CC BY
56
© ГУСЕВА Е.В., ШКУРУПИЙ В.А., НАДЕЕВ А.П., ПОТАПОВА О.В.
УДК 616.831-002.828-085.282-091.8
СТРУКТУРНАЯ ОРГАНИЗАЦИЯ ГОЛОВНОГО МОЗГА ПРИ ЦЕРЕБРАЛЬНОМ КАНДИДОЗЕ У МЫШЕЙ, ЛЕЧЕННЫХ КОМПОЗИЦИЕЙ АМФОТЕРИЦИНА В С ОКИСЛЕННЫМ ДЕКСТРАНОМ
Е.В. Гусева, В. А. Шкурупий, А.П. Надеев, О.В. Потапова Новосибирский государственный медицинский университет, ректор - д.м.н., проф. И.О. Маринкин; кафедра патологической анатомии, зав. - акад. РАМН, д.м.н., проф. В.А. Шкурупий; Научный центр клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, директор - акад. РАМН В.А. Шкурупий. Резюме. Исследованы структурные изменения в головном мозге мышей-самцов линии СВА при кандидозном менингоэнцефалите (штамм АТСС 24433), леченных композицией амфотерцина В и окисленного дектрана. Показана высокая эффективность композиции амфотерицина В и окисленного декстрана в сравнении со свободной формой амфотерицина В по проявлениям деструктивно-отечных изменений, гемоциркуляторых расстройств и компенсаторных процессов в головном мозге.
Ключевые слова: C. albicans, менингоэнцефалит, амфотерицин В, окисленный декстран
Гусева Екатерина Васильевна - аспирант Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, г. Новосибирск; тел. 8(383)2730084.
Шкурупий Вячеслав Алексеевич - акад. РАМН, зав. каф. патологической анатомии НГМУ, директор Научного центра клинической и экспериментальной медицины СО РАМН, г. Новосибирск; тел. 8(383)2730084.
Надеев Александр Петрович - д.м.н., проф. кафедры патологической анатомии НГМУ, г. Новосибирск; e-mail: nadeevngma@mail.ru.
В последние десятилетия отмечают все большее распространение глубоких микозов в связи с широким применением антибиотиков, лучевой терапии, парентерального питания, стероидных гормонов, иммунодепрессантов, цитоток-сических агентов [3, 4, 12, 13, 14]. Ранее были проведены исследования терапевтической эффективности композиции из амфотерицина В и окисленного декстрана с молекулярной массой 30-40 кДа при системных кандидозах у мышей, и получены положительные результаты при изучении проявлений канди-доза в печени, почках и легких [7, 10, 11]. Вместе с тем наибольшей проблемой являются микозы центральной нервной системы, возбудителями которых в 7885% случаев являются Сandida spp., а летальность достигает 50%. Лечение кан-дидозного менингоэнцефалита затруднено в связи с ограниченным проникновением лекарственных препаратов через гематоэнцефалический барьер [2, 14]. Для его преодоления возможно использование высокомолекулярных лизосомо-тропных носителей лекарственных средств, в частности, окисленного декстрана [9]. Предполагается, что лекарственное средство, захваченное макрофагами в связи с лизосомотропностью и пролонгированостью декстранов, и транспортированное макрофагами в очаг воспаления, преодолеет таким образом гематоэн-цефалической барьер.
Целью исследования было изучение изменений структурной организации головного мозга у мышей линий СВА при кандидозном менингоэнцефалите и их лечении композицией амфотерицина В с окисленным декстраном.
Материалы и методы
Работа выполнена на 260 двухмесячных мышах-самцах линии СВА массой 20-22 г., полученных из вивария НИИ Цитологии и генетики СО РАМН (Новосибирск). Животных содержали на стандартной лабораторной диете, они имели свободный доступ к воде и пище. Кандидозный менингоэнцефалит у мышей моделировали путем введения взвеси суточной культуры C. albicans (штамм АТСС 24433) в изотоническом растворе NaCl в дозе 1*109 микробных тел в 1 мл, объемом 0,05 мл в субдуральное пространство. Животные были разделены на 5 групп по 10 в каждой. Первую группу составили интактные животные. У
мышей 2-5-й групп моделировали иммунодефицитное состояние путем 2-х недельного ежедневного введения циклофосфана в дозе 30 мг/кг массы тела, внутримышечно, в течение всего срока эксперимента. Животным 3-й, 4-й, 5-й групп на фоне иммунодефицитного состояния моделировали кандидозный ме-нингоэнцефалит. Животных 3-й группы использовали в качестве контроля (не-леченные мыши). Мышам 4-й группы вводили амфотерицин В в дозе 250 ЕД/кг массы тела в 0,2 мл 5% раствора глюкозы (2-й контроль). Мышам 5-й группы вводили композицию амфотерицина В с окисленным декстраном (КАД) в дозе 250 ЕД/кг массы тела в 0,2 мл окисленного перманганантным методом декстра-на с молекулярной массой 30-40 кДа [8]. Каждый из препаратов вводили интра-перитонеально на следующие сутки после инфицирования. Курс лечения составил 10 инъекций в режиме «через день».
Животных выводили из эксперимента путем дислокации позвонков в шейном отделе под эфирным наркозом. Образцы головного мозга для светооптического исследования получали на 10, 28 и 56 сутки после инфицирования, фиксировали в 10% водном растворе нейтрального формалина, обезвоживали в серии этиловых спиртов возрастающей концентрации и заключали в парафин. Гистологические срезы толщиной 5 мкм, окрашивали гематоксилином и эозином, ШИК-реактивом, по Нисслю [6]. Для выявления астроцитов головного мозга и сосудов проводили иммуногистохимическую реакцию с моноклональными антителами CD34 (маркер эндотелиальных клеток) и GFAP (кислый фибриллярный белок астроцитов) («Abcam», США) с дополнительным окрашиванием гематоксилином Майера. Светооптическое исследование образцов головного мозга проводили на микроскопе AxioImager A1. Морфометрию осуществляли с помощью программы AxioVision 4.7. и окулярной сетки из 100 точек [1]. Подсчитывали численную плотность (Nai) и объемную плотность (Vv) поперечно и тангенциально срезанных сосудов в ткани головного мозга в тестовой площади 6,76 х104 мкм2, объемные плотности (Vv) очагов деструкции и перицеллюляр-ного и периваскулярного отека вещества головного мозга, численную (Nai) и объемную (Vv) плотности нейронов, астроцитов и клеток микроглии [6]. Веро-
ятность достоверности различий сравниваемых средних величин оценивали по критерию Стьюдента, достоверными считали различия при р<0,05.
Результаты и обсуждение
При микроскопическом исследовании оболочек головного мозга у животных 3-й (нелеченные) группы на 10-е сутки после инфицирования были выявлены отек, полнокровие сосудов, единичные скопления лимфоцитов. В веществе головного мозга наблюдали полнокровие, фибриноидное набухание стенок сосудов, с десквамацией эндотелия; вакуольную дистрофию нейронов, деструкцию и отек нейропиля. У мышей 2-й группы (циклофосфан) объемная плотность зон отека вещества головного мозга на 56-е сутки соответствовала таковой у мышей 1-й группы (интактные), но величина этого показателя у мышей 3-й (нелеченные) увеличивалась с 10-х по 56-е сутки на 30%, и была большей в сравнении с аналогичным показателем у мышей 2-й группы на 56-е сутки после инфицирования в 2 раза (табл. 1). В этой связи можно полагать, что повреждение головного мозга было обусловлено токсическим действием метаболитов С. а1Ыеат. Однако у мышей 4-й (леченные АмВ) и 5-й (леченные КАД) групп величины показателей объемной плотности перицеллюлярного и периваскуляр-ного отека вещества головного мозга на 56-е сутки наблюдения были меньшими в 1,8 и 3 раза, соответственно, по сравнению с величиной данного показателя у нелеченных животных 3-й группы, и соответствовала аналогичному показателю у мышей 1-й и 2-й групп (табл.1). Это свидетельствует о преодолении обеими формами используемых противогрибковых средств гематоэнцефаличе-ского барьера и высокой эффективности элиминации возбудителя, которая, судя по величинам обсуждаемых показателей, была существенно большей при применении КАД.
Выраженные деструктивно-отечные изменения в веществе головного мозга были связаны, вероятно, с распространенными гемоциркуляторными нарушениями, поскольку в головном мозге у инфицированных нелеченных животных (3-я группа) с 10 по 56-е сутки наблюдали уменьшение величины численной плотности сосудов в 3 раза, возможно, в связи со сдавлением капилляров. Вме-
сте с тем, объемная плотность сосудов в указанный период наблюдения не изменялась, что свидетельствует, наряду с вышеупомянутыми изменениями, о застойном полнокровии сосудов и, как следствие, о состоянии гипоксии. В этих условиях повреждение вещества головного мозга могло быть усугублено образованием активных форм кислорода [5]. У мышей 4-й (леченные АмФ) группы к 56 суткам величины численной и объемной плотности сосудов уменьшались незначительно, и были большими в 3 раза по сравнению с величинами аналогичных показателей у мышей 3-й (нелеченные) группы. У мышей 5-й (леченные КАД) группы во все периоды наблюдения численная и объемная плотности сосудов соответствовали величинам аналогичных показателей у мышей 1-й (ин-тактной) и 2-й (циклофосфан) групп, и были большими в 3,3 раза, в сравнении с величинами аналогичных показателей у мышей 3-й (нелеченные) группы. Это находило подтверждение в уменьшении масштабов деструктивно-отечных изменений в веществе головного мозга при применении КАД, и, видимо, было обусловлено известной способностью окисленного декстрана, входящего в состав КАД, стимулировать пластические и репаративные процессы [6].
Деструктивные изменения в веществе головного мозга мышей экспериментальных групп сопровождались компенсаторными процессами, проявлявшимися гиперплазией и гипертрофией глиальных клеток. Клетки микроглии, относящиеся к системе мононуклеарных фагоцитов, были расположены диффузно, преимущественно вокруг мелких очагов некроза и дистрофически измененных нейронов. При этом у мышей 3-й (нелеченные) группы доля микроглии на 10-е и 28-е сутки была большей, в сравнении с величиной аналогичного показателя у мышей 1-й (интактные) и 2-й (циклофосфан) групп в на 44% (рис. 1), и соответствовала выраженным деструктивно-отечными изменениям в веществе головного мозга у мышей 3-й группы. Однако, при применении АмВ (4-я группа) и КАД (5-я группа), доля микроглиальных клеток в целом соответствовала таковой у мышей 1-й (нелеченные) и 2-й (циклофосфан) групп. При морфометрическом исследовании объемная плотность астроцитов у мышей во всех группах в целом не различалась (табл.1). Однако астроциты в веществе головного мозга
у мышей 4-й (леченные АмВ) и 5-й (леченные КАД) групп были расположены диффузно и периваскулярно, в виде скоплений, вокруг паретически расширенных сосудов. При иммуногистохимическом окрашивании GFAP у них наблюдали увеличение количества перикапиллярно расположенных отростков астро-цитов, гиперплазию тел и отростков астроцитов, что, вероятно, можно рассматривать как приспособительную реакцию на введение возбудителя, направленной на укрепление гематоэнцефалического барьера.
Таким образом, при церебральном введении C. albicans на фоне иммуноде-фицитного состояния, индуцированного циклофосфаном, формировался ме-нингоэнцефалит, который характеризовался развитием деструктивно-отечных изменений, связанных как с непосредственным цитопатическим действием метаболитов возбудителя, так и со вторичной ишемией вещества головного мозга в связи с уменьшением и поражением микроциркуляторного русла головного мозга, а также гиперплазией глиальных клеток, продуцирующих, вероятно, активированные формы кислорода. Полученные результаты морфологического исследования головного мозга при кандидозном менингоэнцефалите свидетельствуют о большей эффективности композиции амфотерицина В с окисленным декстраном по сравнению с амфотерицином В, способствующей как уменьшению проявлений деструктивно-отечных изменений в головном мозге в связи с элиминацией возбудителя, так усилению пластических и репаративных процессов в нем.
STRUCTURAL BRAIN ORGANIZATION IN MICE WITH CEREBRAL CANDIDOSIS AFTER TREATMENT WITH AMPHOTERICIN B AND OX-
IDE-DEXTRAN COMPOSITION
E.V. Guseva, V.A. Shkurupiy, A.P. Nadeev, O.V. Potapova Novosibirsk state medical university Scientific center of clinical and experimental medicine SB RAMS
Abstract. The structural changes were analyzed in male CBA line mice brain after treatment with amphotericin B and oxide-dextran during candidosis meningoencephalitis (ATCC 24433 strain). High efficiency of amphotericin B and oxide-dextran composition on destructive and edemal changes, hemocirculatory disturbances and compensatory mechanisms in brain was shown compare to free form of amphotericin
B.
Key words: C. albicans, meningoencephalitis, amphotericin B, oxide-dextran.
Литература
1. Автандилов Г.Г. Медицинская морфометрия. - М.: Медицина, 1990. - 384
с.
2. Бадалян Л.О. Детская неврология. 3-е изд. - М.: Медицина, 1984. - 421с.
3. Буслаева Г. Н. Кандидоз ЦНС как нозокомиальная инфекция у детей первого года жизни // Проблемы медицинской микологии. - 2001. - Т. 3, № 2. - С. 53-54.
4. Джавадов С.С. Грибковые осложнения у детей, больных лейкемией // Проблемы медицинской микологии. - 2007. - Т.9, № 3. - С. 24-25.
5. Меньщикова Е.Б., Ланкин В.З., Зенков Н.К. и др. Окислительный стресс. Прооксиданты и антиоксиданты. - М.: Слово, 2006. - 556с.
6. Микроскопическая техника / Под. ред. Саркисова Д.С., Перова Ю.Л. - М.: Медицина, 1996. - 544 с.
6. Потапова О.В., Шкурупий В.А., Шаркова Т.В. и др. Структурные изменения в головном мозге мышей, инфицированных вирусом гриппа А/Н5Ш // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2009. - № 12. - С. 653-656.
7. Приставка А. А., Надеев А.П., Травин М. А., Шкурупий В. А. Терапевтическая эффективность композиции амфотерицина В с диальдегиддекстраном при поражении почек у мышей разных линий с системным кандидозом // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2008. - Приложение № 1. - С. 76-79.
8. Шкурупий В.А., Троицкий А.В., Архипов С.А. и др. Сравнительная оценка влияния нанолипосом с окисленными декстранами на перитонеальные клетки
in vitro // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2008. - Приложение №1. -
С. 123-126.
9. Шкурупий В. А. Туберкулезный гранулематоз. Цитофизиология и адресная терапия. - М.: Издательство РАМН, 2007. - 536 с.
10. Шкурупий В.А., Селятицкая В.Г., Цырендоржиев Д.Д. и др. Эффекты модифицированного амфотерицина при системном кандидозе в эксперименте // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2007. - Т. 143, № 4. - С. 367-369
11. Шкурупий В. А., Чернова Т.Г., Надеев А.П. Исследование гранулематозного воспаления в легких у мышей с системным кандидозом, леченных композицией амфотерицина В с диальдегиддекстраном // Бюлл. эксперим. биологии и медицины. - 2008. - Приложение № 1. - С. 80-82
12. Bougnoux M.E. Kac G., Aegerter P. et. al. Candidemia and candiduria in critically ill patients admitted to intensive care units in France: incidence, molecular diversity, management and outcome // Intensive Care Med. - 2008. - Vol. 34. - P. 292-299.
13. Castro B.A. The immunocompromised pediatric patient and surgery // Best Practice & Research Clinical Anaesthesiology. - 2008. - Vol. 22, № 3. - Р. 611-626.
14. Wisplinghoff H., Bischoff T., Tallent S.M. et.al. Nosocomial bloodstream infections in US hospitals: analysis of 24, 179 cases from a prospective nationwide surveillance study // Clin. Infect. Dis. - 2004. - Vol. 39 - P. 309-317.
