CC BY
33
92
1SSN0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2021. Вып. 138
БИОТЕХНОЛОГИЯ РАСТЕНИЙ
УДК 504.73:57.085.2
DOI: 10.36305/0513-1634-2021-138-92-100
ОЗДОРОВЛЕНИЕ И РАЗМНОЖЕНИЕ IN VITRO ПЕРСПЕКТИВНЫХ СОРТОВ И ГИБРИДНЫХ ФОРМ ХРИЗАНТЕМЫ САДОВОЙ СЕЛЕКЦИИ НИКИТСКОГОБОТАНИЧЕСКОГОСАДА
Ирина Вячеславовна Митрофанова, Ольга Владимировна Митрофанова, Нина Павловна Лесникова-Седошенко, Наталия Владимировна Смыкова
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки «Ордена Трудового Красного Знамени Никитский ботанический сад - Национальный научный центр РАН», Республика Крым, г. Ялта, пгт Никита, Никитский спуск, 52 E-mail: invitro_plant@mail.ru
Разработан протокол микроразмножения в условиях in vitro для сортов хризантемы садовой Мокрое Серебро, Предрассветный Аю-Даг, Эльдорадо и Эрмитаж селекции НБС. 10-20 мг/л рибавирина обеспечивало оздоровление первичных эксплантов. Высокая частота регенерации адвентивных почек и микропобешв отмечена у сортов Эльдорадо и Эрмитаж (21,0 и 23,5 микропобегов/эксплант) при культивировании на среде МС с 0,75 мг/л кинетина и сорта Мокрое Серебро на среде МС с 0,75 мг/л БАП (24,5 микропобегов/эксплант). Спонтанное корнеобразование обеспечило 100% укореняемость микропобешв.
Ключевые слова: Chrysanthemum х mori folium; эксплант; рибавирин; регенерация in vitro
Введение
Хризантема садовая (<Chrysanthemum х morifolinm Ramat.) - растения с различной формой и окраской цветков из семейства Asteraceae. Хризантемы занимают одно из важных мест на мировых цветочных рынках. Популярность хризантемы в России объясняется ярким и продолжительным осенним цветением, когда ассортимент других цветущих культур ограничен. В промышленном цветоводстве ее выращивают на срез и как горшечную культуру [5, 7, 8].
Коллекция хризантемы садовой Никитского ботанического сада формировалась с первых лет его становления (1812 г.) и насчитывает около 400 сортов и гибридных форм [6]. В настоящее время это крупная и наиболее полная коллекция в России, включающая все классы культуры, сорта азиатской, европейской, американской селекции, а также сорта и гибридные формы селекции Никитского ботанического сада - Национального научного центра (НБС-ННЦ). Известно, что при ежегодном вегетативном размножении посредством черенкования в растениях хризантемы могут накапливаться вирусные патогены, снижающие коэффициент размножения и ухудшающие качество посадочного материала [3, 18]. В связи с этим возникла необходимость поиска и разработки приемов оздоровления и эффективных протоколов микроразмножения in vitro исследуемых сортов.
Целью данной работы была разработка биотехнологических приемов оздоровления и размножения in vitro 4 крупноцветковых сортов и 2 гибридных форм хризантемы садовой коллекции НБС-ННЦ.
ISSN0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2021. Вып. 138
93
Объекты и методы исследования
Объектом для исследований служили 4 сорта (‘Мокрое Серебро‘, ‘Предрассветный Аю-Даг‘, ‘Эльдорадо1, ‘Эрмитаж‘) и 2 гибридные формы (‘№ 10-16’ и ‘№ 15-17’) хризантемы садовой {Chrysanthemum х morifolinm Ramat.) селекции НБС-ННЦ (рис. 1):
‘Мокрое Серебро’. Растения 40-50 см высотой; цветоносные побеги прочные, густо облиственные; листья зеленые, средние по размеру. Соцветия кремово-розовые, отогнутые, густомахровые, 13-14 см в диаметре.
‘Предрассветный Аю-Даг’. Растения 90-100 см высотой; цветоносные побеги прочные, средне-облиственные; листья зеленые, средние по размеру. Соцветия кремово-розовые, полушаровидные, махровые, 14-15,5 см в диаметре.
‘Эльдорадо1. Растения 90,0-100,0 см высотой; цветоносные побеги прочные, средне-облиственные; листья темно-зеленые, средние по размеру. Соцветия лиловые, плоско-полушаровидные, густо махровые, 15-17 см в диаметре.
‘Эрмитаж‘. Растения 110-130 см высотой; цветоносные побеги средне-прочные, средне-облиственные; листья темно-зеленые, средние по размеру. Соцветия кремовобелые, пауковидные, 18-22 см в диаметре.
‘Гибридная форма № 10-16’. Растения 90-110 см высотой; цветоносные побеги средне-прочные, хорошо облиственные; листья зеленые, средние по размеру. Соцветия желтые, пауковидные, махровые и полумахровые, 16-20 см в диаметре.
‘Гибридная форма № 15-17’. Растения 100-110 см высотой; цветоносные побеги средне-прочные, хорошо облиственные; листья темно-зеленые, крупные. Соцветия розовато-белые, кудряво-отогнутые, махровые и полумахровые, 17-19 см в диаметре.
Рис. 1 Цветение изучаемых сортов хризантемы: А - ‘Мокрое Серебро’; Б - ‘Предрассветный Аю-Даг’; В - ‘Эльдорадо’; Г - ‘Эрмитаж’; Д - гибридная форма № 10-16; Е - гибридная форма № 15-17
Изучаемые генотипы среднего срока цветения, за исключением гибридной формы № 10-16 (поздний срок цветения).
В опыт был включен растительный материал, отобранный с растений, предварительно протестированных на вирусы. Тестирование и регестирование растений на вирусы осуществляли в соответствии с принятыми протоколами серологических (ИФА) и молекулярных (ПЦР) исследований [3].
Исследования по введению, оздоровлению и микроразмножению эксплантов 4 сортов и 2 гибридных форм хризантемы садовой в условиях in vitro выполнялись в
94
1SSN0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2021. Вып. 138
лаборатории биотехнологии и вирусологии растений НБС-ННЦ с использованием биотехнологических и вирусологических методов [1, 3, 13].
Верхушки и сегменты побегов с пазушными почками (1,5-2,0 см) последовательно стерилизовали растворами антисептиков: 50-70% раствором этанола (Россия), 1% раствором Thimerosal (Sigma, США) и 0,2-0,5% раствором ДезТаб (Китай) в разных концентрациях и экспозициях. В каждый раствор добавляли 2-3 капли детергента Tween 20 (Sigma, США). После каждого реагента экспланты 3-4 раза промывали стерильной дистиллированной водой. Апикальные меристемы размером 0,25-0,3 мм вычленяли из почек под бинокулярным микроскопом SMZ745T (Nikon, Япония). Затем первичные экспланты - меристемы и сегменты побегов с узлом (1,0 см) помещали в культуральные сосуды на питательные среды. Все эксперименты работы по культуре органов и тканей т vitro выполняли в стерильных условиях бокса биологической безопасности SC2 (ESCO, Сингапур). Для изучения процессов морфогенеза и микроразмножения эксплантов в качестве базовой использовали питательную среду Мурасиге и Скуга (Murashige, Skoog, 1962) [15]. В зависимости от поставленной задачи питательные среды дополняли 0,5-2,0 мг/л 6-БАП (6-бензиламинопурин, Duchefa Biochemie, Голландия), 0,5-2,0 мг/л кинетина (6-фурфуриламииопурии, Рапгеас, Испания), 2,5 мг/л аденин сульфата (6-аминопурин, Рапгеас, Испания), 0,1-0,5 мг/л НУК (а-нафгилуксусная кислота, Duchefa Biochemie, Голландия) в различных концентрациях и сочетаниях. Каждая среда содержала 20,0 г/л сахарозы и 9,0 г/л агара (Рапгеас, Испания). Контролем служила питательная среда без регуляторов роста. pH - 5,6-5,7. Все среды автоклавировали в стерилизаторе LAC 5060S (DAIHAN LABTECH, Южная Корея) при 1 атм, 120°С в течение 8-12 минут. Растворы регуляторов роста и витаминов стерилизовали через фильтры MILLEX®GP (0,22 pm) и добавляли в среды после автоклавирования. Для оздоровления от вирусной инфекции меристем, вегетативных почек и сегментов побегов с узлом применяли хемотерапию in vitro. В питательные среды при введении и первом субкультивировании вводили вироцид рибавирин (Virazole, l-P-D-Рибофуранозил-Ш-1,2,4-триазол-З-карбоксамид, Sigma, США) в концентрации 5,0-40,0 мг/л [4]. Контроль - экспланты без обработки рибавирином. Одновременно оценивали влияние вироцида и его концентраций на морфогенез исследуемых генотипов. Субкультивирование проводили каждые 2-3 недели. Культуральные сосуды с эксплантами содержали в фитокапсуле при 22 ± 1°С, 16-ч фотопериоде и интенсивности освещении 37,5 мкМ м'2 с"1 холодным белым светом флуоресцентных ламп (Philips TL, Япония). Часть эксплантов культивировали в камере моделирования климатических условий для роста растений MLR-352-PE (Panasonic, Япония). Полученные т vitro регенеранты хризантемы высаживали на адаптацию в вазоны объемом 0,25 л со смесью торфа (pH 5,0-5,6) и перлита в соотношении 2:1, помешали в климатические камеры MLR-352H-РЕ (Panasonic, Япония) и PGR 15 (Conviron, Канада), а затем переносили в теплицу.
Эксперименты проводили трижды в 20-кратной повторности. Статистическую обработку полученных данных выполняли с использованием программы STATISTIC А forWindows 10.0 (StatSoft, Inc.) и многорангового теста Дункана (р<0.05).
Результаты и обсуждение
Первым этапом введения первичных эксплантов в культуру in vitro является стерилизация. В процессе выполнения исследований разработаны способы стерилизации эксплантов хризантемы садовой. Показано, что более эффективной была последовательная ступенчатая стерилизация эксплантов растворами антисептиков (табл. 1).
ISSN0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2021. Вып. 138
95
Таблица1
Оптимальные способы стерилизации растительного материала хризантемы садовой
Способ стерилизации Количество эксплантов, свободных от контаминации, % Жизнеспособность эксплантов, %
стерилизующее вещество и его концентрация ЭКСПОЗИЦИЯ, мин
1 2 3 4
50% СТЬДОН 1
1% Thimerosal 7 54,4 de* 48,3 f
0,2 % р-р Дез ТАБ 7
70% СТЬДОН 1
1% Thimerosal 5 62,8 be 59,4 de
0,2% р-р Дез ТАБ 5
70% СТЬДОН 1
1% Thimerosal 7 69,5 ab 70,2 ab
0,2% р-р Дез ТАБ 7
50% С21ДОН 1
1% Thimerosal 7 72,0 ab 64,9 be
0,4% р-р Дез ТАБ 7
70% СТЬДОН 1
1% Thimerosal 5 72,4 ab 70,8 ab
0,4% р-р Дез ТАБ 5
70% СТЬДОН 1 91,6 a 95,2 a
1% Thimerosal 7
0,4% р-р Дез ТАБ 7
70% СТЬДОН 1 95,0 a 60,7 be
1% Thimerosal 7
0,5% р-р Дез ТАБ 10
*Среднее значение, обозначенное одной и той же буквой в столбцах, достоверно не отличается при уровне значимости Р <0,05 при использовании критерия многорангового теста Дункана.
Оптимальным способом стерилизации первичных эксплантов 4 сортов и 2 гибридных форм хризантемы садовой (апикальных частей побегов и сегментов с узлами) была последовательная стерилизация в 70% этаноле (1 мин), 1% растворе Thimerosal (7 мин) и 0,4% растворе ДезТаб (7 мин). При этом уровень контаминации составил 5-25%. Увеличение концентрации ДезТаб и экспозиции обработки приводило к снижению уровня контаминации, но при этом увеличивалось количество нежизнеспособных эксплантов.
В Никитском ботаническом саду поддерживается крупная и наиболее полная в России коллекция сортов и гибридных форм хризантемы садовой. В мире на этой культуре описано свыше двадцати различных вирусов [2, 14, 17]. Поэтому для исследований экспериментальный материал был отобран с внешне бессимптомных растений.
Анализ результатов, полученных нами, продемонстрировал эффективность совместного применения методов хемотерапии т vitro и культуры органов и тканей для оздоровления изучаемых генотипов. На этапе введения первичных эксплантов и после первого субкультивирования для элиминации вирусной инфекции в среды добавляли рибавирин в концентрации 5,0-40,0 мг/л. Выявлено незначительное стимулирующее влияние 5,0-10,0 мг/л рибавирина на частоту регенерации in vitro микропобегов хризантемы садовой. Безвирусные регенеранты были получены на среде с добавлением рибавирина в концентрации 20,0 мг/л Более высокая концентрация рибавирина -30,0 мг/л - ингибировала развитие микропобешв, значительно снижая частоту регенерации. Рибавирин в концентрации выше 40,0 мг/л вызывал некротизацию и гибель большинства микропобегов (рис. 2).
96
1SSN0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2021. Вып. 138
Основной Основной Основной Основной Основной Основной Концентрациярибавирина, мг/л
—♦— "Предрассветный Аю-Даг" —■— "Эльдорадо"
А "Мокрое Серебро" И "Эрмитаж"
—■— "Гибрид № 15-17" —•— "Гибрид № Ю-16"
Рис. 2 Влияние разных концентраций рибавирина на частоту регенерации in vitro сортов и гибридных форм хризантемы садовой
В экспериментах по изучению морфогенетического потенциала хризантемы садовой были определены оптимальные условия развития эксплантов на модифицированных питательных средах. При этом были отмечены существенные различия в количестве развившихся почек и микропобешв на эксплант, а также в средней длине побегов. Способность к регенерации и множественному побегообразованию изучали, используя различные концентрации цитокининов (БАП или кинетин) в сочетании с ауксином (НУК) в питательной среде МС. Инициация развития меристем происходила на 4-5 сутки культивирования, пазушных почек - через 8-10 суток. Спустя 12-14 суток культивирования у исследуемых сортов и гибридных форм наблюдали прямую регенерацию микропобегов и начало образования адвентивных почек. Пролиферация адвентивных побегов была отмечена через 3-4 недели.
По данным литературных источников [9, 12, 16, 20], авторы сообщали о максимальном количестве эксплантов, дающих пазушные и адвентивные побеги и наибольшее количество микропобегов/эксплант, полученных на МС среде, дополненной 1,0 мг/л БАП. В наших опытах на средах с регуляторами роста БАП или кинетин в концентрациях 1,0-2,0 мг/л активность пролиферации побегов снижалась. При этом процент образования микропобегов не превышал 45-50% из-за формирования микропобегов в базальной части эксплантов. Количество микропобегов/эксплант увеличивалось при невысокой концентрации цитокининов. Максимальное число микропобегов/эксплант получали на средах, где использовали 0,75 мг/л БАП или кинетина. Результаты, полученные нами и представленные в таблице 2, демонстрируют регенерационный потенциал микропобегов исследуемых сортов и гибридных форм хризантемы садовой после 3 и 6 субкультивирований на оптимальных питательных средах, разработанных нами для индукции адвентивных и пазушных почек, микропобегов при клональном микроразмножении 4 сортов и 2 гибридных форм хризантемы садовой. Лучшие результаты были получены на среде МС, дополненной 0,75 мг/л кинетина, 2,5 мг/л аденин сульфата и 0,25 мг/л НУК, индуцирующей множественное образование пазушных и адвентивных почек и микропобешв. Высоким регенерационным потенциалом обладали сорта ‘Предрассветный Аю-Даг‘, ‘Эльдорадо1, ‘Эрмитаж‘ и гибридные формы № 10-16 и № 15-17. Среди исследуемых сортов ‘Эрмитаж‘ и ‘Эльдорадо‘ по количеству микропобегов/эксплант (23,5 и 21,0 шг.) и их длине (7,84 и 8,10 см) превосходили другие сорта (табл. 2). В контроле количество микропобегов/эксплант в среднем составило 1-2 шг. В процессе экспериментов на среде
ISSN0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2021. Вып. 138
97
МС, дополненной 0,75 мг/л БАП и 0,25 мг/л НУК в основании микропобешв формировался плотный зеленый каллус, из которого были получены адвентивные почки и побеги. Активное развитие микропобегов на этой среде отмечено у сорта ‘Мокрое Серебро‘ (21,1 микропобег/эксплант при длине микропобега 5,5 см).
А
Рис. 3 Формирование адвентивных почек имикропобегов в базальной части микропобегов хризантемы садовой ‘Предрассветный Аю-Даг’ (А) и ‘Мокрое Серебро’ (Б) на питательной среде МС с 0,75 м| /.|БАПиО,25 мг/л НУК. Масштаб 1 см
Таблица2
Регенерационный потенциал сортов и гибридных форм хризантемы садовой при разных сроках культивирования in vitro на питательной среде МС, дополненной регуляторами роста
Сорт, гибридная форма Субкульти- вирование Длина побега, см K-bo дополнитель-ныхмикропобешв/ эксплант, hit. K-bo листьев/эксплант, HIT.
Контроль (без регуляторов роста)
Среднее по сортам з 1,24 gh 1,48 gh 3,75 l
М С + 0, 75 мг/л кинетина + 2/5мг/л аденин сулъфата+ 0,25 мг/л ШК
Гибридная форма о 3,83cd * 17,60bc 6,24 d
№ 10-16 6 6,47 ab 20,86 ab 21,10ab
Эльдорадо о 4,54 b 18,50 be 7,33 cd
6 8,10 a 21,25 a 22,63 ab
Г ибридная форма о 4,42 be 14,50 de 6,25 d
№15-17 6 5,64 ab 19,63 ab 20,45 ab
Предрассветный о Э 3,76 e 10,54 ef 6,10 ef
Аю-Даг 6 6,05 ab 19,86 ab 18,05 ab
Эрмитаж о 2) 4,23 c 18,62 ab 10,50 be
6 7,84 a 23,52 a 25,20 a
Мокрое Серебро о J 3,59 ef 14,62 cd 5,17 gh
6 5,22 ab 18,78 ab 14,20bc
MCgO, 75 мул БАП+ 0.25 мф НУК
Г ибридная форма о 3,50 c 15,26 ef 5,14 de
№ 10-16 6 4,22 ab 19,25 ab 16,75 ab
Эльдорадо о 3,98 b 16,89 b 5,20 cd
6 4,70 ab 19,40 ab 16,67 ab
Г ибридная форма о 2) 3,88 be ll,56hi 4,25 fg
№15-17 6 4,06 ab 15,89 cd 16,84 ab
Предрассветный о 2) 2,96 e 11,97 gh 5,80 be
Аю-Даг 6 4,28 ab 15,33 d 15,75 ab
Эрмитаж о 2) 3,37 d 17,14 ab 6,25 be
6 4,77 ab 19,75ab 18,40 a
Мокрое Серебро о 2) 4,22 ab 16,68 be 6,67 b
6 5,33 a 24,50 a 20,25 a
*Среднее значение, обозначенное одной и той же буквой в столбцах, достоверно не отличается при уровне значимости Р <0,05 при использовании критерия многорангового теста Дункана.
98
1SSN0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2021. Вып. 138
Таким образом, наши исследования подтверждают данные ряда авторов о том, что индукция морфогенеза и пути реализации морфогенетического потенциала зависят от происхождения, типа исходного экспланта и условий культивирования хризантемы садовой [3, 10, 11, 18, 19, 21].
Больший выход нормально развитых растений отмечали в апреле-августе и в октябре-ноябре, что, прежде всего, связано с состоянием маточных растений, с которых сняты сегменты побегов и изолированы меристемы. Укоренение микропобегов на питательной среде с кинетином и аденин сульфатом происходило спонтанно, что позволяет значительно ускорить процесс размножения (рис. 4).
Миниатюрные растеньица высотой 3-4 см с хорошо развитой корневой системой после ретестирования пересаживали в почвенный субстрат (рис. 4). Адаптацию проводили в изолированной теплице со стабильными условиями: температурой 20-22°С, относительной влажностью воздуха 70-80%, фотопериодом 14-16 часов, освещенностью 37,5 pmol m'V1 в первые 10 суток и 40,0-42,5 pmol m'V1 в последующие дни. Оздоровленные регенеранты высаживали на адаптацию в вазоны объемом 0,25 л со смесью торфа (pH 5,0-5,6) и перлита в соотношении 2:1. Ретестирование на отсутствие вирусов проводили, когда высота надземной части растений достигала 15 см.
Рис. 4 Спонтанное корнеобраювание на среде MS с 0.75 mg L"1 кинетина, 2.5 mg L"1 аденин сульфата и 0.25 mg L"1 НУК (А) и ex vitro адаптированные регенеранты хризантемы садовой ‘Эльдорадо’.
Масштаб 1 см
Выводы
Изучен мор фогенетический потенциал и показана возможность прямой регенерации хризантемы садовой сортов ‘Мокрое Серебро’ ‘Предрассветный Аю-Даг‘, ‘Эльдорадо’, ‘Эрмитаж’ и гибридных форм № 10-16 и № 15-17 из меристемы и сегментов побегов с узлом в зависимости от гормональных факторов культивирования. Выявлена индуцирующая роль регуляторов роста кинетина (0,75 мг/л), БАЛ (0,75 мг/л), аденин сульфата (2,5 мг/л) и НУК (0,25 мг/л) в питательной среде МС, обеспечивающих стабильную регенерацию микропобешв. Установлено, что сорта ‘Эльдорадо’ и ‘Эрмитаж’ обладали более высоким регенерационным потенциалом по сравнению с другими генотипами. Показана возможность корнеобразования и адаптации регенерантов исследуемых сортов хризантемы. Разработанные протоколы микроразмножения позволяют повысить эффективность размножения и сохранения т vitro 4 сортов хризантемы садовой.
Работа выполнена на базе Уникалъной научной установки «Научный центр биотехнологии, геномики и депонирования растений» (УНУ «ФИТОБИОГЕН») в рамках Госзадания№ 0829-2019-0038 ФГБУН «НБС-ННЦ»
ISSN0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2021. Вып. 138
99
Список литературы
1. Бутенко Р.Г. Культура изолированных тканей и физиология морфогенеза растений/ Р.Г. Бутенко - М.: Наука, 1964. - 272 с.
2. Закубанский А.В., Чирков С.Н., Митрофанова О.В., Митрофанова ИВ. Вирусы некоторых ценных плодовых, эфиромасличных и декоративных культур (обзор)// Бюллетень ГНБС. - 2016. - Вып. 121. - С. 7-18. - [Электронный ресурс]. -http ://bult. nbgnsc.ru/ download/121(2)/l-121-2016.pdf
3. Митрофанова О.В., Митрофанова И.В., Лесникова-Седошенко Н.П., Иванова Н.Н. Биотехнологии в оздоровлении растений и размножение безвируснош посадочного материала перспективных цветочно-декоративных культур// Методология биотехнологических исследований цветочно-декоративных культур: Коллективная монография/ под общ. ред. д.б.н. И.В. Митрофановой. - Симферополь: ИТ «АРИАЛ», 2018. - С. 43-152. DOI: 10.32514/978-5-907118-58-4
4. Митрофанова И.В., Митрофанова О.В., Иванова И.И., Егорова Н.А., Кузьмина Т.Н., Лесникова-Седошенко Н.П., Тевфик А.Ш., Челомбит С.В. Этапы регенерации in vitro декоративных, ароматических и плодовых культур // Основы создания генобанка in vitro видов, сортов и форм декоративных, ароматических и плодовых культур: Коллективная монография / под общ. ред. И.В. Митрофановой. -Симферополь: ИТ «АРИАЛ», 2018. - С. 27-126.
5. Смыкова Н.В., Копанъ Ю.Г., Андрюшенкова З.П. Хризантемы Никитского ботанического сада. - Симферополь: И Ор1анда, 2013. - 88 с.
6. Улановская И.В., Смыкова Н.В., Андрюшенкова З.П. Аннотированный каталог цветочно-декоративных растений коллекции Никитского ботанического сада. Том III. Коллекция хризантемы садовой, ириса гибридного / под общей ред. чл.-корр. РАН Ю.В. Плугатаря - Симферополь: ИТ "АРИАЛ", 2018. - 232 с.
7. Вапи N.A., Hossain М, Islam R, Biswas S.K. Chrysanthemum morifolium Ramat.:
an itr vitro Plantlets RegenerationProtocol Plant Environment Development. - 2014. - Vol.
3. - No. 2. -P. 36-39.
8. Datta S.K. Chrysanthemum morifolium Ramat. - a unique genetic material for breeding// Sci. Culture. -2013. - Vol. 79. - No. 7-8. -P. 307-313.
9. Hemlata C., Mahdi A. Optimization of Plant Growth Regulators fa Rapid Chrysanthemum Morifolium Shoot Multiplication // Inti. J. Scientific Research and Reviews. -2016. - Vol. 5. -No. 1. -P. 109-114. DOI:10.21859/ijb.l454
10. Kaul V., Miller RM, Hutchinson J.F., Richards D. Shoot regeneration from stem and leaf explants of Dendrathema grandiflora Tzvelev (syn. Chrysanthemum morifolium Ramat.) // Plant Cell Tissue Organ Cult. - 1990. - Vol. 21. - No. 1. - P. 21-30. DOI: http ://dx.doi.org/10.1007/BF00034487
11. Kazeroorriarr R, Motrscn’i A., Jati S.K., Tohidfar M Factors Influencing itr vitro Organogenesis of Chrysanthemum morifolium cv Resomee Splendid - Iranian J Biotech. -2018. - Vol. 16. - No. 2. -P. 1454
12. Keresa S., Mihovitovic A., Baric M, Zidovec V., Skelirr M The micropropagation of chrysanthemums via axillary shoot proliferation and highly efficient plant regeneration by somatic embryogenesis. African J. Biotechnology. - 2012. - Vol. 11. - No. 22. - P. 6027-6033. DOI: http://dx.doi.org/10.5897/AJB10.1976
13. Kyle L., Kleytr J., Scoggins H, Bridgetr M Plants from test tubes: An introduction of micropropagation. 4th ed. - Portland, Oregon: Timber Press, 2013. -274 p.
14. Mitrofarrova IV., Zakubanskiy A. V, Mitrofarrova О. V. Viruses infecting main ornamental plants: an overview // Ornamental Horticulture. - 2018. - Vol. 24. - No. 2. - P. 95-102. DOI: https://doi.org/10.14295/oh.v24i2/! 199
100
1SSN0513-1634 Бюллетень ГНБС. 2021. Вып. 138
15. Murashige I, Skoog F. A revised medium fix rapid growth and bioassays with tobacco tissue culture // Physiologia Plantarum. - Vol. 15. - No. 3. - P. 473-497. DOI: http ://dx.doi.org/l 0.1111/j.1399-3054.1962.tb08052. x
16. Nalini R, Anjarra J.M, Arathi C.S., Aswathy M., Ayana B., Bhuvaneswari R Effect of growth regulators on micropropagation of Chrysanthemum (Dendranthema grcmdiflora Ramat.) // Scrutiny Inti. Research J. Agricult., Plant Biotechnology and Bio Products. - 2016. - Vol. 3. - No. 4. - P. 7-9. - [Электронный ресурс]. -http://www. scrutiny j ournals. com
17. Rout G.R, Mohapatra A., Jain S.M Tissue culture of ornamental pot plant: A critical review on present scenario and future prospects // Biotechnology Advances. - Vol. 24. -P. 531-560. DOI: http://dx.doi.Org/10.1016/j.biotechadv.2006.05.001
18. Sarasan W., Cripps G., Ramsay M, Atherton C., McMichen M., Prendergast G.,
Rowntree J. Conservation in vitro of threatened plants - progress in the past decade // In Vitro Cell. Biol. Plant. - 2006. - Vol. 42. - No. 3. - P. 206-214. DOI:
http ://doi.org/10.1079/IVP2006769
19. Swarna RJ., Yeasmin I)., Md. Rahman M., Md. Alam F. Protocol on direct organogenesis in Chrysanthemum morifolium Ramat. // Int. J. Biosci. - 2016. - Vol. 9. -No. 4. -P. 123-137. DOI: http://dx.doi.Org/10.12692/ijb/9.4.123-1237
20. Teixeira da Silva J.A., Ruins D. Chrysanthemum biotechnology: discoveries from
the recent literature // Folia Hort. - 2014. - Vol. 26. - No. 2. - P. 67-77. DOI:
http://dx.doi.org/10.2478/fliort-2014-0007
21. Waseem K., Jilani MS., Khan MS., Kiran M., Khan G. Efficient in vitro regeneration of chrysanthemum {Chrysanthemum morifolium L.) plantlets from nodal segments // Afr. J. Biotechnol. - 2011. - Vol. 10. - No. 8. - P. 1477-1484. DOI: http://dx.doi.org/10.5897/AJB09.1820
22. Yesmirr S., Hashem A., Das K.C., Hasatr M.M., Islam MS. Efficient itr vitro regeneration of chrysanthemum {Chrysanthemum morifolium Ramat) through nodal explant culture //Nuclear Science and Applications. -2014. - Vol. 23. -No. 1-2. -P. 47-50.
Статья поступила в редакцию 10.08.2020 г.
Mitrofanova IV., Mitrofanova O.V., Lesnikova-Sedoshenko N.P., Smykova N.V. In vitro cleaning up and micropropagation of pers pective chrysanthemum cultivars and new hybrid forms of the Nikita Botanical Gardens’ breeding // Bull. Of the State Nikita Botan. Card. - 2021. - № 138. -P. 92-100
An m vitro micropropagation protocol has been developed for garden chrysanthemum cultivars Mokroe Serebro, Predrassvetnyiy Ayu-Dag, Eldorado, and Ermitage of the NBG’s breeding. 10-20 mg/1 of ribavirin promoted the primary explants cleaning up. A high frequency of regeneration of adventitious buds and microshoots was observed in cultivars Eldorado and Ermitage (21.0 and 23.5 microshoots/explant) cultured on MS medium with 0.75 mg/1 kinetin and Mokroe Serebro - on MS medium with 0.75 mg/1 BAP (24.5 microshoots/explant). Spontaneous root formation facilitated 100% rooting of microshoots.
Keywords: Chrysanthemum x morifolium; explant; ribavirin; in vitro regeneration
