composition of amphotericin B with dextran oxide was more effective in treatment of systemic candidiasis in comparison to isolated amphotericin B treatment. Combination treatment results into the earlier and more dynamic decrease of candidiasis granules in the kidney. Amphotericin B with dextran oxide more effectively decreased C. albicans nephrotoxicity and stimulated reparative processes in the kidney. There were differences in morphology of glanulomatosis in kidney and expression of reparative processes among opposite mice lines (CBA and C57B1/6).
Key words: candidiasis granuleomatous, kidney, composition of amphotericin B and dextran oxide, interlines differences.
Литература
1. Микроскопическая техника: руководство для врачей и лаборантов / Под ред. Д.С. Саркисова, Ю.Л. Перова. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.
2. Надеев А.П., Шкурупий В.А., Позднякова С.В. Влияние состояния стресса на систему мононуклеарных фагоцитов и структурную организацию паренхимы печени при вакцинном гранулематозном воспалении // Проблемы туберкулеза. - 2002. - №.5 - С. 46-48.
3. Надеев А.П., Шкурупий В. А., Уварова Т. А. и др. Особенности ответа системы мононуклеарных фагоцитов у мышей оппозитных линий при
экспериментальном туберкулезе //Бюлл. эксперим. биол. и медицины. -2005. - №.8 - С. 227-230
4. Сергеев А.Ю, Сергеев Ю.В. Кандидоз. Природа инфекции, механизмы агрессии и защиты, лабораторная диагностика, клиника, лечение. -М.: Медицина, 2001. - 472 с.
5. Хмельницкий О.К., Аравийский Р.А., Экземпляров О.Э. Кандидоз (Патологическая анатомия, химиотерапия, лечебный патоморфоз). - Л.: Медицина, 1984. - 200 с.
6. Хмельницкий О.К., Белянин В.Л. О моделировании оппортунисти-
ческой инфекции вызываемой условно-патогенными грибами рода Candida // Архив патологии. - 1993. - № 1. - С. 82-85.
7. Шкурупий В.А. Ультраструктура клеток печени при стрессе. - Но-
восибирск: Наука, 1989. - 144 с.
8. Шкурупий В. А., Чернова Т.Г., Курунов Ю.Н. Влияние комплексно-
го препарата изониазида на мононуклеарные клетки в туберкулезной гранулеме // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 199б. - № 5. - С. 559-5б1.
9. Шкурупий В. А., Курунов Ю.Н., Яковченко Н.Н. Лизосомотропизм
- проблемы клеточной физиологии и медицины. - Новосибирск.: НГМА, 1999. - 289 с.
10. Шкурупий В.А., Овсянко Е.В., Надеев А.П. и др. Динамика клеточных преобразований в кандидозных гранулемах лимфатических узлов при лечении лизосомотропной формой амфотерицина В в эксперименте // Морфология. - 2005. - Т. 128, № 4. - С. 73-7б.
11. Шкурупий В.А., Козяев М.А., Надеев А.П. Ультраструктура эпите-лиоидных клеток типа А при БЦЖ-гранулематозе и введении лизосомотроп-ной формы изониазида // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 200б. - № 4.
- С.474-477.
12. Шкурупий В.А., Селятицкая В.Г., Цырендоржиев Д.Д. и др. Эффекты модифицированного амфотерицина В при системном кандидозе в эксперименте //Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2007. - № 4. - С.3б7-3б9.
13. Шкурупий В. А., Ткачев В. О., Потапова О.В. и др. Морфофункциональные особенности иммунной системы у мышей линии СВА и С57В1/б // Бюлл. эксперим. биол. и медицины. - 2010. - № 12. - С. б70-б73.
14. Laniado-Laborin R., Cabrales-Vargas M.N. Amphotericin B: side effects and toxicity // Rev. Iberoam. Micol. - 2009. - Vol. 2б, № 4. - P.223-227.
