CC BY
44
EVALUATION OF ANTRAL HEPATOPROTECTOR ACUTE TOXICITY IN ALTERNATIVE TEST-SYSTEMS
KuzminovB.P., MatysikS.I., ZazuliakT.S., MykytchakT.I.
ОЦ1НКА ГОСТРО1'ТОКСИЧНОСТ1 ГЕПАТОПРОТЕКТОРА АНТРАЛЮ НА АЛЬТЕРНАТИВНИХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ
1тчизнянии гепатопротектор ант-раль ефективно використовуеться для лкування гепатит1в р1зного генезу [1-3], атеросклерозу, ше-м1чноТ хвороби серця, порушень згортання крови [4], цукрового д1абету [5], обструктивно'У нефро-патп, ускладнено'У шфекцмно-запальним процесом, [6] тощо за ïx самост1Иного переб1гу i на тл1 хрошчно'У патологiï печшки [4]. Враховуючи фармакологiчнi ефек-ти антралю, можна передбачити Иого подальше активне впровад-ження у кшшчну практику, що сприятиме збiльшенню обсяпв Иого виробництва на вiтчизняниx пщприемствах. Вiдомо, що дiя лiкарськиx препара^в за умов про-мислового виробництва в^д^з-няеться вiд терапевтичного впли-ву, оскiльки ïxнi дози, тривалють та шляхи надходження можуть зми нюватися. Нинi випуск антралю здмснюеться за вiдсутностi Иого гiгiенiчниx нормативiв в об'ектах довкiлля. Сучаснi тдходи до оцн ки токсичностi xiмiчниx речовин передбачають проведення бiоте-стування шляхом застосування
КУЗЬМ1НОВ Б.П., МАТИС1КС.1., ЗАЗУЛЯКТ.С., МИКИТЧАКТ.1.*
ЛьвiвськиИ нацiональниИ медичниИ унiверситет iм. Данила Галицького,, *1нститут екологiï Карпат НАН Укра'Уни
УДК 614.35:615.244.099
Ключовi слова: антраль, токсичнють, Daphnia magna Straus.
альтернативних тест-систем, у т.ч. з залученням таких гiдробiонтiв, як Daphnia magna Straus [7, 9]. Таю до^дження стандартизован^ зокрема щодо стану культур та середовища для Ух культивування, подготовки проб для тестування та проведення гострих i хрошчних дослiдiв у багатьох краУнах, у тому чи^ й в Укра'Уш [10].
Метою даного дослiдження стало вивчення гостроУ токсичностi антралю на Daphnia magna Straus.
Об'ект i методи дослiдження. Вiтчизняний гепатопротектор синтетичного походження антраль - це таблетований препарат, заре-естрований в Укра'Унк Випускаеться у твердих желатинових капсулах (свпло-коричневого кольору - 0,1 г i коричневого - 0,2 г), яю мiстять гранулят свто-жовтого кольору з зеленуватим вiдтiнком. Кожна капсула мютить трис-{Ы-(2,3-диметил-фент) антранiлато}алюмiнiй - 0,1 або 0,2 г Розчиннють у рiзних роз-чинниках: помiрно розчинний у хлороформ^ практично нерозчинний у вод^ 96% етиловому спиртi, ацетон i гексанi. Нами проведено визна-чення гостроУ токсичностi антралю на 180 ювеншьних гiллястовусих рачках Daphnia magna Straus, яких розсаджували в емност об'емом 100 мл з середовищами культивування, до яких додавали рiзнi кон-центрацiУ препарату. Контрольну групу склали 30 особин, яю перебу-вали у чистому середовищi без додавання токсиканта. Тривалють експерименту становила 9б годин.
У контрольних й експеримен-тальних емностях використовува-
ОЦЕНКА ОСТРОЙ ТОКСИЧНОСТИ ГЕПАТОПРОТЕКТОРА АНТРАЛЯ НА АЛЬТЕРНАТИВНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ Кузьминов Б.П., Матысик С.И., Зазуляк Т.С., Мыкытчак Т.И.*
Львовский национальный медицинский университет им. Данила Галицкого, * Институт экологии Карпат НАН Украины
Целью данного исследования стало изучение острой токсичности антраля на Daphnia magna Straus. Материалы и методы исследования.
Определялась острая токсичность антраля в концентрациях 0,05; 0,10; 0,20; 0,50; 1,00 и 2,00 мг/л на 180 ювенильных ветвистоусых рачках Daphnia magna Straus. Контрольную группу составляли 30 особей, которые находились в чистой среде культивирования. Продолжительность эксперимента составляла 96 часов. Устанавливали токсичность по гибели не менее 50% испытуемых особей на протяжении 1; 6; 24; 48; 72 и 96 ч. Для вычисления ЛК50 использовали процент особей, погибших в опыте, относительно контроля. Процент смертности переводили в пробит, а концентрации вещества — в их десятичный логарифм. По этим величинам построили графики, из
которых по антилогарифмам концентрации в пробит со значением 5 определяли летальную концентрацию антраля для каждого периода эксперимента.
Результаты. Условия определения острой токсичности антраля на альтернативных тест-системах соблюдены, на что указывает смертность Daphnia magna Straus в контроле до 10%, а по экспозиции различными концентрациями препарата - не менее 50%. Установлена зависимость гибели Daphnia magna Straus от исследуемых концентраций антраля. Коэффициент корреляции между этими показателями на 24 ч составил 0,88; 48 ч — 0,98; 72 ч — 0,91 и 96 ч — 0,90 (р<0,05 во всех случаях). Рассчитано по графикам пробитных величин и десятичных логарифмов средние смертельные концентрации антраля (мг/л) для различной продолжительности биотестирования: на 48 ч — 3,7; 72 ч — 7,1; 96 ч — 2,5. Среднее значение ЛК50для антраля составляет 4,4 мг/л, а стандартное отклонение — 2,4 мг/л. Доказано, что слаботоксичной (2 класс токсичности) является концентрация антраля 2,0 мг/л. Ключевые слова: антраль, токсичность, Daphnia magna Straus.
© Ky3bMiHOB Б.П., Матиск С.1., Зазуляк Т.С., Микитчак Т.1.* СТАТТЯ, 2016.
43 Environment & Health №2 2016
ли водопров1дну воду, В1ДСТОЯ-ну протягом 3-х д1б, яку перед початком досл1д1в аерували. Якють водного середовища в1дпов1дала стандартизованим вимогам для проведення бю-тестування з використанням D. magna: насичення киснем перед проведенням експери-менту сягало 6,2 мг/л (за вимо-гами - понад 6 мг/л), тсля досшду - 2,9 мг/л (за вимога-ми - понад 2 мг/л); рН - 7,2-7,3 (за вимогами - 6,0-8,5), температура - 19-21еС (за вимогами - 20 ± 2еС) [7, 8, 10].
Перед проведенням бюте-стування придатнють культури D. magna визначали за Тхньою реакц1ею на еталонну токсичну речовину - двохромовокислий кал1й. Середня летальна кон-центрац1я (ЛК50) у цьому випадку склала 1,1 мг/л, що перебувае у межах експери-ментально встановленого д1а-пазону реагування тест-об'ек-та D. magna - 0,9-1,5 мг/л [8]. Розведення i вмют культури в1дпов1дали стандартизованим методичним вимогам [9, 10].
Визначали токсичнють таких концентрацм антралю: 0,05 мг/л; 0,10 мг/л; 0,20 мг/л; 0,50 мг/л; 1,00 мг/л i 2,00 мг/л. Основним критерiем токсично-стi була загибель не менше 50% тддосшдних особин протягом 1; 6; 24; 48; 72 i 96 годин. Для кожноТ концентрацiТ проводили по три паралельних дослiди на виживання D. magna. Для об-числення ЛК50 використовува-ли вiдсоток особин, як загинули у дослiдi вщносно контролю. Вiдсоток смертностi переводили у пробiти, а концентрацiТ речовини - в Т'хый десятковий логарифм. За цими величинами побудували графки, з яких за антилогарифмом концентраци до пробiту зi значенням 5 визначали летальну концентра-цiю антралю для кожного перю-ду експерименту [8, 10].
Результати дослiджень та Ух обговорення. Протягом 1 i 6 годин експерименту D. magna зберегли життедiяльнiсть за впливу дослщжуваних кон-центрацiй антралю (табл. 1).
За 24-годинноТ експозицiТ концентра^ею 2,00 мг/л загинули 1-2 особини. За 48 год. досшду смертнють спостер^а-лася за концентрацм 1,00 i 2,00 мг/л i становила 1-2 i 2-4 D. magna вщповщно. Наприкiнцi бiотестування (72 i 96 год.) летальнiсть виявлено за впли-
ву уах дослщжуваних концент-рацiй препарату. У контрольна групi загибель за трьома пара-лельними дослiдами спостери галася станом на 72 год. (1 особина) i 96 год. (2 особини).
У кожнш дослщшй емностi обраховано смертнють особин D. magna вщносно контролю (табл. 2).
Найменша досшджувана кон-центрацiя (0,05 мг/л) мае слаб-кий негативний вплив на виживання дафшй (смертнють -7-11% за 72 i 96 год.). Смертнють в емностях з концентра-щями 0,1-1,0 мг/л становила 25-36% станом на 96 год., проте ц показники перебувають за межами довiрчих Ытервашв для присвоення водному розчи-ну навiть найменшого класу ток-сичностi. Статистично достовiр-ною (50% i бiльше) смертнiсть була лише в емностях з найбть-шою концентрацiею (2,0 мг/л). Водночас у контролi смертнiсть сягала 3-7% за цей же перюд. Експеримент вважаеться досто-вiрним, якщо смертнють у конт-ролi не перевищуе 10%, а у дослiдi становить не менше 50% [8]. Пщ час цього бютестування цих умов було дотримано.
Рiзниця мiж кiлькiстю загиб-лих особин дафшй у паралельних дослiдах з однаковими кон-центрацiями антралю незнач-на. Стандартне вiдхилення для
цього показника пщ час 24 год. експерименту становило 0,6 особин, 48 год. - 0,6-1,0 особин, 72 год. - 0-1,2, 96 год. -0,6-1,5. Це свщчить про те, що вибiрки пщдослщних дафшй реагували майже однаково на дю препарату.
Взаемозв'язок мiж збтьшен-ням концентраци i смертнiстю ювенiльних особин D. magna е тюним i прямопропорцмним. Коефiцiент кореляцiТ мiж цими показниками для 24 год. стано-вив 0,88; 48 год. - 0,98; 72 год. - 0,91 i 96 год. - 0,90 (р<0,05 в уах випадках).
За графками пробiтних величин i десяткових логариф-мiв концентрацiй антралю (рис. 1-3) визначено ЛК^ (мг/л) для рiзноТ тривалостi бiотестуван-ня: для 48 год - 3,7; 72 год -7,1; 96 год - 2,5. Середне зна-чення ЛК50 для антралю становить 4,4 мг/л, а стандартне вщ-хилення - 2,4 мг/л.
Загалом дiя препарату на тест-об'екти вщбуваеться по-ступово, чим довше вона три-вае, тим вищою е смертнють ювентьних дафнiй. Водночас з тривалютю такоТ дiТ знижуеться летальна доза (рис. 4).
Через незначну смертнють у контролi ЛК^ для 48 год. е мен-шою, нiж для 72 год.
Пщ час експерименту дафнiТ активно плавали й фтьтрували
Таблиця 1
Ктькють живих особин Daphnia magna Straus пiд час бiотестування
Експозиц1я (год.)
Концентрац1я антралю, мг/л 1 6 24 48 72 96
1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3 1 2 3
0 (контроль) 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 10 10 9 9 10
0,05 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 9 9 8 8
0,10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 7 8 8 6 7 7
0,20 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 8 7 8 7 6
0,50 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 10 7 9 7 6 7 6
1,00 10 10 10 10 10 10 10 10 10 9 9 8 7 8 6 6 7 5
2,00 10 10 10 10 10 10 9 9 8 6 8 7 6 7 5 5 6 3
Таблиця 2
Смертнють особин Daphnia magna Straus вщносно контролю (%)
Концентрац1я антралю, мг/л Експозиц1я (год.)
1 6 24 48 72 96
0,05 0 0 0 0 7 11
0,10 0 0 0 0 21 28
0,20 0 0 0 0 18 25
0,50 0 0 0 0 21 32
1,00 0 0 0 13 28 36
2,00 0 0 13 30 38 50
№ 2 2016 Environment & Health 44
EVALUATION OF ANTRAL HEPATOPROTECTOR ACUTE TOXICITY IN ALTERNATIVE TEST-SYSTEMS Kuzminov B.P., Matysik S.I., Zazuliak T.S., Mykytchak T.I.*
Lviv Danylo Halytsky National Medical University *Institute of Ecology of the Carpathians, National Academy of Sciences of Ukraine
Objective. We studied the acute toxicity of Antral in Daphnia magna Straus.
Materials and methods. We determined the acute toxicity of Antral in the concentrations of 0.05; 0.10; 0.20; 0.50; 1.00 and2.00 mg/lamong 180 juvenile Daphnia magna Straus. The control group consisted of 30 individuals which were in the pure cultivation medium. The duration of the experiment made up 96 hours. The toxicity was determined by death not less than 50% of the experimental individuals during 1; 6; 24; 48; 72 and 96 hours. For LC50 calculation we used a percentage of the individuals perished in the experiment relative to the control. The percentage of mortality was transferred into probit and a concentration of the substance — into their decimal logarithm. According to these values
we had constructed the graphs from which we determined the lethal concentration of Antral by the antilogarithm of the concentration in probit with the meaning of 5 for each period of the experiment. Results. Conditions for the determination of Antral acute toxicity in the alternative test systems were satisfied, and mortality in Daphnia magna Straus to 10% in the control and less than 50% by the exposure of different concentrations of the preparation indicates it. Dependence of the death in Daphnia magna Straus from studied Antral concentrations was determined. Coefficient of correlation among these indicators for 24 h made up 0.88; for 48 h — 0.98; for 72 h — 0.91 and for 96 h — 0.90 (p<0.05 in all cases). Average lethal Antral concentrations (mg/l) for the biotests of different duration: for 48 h — 3.7; for 2 h — 7.1; for 96 h — 2.5 were calculated according to the graphs of probit values. Average meaning of LC50 for Antral makes up 4.4 mg/l, standard deviation - 2.4 mg/l. Antral concentration of 2.0 mg/l (Grade 2 of toxicity) was proved to be a weakly toxic one.
Keywords: antral, toxicity, Daphnia magna Straus.
водне середовище безпосе-редньо бУпя осаду антралю, який у водi не розчинився. Це також пщтверджуе слабку ток-сичнють препарату, якого тд-дослщш об'екти цУпеспрямова-но не уникали.
За смертнютю 50% тест-об'ек^в вщповщно до тривало-ст бютестування встановлено, що слаботоксичною (2 клас токсичности е лише концент-ра^я антралю 2,00 мг/л. Нижчi концентраци щеУ речовини не виявляють гостроУ летальноУ токсичность
Потрапляння антралю до природних водойм у концент-ра^ях, менших за 2 мг/л, е безпечним для водноУ бюти.
Висновки
1. Умови визначення гостроУ токсичност антралю на альтер-нативних тест-системах дотри-маы, на що вказуе смертнють Daphnia magna Straus у контро-лi до 10%, а за експозици рiзни-ми концентра^ями препарату
- не менше 50%.
2. Встановлено залежнють загибелi Daphnia magna Straus вщ доотджуваних концентра-цм антралю. Коефщент коре-ляци мiж цими показниками для 24 год. становив 0,88; 48 год. -0,98; 72 год. - 0,91; 96 год. -0,90 (р<0,05 в уах випадках).
3. Розраховано за графками проб^них величин i десяткових логарифмiв середн смертель-н концентрацю антралю (мг/л) для рiзноУ тривалост бютестування: для 48 год. - 3,7; 72 год.
- 7,1; 96 год. - 2,5. Середне значения ЛKjq для антралю ста-
45 Environment & Health №1 2016
новить 4,4 мг/л, стандартне вщхилення - 2,4 мг/л.
4. Доведено, що слаботоксичною (2 клас токсичности е концентра^я антралю 2,0 мг/л.
Л1ТЕРАТУРА
1. Фролов В.М. Антраль -эффективный препарат для
лечения заболеваний печени / В.М. Фролов, Г.С. Григорьева // УкраУнський медичний часопис. - 2003. - № 2 (34). - С. 65-68.
2. Колесникова Е.В. Неалкогольная жировая болезнь печени и артериальная гипертензия: чего мы достигли в понимании
Рисунок 2
ГГрафш для розрахунку ЛК50 за експозици 48 годин (у цьому i наступних рисунках: п - проб^)
Рисунок 2
Графш для розрахунку ЛК50 за експозици 72 години
проблемы / Е.В. Колесникова // УкраТнський медичний часопис. - 2014. - № 3 (101). - С. 61-66.
3. Бабак О.Я. Опыт применения препарата антраль в составе комплексной терапии неалкогольной жировой болезни печени / О.Я. Бабак, Г.Д. Фа-деенко, Е.В. Колесникова // Здоров'я УкраТни. - Темат. номер: Гастроентеролопя. Гепатолопя. Колопроктолопя. -2010. - № 1. - С. 26-27.
4. Мюце Антралю у комплексному л^ванш хворих з патолоп-ею печЫки [пщгот. О. Татаренко] // Здоров'я УкраТни. - Темат. номер: Гастроентеролопя. Гепатолопя. Колопроктолопя. -2010. - № 3. - С. 50-51.
5. Урбанович А.М. Неалкогольний стеатогепатиту патент з цукровим дiабетом 2-го типу: сучасний погляд на проблему [Електронний ресурс] / А.М. Урбанович. -Режим доступу : http://med-strana.com/articles/140.
6. Борисов С.О. Ефективнють препарату антраль у комплексному л^ванш обструктивноТ нефропатп та шфекцм сечових шляхiв / С.О. Борисов, Ф.1. Кос-тев // Сепсис, проблеми дiагно-стики, терапи та профТпактики :
наук.-практ. конф. з мiжнарод-ною участю: матер. конф. -Харюв, 2006. - С. 51-52.
7. Брагинский Л.П. Методологические аспекты токсикологического биотестирования на Daphnia magna Str. и других ветвистоусых ракообразных / Л.П. Брагинский // Гидробиологический журнал. - 2000. -
Т. 36, № 5.1. - С. 50-71.
8. Коновець 1.М. Бютестування токсичност поверхневих вод та донних вiдкладiв за допомогою пллястовусих ракоподiбних Daphnia magna Straus та Ceriodaphnia affinis Lilljeborg / 1.М. Коновець, Л.С. Кiпнiс // Методи гщроеколопчних дослiджень поверхневих вод. -К., 2006. - С. 361-385.
9. Методи гщроеколопчних дослщжень поверхневих вод ; за ред. В.Д. Романенко. - К. : Логос, 2006. - С. 340-364.
10. U.S. EPA. Short-term methods for estimation the chronic toxicity of effluents and receiving waters to freshwater organisms ; 2-nd ed. - Report EPA/600/4-89/001/ - 1989.
REFERENCES
1. Frolov V.M., Grigorieva H.S. Ukrainskyi medychnyi chasopys. 2003 ; № 2 (34) : 65-68 (in Russian).
Рисунок 3
Графш для розрахунку ЛК50 за експозицп 96 годин
6 5 4 3 2 1 0 ___
■
-1,5
-1
-0,5
0
0,5
Рисунок 4
Залежнють ЛК50 вщ часу дГГ рiзних концентрацш антралю
2. Kolesnikova E.V. Ukrainskyi medychnyi chasopys. 2014 ; № 3 (101) : 61-66 (in Russian).
3. Babak O.Ya., Fadeenko G.D., Kolesnikova E.V. Zdorovia Ukrainy (Hastroenterolohiia. Hepatolohiia. Koloproktolohiia). 2010 ; 1 : 26-27 (in Russian).
4. Tatarenko O. Zdoroviia Ukrainy (Hastroenterolohiia. Hepatolohiia. Koloproktolohiya). 2010 ; 3 : 50-51 (in Ukrainian).
5. Urbanovich A.M. Nealkoholnyi steatohepatyt u patsientiv z tsukrovym diabetom 2-go typu: suchasnyi pohliad na problemu [Nonalcoholic Steatohepatitis in the Patients with Non-Insulin Dependent Diabetes : A Modern Approach to a Problem]. Available at : http://medstrana.com/arti-cles/140 (in Ukrainian).
6. BorysovS.O., KostievF.I. Efektyvnist preparatu Antral v kom-pleksnomu likuvanni obstruktyvnoi nefropatii ta infektsii sechovykh shliakhiv [Efficiency of the Antral Preparation in a Complex Treatment of the Obstructive Nephropathy and Infections of Urinary Tract]. In : Sepsys, proble-my diahnostyky, terapii ta profilak-tyky: nauk.-prakt. konf. z mizhnar-odnoiu uchastiu: mater. konf. [Sepsis, Problems in Diagnostics, Therapy, and Prophylaxis : Sci.-Pract. Conf.: Conf. Mater.]. Kharkiv ; 2006 : 51-52 (in Ukrainian).
7. Braginskii L.P. Gidrobiologi-cheskii zhurnal. 2000 ; 36 (5.1) : 50-71 (in Russian).
8. Konovets I.M., Kipnis L.S. Biotestuvannia toksychnosti poverkhnevykh vod ta donnykh vidkladiv za dopomohoiu hillias-tovusykh rakopodibnykh Daphnia magna Straus ta Ceriodaphnia affinis Lillieborg [Biotesting of the Toxicity of Surface Water and Bottom Sediments with the Help of Daphnia Magna Straus and Ceriodaphnia Affinis Lilljeborg]. In : Metody hidroekolohichnykh doslidzhen poverkhnevykh vod [Methods for Hydroecological Research of the Surface Water]. Kyiv : Logos ; 2006 : 361-385
(in Ukrainian).
9. Romanenko V.D. (ed.) Metody hidroekolohichnykh doslidzhen poverkhnevykh vod [Methods for Hydroecological Research of the Surface Water]. Kyiv : Logos ; 2006 : 340-364 (in Ukrainian).
10. U.S. EPA. Short-term Methods for Estimation the Chronic Toxicity of Effluents and Receiving Waters to Freshwater Organisms. 2-nd ed. - Report EPA/600/4-89/001/ - 1989.
Hagwwna go pegaK^'i 20.01.2016
№ 2 2016 Environment & Health 46
1
