CC BY
42
ISSN 2412-608Х. МАСЛИЧНЫЕ КУЛЬТУРЫ. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. Вып. 3 (171), 2017
УДК 631.523:633.854.78
ПАСПОРТИЗАЦИЯ ЛИНИЙ И ГИБРИДОВ ПОДСОЛНЕЧНИКА
СЕЛЕКЦИИ АРМАВИРСКОЙ ОПЫТНОЙ СТАНЦИИ ВНИИМК: ПОДБОР ОПТИМАЛЬНЫХ ДНК ЛОКУСОВ И УСЛОВИЙ ПЦР
1С.З. Гучетль,
кандидат биологических наук
2С.С. Фролов,
кандидат сельскохозяйственных наук 2Р.Н. Зайцев,
кандидат экономических наук
2Е.С. Кузнецова,
лаборант-исследователь
1ФГБНУ ВНИИМК
Россия, 350000 , г. Краснодар, ул. им. Филатова, д. 17 Тел.: (861) 275-86-53 E-mail: [email protected]
2ФГБНУ «Армавирская опытная станция ВНИИМК» Россия, 352925, Краснодарский край, г. Армавир, пос. Центральной усадьбы опытной станции ВНИИМК
Тел./факс: 8 (861) 3703-13-76 E-mail: [email protected]
Для цитирования: Гучетль С.З., Фролов С.С., Зайцев Р.Н., Кузнецова Е.С. Паспортизация линий и гибридов подсолнечника селекции Армавирской опытной станции ВНИИМК: подбор оптимальных ДНК локусов и условий ПЦР // Масличные культуры. Научно-технический бюллетень Всероссийского научно-исследовательского института масличных культур. - 2017. - Вып. 3 (171). - С. 23-28.
Ключевые слова: подсолнечник, линии, гибриды, паспортизация, микросателлитные локусы.
Линии и гибриды подсолнечника Армавирской опытной станции (АОС) ВНИИМК не паспортизированы по локусам ДНК. Для генетического материала из разных селекцентров аллельный полиморфизм одних и тех же локусов может быть неодинаков, поэтому необходимо проводить поиск SSR-праймеров, выявляющих полиморфизм фракций ДНК. Создание системы молекулярных маркеров на основе локусов ДНК для отдельно взятой лаборатории требует оптимизации температурных режимов амплификации ДНК с разными праймерами. Поэтому целями данной работы бы-
ли: оптимизация условий ПЦР, подбор оптимальных микросателлитных локусов и выявление стабильного, воспроизводящегося полиморфизма амплифицированных фрагментов ДНК для создания системы молекулярных маркеров, пригодных для идентификации и паспортизации линий и гибридов подсолнечника селекции АОС ВНИИМК. Материалом для исследования служили 12 линий и семь гибридов коллекции подсолнечника АОС ВНИИМК. Для полимеразной цепной реакции (ПЦР) ДНК были отобраны 18 пар SSR-праймеров. Три праймера не гибридизовались с матричной ДНК ни при одной температуре отжига. Для 15 пар экспериментальным путем был проведен подбор оптимальной температуры гибридизации с матричной ДНК. Показано, что 11 пар праймеров для ПЦР выявляют стабильный, воспроизводящийся полиморфизм фракций ампли-фицированной ДНК, что позволяет использовать их для молекулярно-генетической паспортизации инбредных линий и гибридов подсолнечника селекции АОС ВНИИМК. Анализ электрофоретиче-ских спектров микросателлитных локусов показал, что некоторые линии обладают идентичным составом микросателлитных локусов. Уникальность проанализированной группы линий составила 58,3 %. Семь исследованных гибридов имели отличающиеся по аллельному составу микросателлитных локусов генотипы. Предполагается дальнейший скрининг SSR локусов для более точной идентификации генотипов подсолнечника.
UDC 631.523:633.854.78
Identification of sunflower lines and hybrids bred at the Armavirskaya experimental station of VNIIMK: selection of optimal DNA-loci and PCR conditions.
1Guchetl S.Z., PhD in biology 2Frolov S.S., PhD in agriculture 2Zaitsev R. N., PhD in economy 2Kuznetsova E.S., laboratory assistant researcher
1All-Russia Research Institute of Oil Crops by Pustovoit V.S.
17, Filatova str., Krasnodar, 350038, Russia Те1: (861) 275-86-53
2Armavirskaya experimental station of All-Russia
Research Institute of Oil Crops
VNIIMK settl., Armavir, Krasnodar region, 352925, Russia
ТеМэх: 8 (861) 3703-13-76
E-mail: [email protected]
Key words: sunflower, lines, hybrids, identification, microsatellite loci.
Lines and hybrids of Armavirskaya experimental station of All-Russia Research Institute of Oil Crops are not identified under DNA loci. Allele polymor-
phism of one and the same loci can be different for genetic materials originated from the various breeding centers, so it is necessary to seek SSR-primers determining polymorphism of DNA fractions. Creation of a system of molecular markers on a base of DNA loci for a separate laboratory requires for optimization of temperature regimens of DNA amplification with different primers. Thus, the purposes of this work were optimization of PCR conditions, search of optimal microsatellite loci and determination of stable recurred polymorphism of DNA amplified fractions to create a system of molecular markers suitable for identification of sunflower lines and hybrids bred at Armavirskaya experimental station. Seven hybrids and 12 lines from sunflower collection of the Armavirskaya experimental station of VNIIMK were used for research. 18 pairs of SSR-primers were selected for polymerase chain reaction. Three primers did not hybridize with a matrix DNA in no one annealing temperature. An optimal temperature of hybridization with matrix DNA was selected experimentally for 15 pairs. It is showed that 11 pair of primers for PCR revealed stable recurred polymorphism of amplified DNA fractions, this allows to use them for molecular-genetic identification of sunflower inbreds and hybrids developed at the Armavirskaya experimental station of VNIIMK. Analysis of electro-phoretic spectra of microsatellite loci showed some lines had identic set of microsatellite loci. Unicity of analyzed lines is 58.3%. Seven studied hybrids had different allele set of microsatellite loci in genotypes. The further screening of SSR-loci for more correct sunflower genotypes identification is supposed.
Введение. Подсолнечник (Helianthus annuus L.) является одной из важнейших масличных культур в мире. Семена гибридов подсолнечника - основной источник растительного масла в России. На сегодняшний день проведение генетической паспортизации линий и гибридов -актуальная задача селекции. В мировой практике для паспортизации используют преимущественно биохимические и ДНК-маркеры, в основном микросателлиты, поскольку они обладают практически всеми свойствами, которыми должны обладать маркеры. С их помощью производится молекулярно-генетическая паспортизация таких культур, как пшеница [1; 2], соя [3], хвойные деревья [4], вино-
град [5]. Паспортизация линий и гибридов подсолнечника выполняется в различных селекцентрах как у нас в стране, так и за рубежом [7; 8; 9]. Во ВНИИМК для идентификации и паспортизации линий и гибридов подсолнечника используются изоферментные системы, ЯДРО и ББЯ-производные амплифицированные фрагменты ДНК [9; 10]. Линии и гибриды подсолнечника Армавирской опытной станции (АОС) ВНИИМК не были паспортизированы по локусам ДНК. Для генетического материала из разных селекцентров аллельный полиморфизм одних и тех же локусов может быть неодинаков, поэтому необходимо проводить поиск SSR-праймеров, выявляющих полиморфизм фракций ДНК. Кроме того, для создания системы молекулярных маркеров на основе локусов ДНК в отдельно взятой лаборатории необходима оптимизация температурных режимов амплификации ДНК с разными прайме-рами. Поэтому целями данной работы были: оптимизация условий ПЦР, подбор оптимальных микросателлитных локусов и выявление стабильного, воспроизводящегося полиморфизма амплифицирован-ных фрагментов ДНК для создания системы молекулярных маркеров, пригодных для идентификации и паспортизации линий и гибридов подсолнечника селекции АОС ВНИИМК.
Материалы и методы. Работа выполнена на Армавирской ОС ВНИИМК, г. Армавир. Материалом для исследования служили 12 линий и семь гибридов коллекции подсолнечника АОС ВНИИМК (табл. 2, 3). Геномную ДНК выделяли из смеси семядольных листьев 5-7-дневных этиолированных проростков подсолнечника с помощью модифицированного метода Saghai-Maroof et а1. [12] с использованием СТАВ буфера. Для проведения ПЦР использовали 25 мкл реакционной смеси следующего состава: 67 мМ трис-НС1, рН 8,8; 16,6 мМ сульфата аммония; 1,5-3 мМ
MgCl2; 0,01 % Tween 20; по 0,2 мМ дезок-сирибонуклеозидфосфатов; по 10 пМ праймеров; 10 нг матричной ДНК и 1 ед. рекомбинантной термостабильной ДНК. Амплификацию проводили в приборе Терцик (ДНК-технология, Россия). Условия амплификации: начальная денатурация при 96 оС в течение 2 мин; затем 30 циклов при соблюдении температурно-временного режима: отжиг при 55-60 оС в течение 40 с, элонгация - 1 мин при 70 оС, денатурация при 94 оС - 30 с, финальная элонгация - 2 мин. Использовали 18 SSR локусов, наследование которых было установлено исследованиями Т.А. Че-люстниковой [12] и T.S. Antonova et а1. [10]. Электрофорез продуктов амплификации проводили в агарозном геле (2 % агароза, 1 х ТАЕ-буфер) с использованием камеры для горизонтального электрофореза (SE. 2, ДНК-технология, Россия) в течение 1-1,5 ч при силе тока 60 mA и напряжении 90-100 V. Последующее окрашивание осуществляли бромистым этидием. Визуализация и документирование результатов электрофореза обеспечивались при помощи трансиллюминатора ECX-F20.M (WILBER LOURMAT, Франция) и фотоаппарата Canon EOS 550D (Япония). Для определения различий между линиями подсолнечника данные ПЦР-анализа были обработаны кластерным анализом, методом Ward с помощью пакета программ (Statistica 6.0). Генетические дистанции рассчитаны с помощью Евклидова расстояния.
Результаты и обсуждение. Для создания системы молекулярных маркеров на основе микросателлитных локусов ДНК для линий и гибридов селекции АОС ВНИИМК были отобраны 18 пар SSR-праймеров, использованных ранее другими исследователями (табл. 1). Поскольку наиболее значимым параметром при проведении полимеразной цепной реакции является температура гибридизации (отжига) праймера с матрицей ДНК, для всех
пар праймеров, использованных в работе, экспериментальным путем был проведен подбор оптимальной температуры отжига. Температура отжига праймеров была подобрана таким образом, чтобы продуцировались полиморфные фрагменты, но количество неспецифических фракций было сведено к минимуму (табл. 1). Три праймера - ORS 1209, ORS 1796 и ORS 553 - не гибридизовались с матричной ДНК ни при одной температуре отжига.
Таблица 1
Оптимальные температурные режимы для ПЦР-анализа восемнадцати микросателлитных локусов
Армавирская ОС ВНИИМК, 2017 г.
Для достоверной идентификации генотипов необходимо использование оптимального количества локусов с максимальным числом аллелей и хорошо читаемыми маркерными спектрами, а также с высокой степенью воспроизведения результатов. С целью определения этих параметров проведены полимераз-ные цепные реакции с 15 праймерами, амплифицирующими ДНК, выделенную из проростков инбредных линий и гибридов культурного подсолнечника селекции АОС ВНИИМК. Четыре локуса - ORS-6, HNCA-2, ORS 553 и IUB-6 - оказались мономорфными. Последующее их использование для паспортизации мы сочли нецелесообразным. Количество аллелей для остальных локусов варьировало от двух до четырех. Так, у локуса Har 1608 было выявлено четыре аллеля, по три ал-леля у локусов Har 517 и Har 432. У ос-
Название SSR локуса Оптимальная температура отжига, оС Название SSR-локу-са Оптимальная температура отжига, оС
Har 432 60 ORS 509 60
Har 514 55 ORS 553 60
Har 1327 60 ORS 559 55
Har 1442 60 ORS 815 60
Har 1608 55 ORS 1144 60
ORS 6 60 ORS 1287 55
ORS 5 60 ORS 1209 Нет отжига
IUB 6 60 ORS 1796 Нет отжига
HNCA 2 55 ORS 533 Нет отжига
тальных локусов обнаружено по два ал-
леля (рис. 1).
Рисунок 1 - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК у линий подсолнечника по локусу ORS 5 : ОК - отрицательный контроль;
М - маркер молекулярного веса 100 пн.
Среднее число аллелей на локус составило 2,3 (без учета мономорфных локусов). Этот показатель близок к полученному ранее для линий подсолнечника ВНИИМК, составившему 2 [9]. Для обозначения аллельных вариантов использовали количество пар нуклеотид-ных оснований (пн) фрагмента ДНК. Гетерозиготные спектры, т.е. спектры, в которых присутствовали фракции двух разных аллелей, обозначены двумя числами, разделенными «/». Анализ электро-форетических спектров 11 полиморфных микросателлитных локусов линий показал индивидуальность аллельного состава каждой из них, за исключением линий ВА
760, ВА 761 и ВА 93, а также ВА 325 и ВК 21 (табл. 2). Идентичность аллельного состава линий ВА 760 с ВА 761 и ВА 325 с ВК 21 вполне предсказуема, поскольку эти линии являются аналогами. Данные линии были паспортизированы в лаборатории иммунитета молекулярного маркирования ФГБНУ ВНИИМК с помощью изоферментных маркеров. Подтвердилась идентичность пар ВА 760 с ВА 761 и ВА 325 с ВК 21. Но линия ВА 93 показала генотип, отличающийся от ВА 760 и ВА
761. Следовательно, есть необходимость в увеличении количества используемых 26
для паспортизации маркерных ДНК локусов. Уникальность проанализированной группы линий составила 58,3 %.
Таблица 2
Аллельные состояния 11 микросателлитных локусов у линий подсолнечника селекции АОСВНИИМК
Армавирская ОС ВНИИМК, 2017 г.
Генотип SSR локус
Har Har Har Har ORS5 Har ORS ORS ORS ORS ORS
432 514 1327 1442 1608 559 815 1144 533 1287
ВА 93 175 190 195 0 320 260 150 180 136 170 210
ВА 760 175 190 195 0 320 260 150 180 136 170 210
ВА 761 175 190 195 0 320 260 150 180 136 170 210
ВА 4 175 190 195 0 350 270 150 180 136 175 210
ВА 6 180 185 205 0 320 260 150 180 136 175 210
ВА 384 175 180 195 165 320 270 150 180 177 175 200
ВА 389 180 190 195 165 320 270 150 180 177 175 200
ВА 317 175 180 195 165 350 270 100 200 136 175 200
ВА 325 175 180 195 165 320 280 100 200 177 170 210
ВК 21 175 180 195 165 320 280 100 200 177 170 210
ВА 337 170 180 195 165 350 270 100 200 136 175 200
ВА 737 175 180 195 165 350 240 100 200 136 175 200
Для определения степени сходства между линиями данные ПЦР-анализа были представлены в виде матрицы состояний бинарных признаков, в которой наличие или отсутствие в электрофоретических спектрах одинаковых по размеру фрагментов ДНК соответствовало значениям 1 и 0. Значение 1 присваивалось наличию фрагмента, а 0 - отсутствию. На основе матрицы состояний был проведен кластерный анализ методом Ward и построена дендро-грамма генетических взаимоотношений между изученными линиями (рис. 2).
ВА 93 ВА 760 ВА 761 ВА 4 ВА 6 ВА 384 ВА 389 ВА 317 ВА 337 ВА 737 ВА 325 ВК 21
I
—^ 1
Генетическая дистанция
Рисунок 2 - Дендрограмма генетического сходства линий селекции АОС ВНИИМК на основе полиморфных ББК-локусов ДНК
2
4
8
Анализ дендрограммы показал, что изученные линии разделились на два кластера I и II, с генетической дистанцией между ними 9,3. В кластер I попали материнские линии ВА 93, ВА 760, ВА 761, ВА 4, ВА 6, а также две отцовские линии -ВА 384 и ВА 389. Кластер II объединил только отцовские линии ВА 317, ВА 337, ВА 737, ВА 325 и ВК 21. Таким образом, объединение линий в кластеры в большей степени определялось тем, являлась ли линия материнской или отцовской.
Семь исследованных гибридов имели отличающиеся по аллельному составу микросателлитных локусов генотипы (табл. 3).
Таблица 3
Аллельные состояния микросателлитных локусов гибридов подсолнечника
У большинства локусов наследование ампликонов происходило по кодоминант-ному типу. В этом случае у локусов, находящихся в гетерозиготном состоянии, мы наблюдали оба родительских ампли-кона (рис. 3). Другие же локусы (Наг 432, Наг 1442) наследовались по доминантному типу и показывали у гетерозиготного гибрида лишь один ампликон.
Рисунок 3 - Электрофоретические спектры продуктов амплификации ДНК у гибрида подсолнечника Натали и его родительских линий по локусу ORS 5 : ОК - отрицательный контроль.
М - маркер молекулярного веса 100 пн.
Таким образом, в результате проведенных исследований подобраны оптимальные условия амплификации ДНК для 15 микросателлитных праймеров. 11 пар праймеров для ПЦР выявляют стабильный воспроизводящийся полиморфизм фракций амплифицированной ДНК, что позволяет использовать их для молеку-лярно-генетической паспортизации ин-бредных линий и гибридов подсолнечника селекции АОС ВНИИМК. Предполагается дальнейший скрининг микросателлитных локусов для более точной идентификации генотипов подсолнечника.
Список литературы
1. Вдовиченко Л.Д., Глазко В.И. Генетическая паспортизация сортов пшеницы с использованием ISSR-PCR маркеров // Сельскохозяйственная биология. - 2007. - № 3. - С. 33-37.
2. Бобошина И.В., Боронникова С.В. Идентификация перспективных для Урала сортов пшеницы мягкой с использованием межмикросателлит-ного анализа полиморфизма ДНК // Фундаментальные исследования. - 2013. - № 6. - С. 92-97.
3. Рамазанова С.А., Гучетль С.З., Челюстни-кова Т.А., Антонова Т.С. Идентификация сортов сои российской селекции на основе анализа мик-росателлитных (SSR) локусов ДНК // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2008. - № 2 (139) - С. 56-58.
Армавирская ОС ВНИИМК, 2017 г.
Генотип SSR-локусы
Har 432 Har 514 Har 1327 Har 1442 ORS5 Har 1608 ORS 559 ORS 815 ORS 1144 ORS 533 ORS 1287
Барс 175 180/ 190 195 165 260/ 270 320/ 350 150/ 100 180/ 200 136 170/ 175 200/ 210
Натали 175 180/ 190 195 165 260/ 270 320/ 350 150/ 100 180/ 200 136 175 200/ 210
Ирэн 175 180/ 190 195 165 260/ 270 320 150 180 136/ 177 175 200/ 210
Мэлин 180 180/ 185 195 165 260/ 270 320/ 350 150/ 100 180/ 200 136 175 200/ 210
Медас 175 180/ 190 195 165 270 350 150/ 100 180/ 200 136 175 200/ 210
Арис 175 180/ 190 195 165 240/ 260 320/ 350 150/ 100 180/ 200 136 175 200/ 210
Арнэб 180 190 195 165 260/ 270 320 150 180 136/ 177 175 200/ 210
4. Шейкина О.В., Прохорова А.А., Новиков П.С., Криворотова Т.Н. Разработка методики идентификации клонов плюсовых деревьев ели обыкновенной (Picea abies L.) с использованием ISSR-маркеров // Научный журнал КубГАУ. -2012. - № 83 (09). - С. 12-18.
5. Cabezas J.A., Ibáñez J., Lijavetzky D., Vélez D., Bravo G., Rodríguez V. A 48 SNP set for grapevine cultivar identification // Plant Biology. - 2011. - No 11. - Р. 153.
6. Саналатий А.В., Солоденко А.Е., Сиволап Ю.М. Идентификация генотипов подсолнечника украинской селекции при помощи SSRP-анализа // Цитология и генетика. - 2006. - Т. 40. -№ 4. - С. 37-43.
7. Imerovski I., Dimitrijevic A., Miladinovic D., Dedic D., Jocic S., Miklic V. Molecular profiles of sunflower lines resistant to broomrape (Orobanche ramana Wallr.) // Proc. of Intern. Symposium on Broomrape (Orobanche spp.) in Sunflower. Chisinau, Republic of Moldova, August 25-27, 2011. - P. 25.
8. Усатов А.В., Маркин Н.В., Горбаченко Ф.И., Федорова М.А., Тихобаева В.Е., Горбаченко О.Ф., Азарин К.В. SSR-анализ геномной ДНК ЦМС-линий подсолнечника // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2011. - № 1 (146147). - С. 15-20.
9. Гучетль С.З., Челюстникова Т.А., Антонова Т.С. Паспортизация новых линий и гибридов подсолнечника селекции ВНИИМК с помощью биохимических и молекулярных маркеров // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. -2015. - № 3 (163). - С. 31-37.
10. Antonova T.S., Guchetl S.Z., Tchelustniko-va T.A., Ramazanova S.A. Development of marker system for identification and certification of sunflower lines and hybrids on the basis of SSR-analysis // Helia. - 2006. - V. 29. - No 45. - P. 63-68.
11. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen RA., Allard R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics // PNAS USA. - 1984. - V. 81. - P. 8014-8018.
12. Челюстникова Т.А. Полиморфизм микроса-теллитных локусов в генотипах культурного и дикорастущего подсолнечника // Масличные культуры. Науч.-тех. бюл. ВНИИМК. - 2008. -Вып. 2 (139). - С. 19-23.
References
1. Vdovichenko L.D., Glazko V.I. Geneticheskaya pasportizatsiya sortov pshenitsy s ispol'zovaniem ISSR-PCR markerov // Sel'skokhozyaystvennaya biologiya. - 2007. - № 3. - S. 33-37.
2. Boboshina I.V., Boronnikova S.V. Identifikatsiya perspektivnykh dlya Urala sortov pshenitsy myagkoy s ispol'zovaniem mezhmikrosatellitnogo analiza polimorfizma DNK // Fundamental'nye issledovaniya. - 2013. - № 6. - S. 92-97.
3. Ramazanova S.A., Guchetl' S.Z., Chelyustnikova T.A., Antonova T.S. Identifikatsiya sortov soi rossiyskoy selektsii na osnove analiza mikrosatellitnykh (SSR) lokusov DNK // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2008. - № 2 (139). - S. 56-58.
4. Sheykina O.V., Prokhorova A.A., Novikov P.S., Krivorotova T.N. Razrabotka metodiki identifikatsii klonov plyusovykh derev'ev eli obyknovennoy (Picea abies L.) s ispol'zovaniem ISSR-markerov // Nauchnyy zhurnal KubGAU. -2012. - № 83 (09). - S. 12-18.
5. Cabezas J.A., Ibanez J., Lijavetzky D., Velez D., Bravo G., Rodriguez V. A 48 SNP set for grapevine cultivar identification // Plant Biology. - 2011. -No 11. - P. 153.
6. Sanalatiy A.V., Solodenko A.E., Sivolap Yu.M. Identifikatsiya genotipov podsolnechnika ukrainskoy selektsii pri pomoshchi SSRP-analiza // Tsitologiya i genetika. - 2006. - T. 40. - № 4. - S. 37-43.
7. Imerovski I., Dimitrijevic A., Miladinovic D., Dedic D., Jocic S., Miklic V. Molecular profiles of sunflower lines resistant to broomrape (Orobanche sumana Wallr.) // Proc. of Intern. Symposium on Broomrape (Orobanche spp.) in Sunflower. Chisinau, Republic of Moldova, August 25-27, 2011. - P. 25.
8. Usatov A.V., Markin N.V., Gorbachenko F.I., Fedorova M.A., Tikhobaeva V.E., Gorbachenko O.F., Azarin K.V. SSR-analiz genomnoy DNK TsMS-liniy podsolnechnika // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2011. - № 1 (146-147). - S. 15-20.
9. Guchetl' S.Z., Chelyustnikova T.A., Antonova T.S. Pasportizatsiya novykh liniy i gibridov podsolnechnika selektsii VNIIMK s pomoshch'yu biokhimicheskikh i molekulyarnykh markerov // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. -2015. - № 3 (163). - S. 31-37.
10. Antonova T.S., Guchetl S.Z., Tchelustnikova T.A., Ramazanova S.A. Development of marker system for identification and certification of sunflower lines and hybrids on the basis of SSR-analysis // Helia. - 2006. - V. 29. - No 45. - P. 63-68.
11. Saghai-Maroof M.A., Soliman K.M., Jorgensen RA., Allard R.W. Ribosomal DNA spacer-length polymorphisms in barley: Mendelian inheritance, chromosomal location, and population dynamics // PNAS USA. - 1984. - V. 81. - P. 8014-8018.
12. Tchelyustnikova T.A. Polimorfizm mikrosatellitnykh lokusov v genotipakh kul'turnogo i dikorastushchego podsolnechnika // Maslichnye kul'tury. Nauch.-tekh. byul. VNIIMK. - 2008. - Vyp. 2 (139). - S. 19-23.
