Оценка зависимости уровня γδТ-клеток у ВИЧ-инфицированных пациентов от уровня CD3+CD4+ Т-лимфоцитов Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

Медицинская иммунология 2010, Т. 12, № 4-5, стр. 425-428 © 2010, СПб РО РААКИ

Краткие сообщения

ОЦЕНКА ЗАВИСИМОСТИ УРОВНЯ /оТ-КЛЕТОК У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ

ПАЦИЕНТОВ от уровня CD3+CD4+

т-лимфоцитов

Зурочка А.В.1, Гаврилова Т.В.2, Шестакова Е.В.3, Квятковская С.В.3, Миркина Т.В.3, Черешнев В.А.4

Самостоятельный курс клинической лабораторной диагностики ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, г. Челябинск 2Пермская государственная медицинская академия имени академика Е.А. Вагнера, г. Пермь 3Клиника ГОУ ВПО ЧелГМА Росздрава, Центр по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями, г. Челябинск

Учреждение РАН НИИ иммунологии и физиологии Уро РАН, г. Екатеринбург

Резюме. Нами было проведено иммунофенотипирование лимфоцитов методом проточной цитометрии у 150 больных ВИЧ-инфекцией. Все обследованные лица были распределены на три группы в зависимости от абсолютного числа CD3+CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови согласно классификации стадий ВИЧ-инфекции у взрослых и подростков в редакции CDC (США). Выявлено, что снижение абсолютного уровня Т-хелперов с каждой последующей стадией заболевания сопровождается падением относительного и абсолютного числа лимфоцитов, общего числа Т-лимфоцитов, снижением абсолютного уровня цитотоксических Т-лимфоцитов при повышении их относительного числа, как следствие, падением соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+, снижением уровня дважды позитивной субпопуляции, снижение относительного и абсолютного уровня авТ-лимфоцитов и значительное падение абсолютного уровня у8Т-клеток при сохранном их относительном содержании. Все это также указывает на отсутствие иммунологической реактивности в ответ на длительно персистирующий в организме антиген.

Ключевые слова: ТуЬ-лимфоциты, ВИЧ-инфекция, Т-хелперы, цитотоксические Т-лимфоциты, иммунофенотипирование.

Zurochka A.V., Gavrilova T.V., Shestakova E.V., Kvyatkovskaya S.V., Mirkina T.V., Chereshnev V.A.

EVALUATION OF INTERDEPENDENCE BETWEEN yST-CELL LEVELS AND CD3+CD4+ T-LYMPHOCYTE coNTENTs iN HIv-INFEcTED RATIENTs

abstract. We have performed immunophenotyping of lymphocytes in 150 HIV-positive patients, by means of flow cytometry. All the persons under study were classified into three groups, depending on absolute contents of CD3+CD4+T-lymphocytes in peripheral blood, according to HIV infection staging in adults and adolescents, as amended by CDC (USA). It was revealed that, at each subsequent stage of disease, a decrease in absolute numbers of T-helpers is accompanied by drop in relative and absolute numbers of lymphocytes, as well as in total T-lymphocyte numbers, and decreased amounts of absolute cytotoxic T-lymphocytes levels, combined with increase in their relative contents, along with decreased CD3+CD4+/CD3+CD8+ ratio, diminished levels of double-positive subpopulation, decrease in relative and absolute levels of авТ-lymphocytes and significant drop in absolute levels of yS^cells, while their relative amounts remained normal. These findings demonstrate a pattern typical to the absence of immunological reactions in response to antigens persisting in the organism. (Med. Immunol., vol. 12, N 4-5, pp 425-428)

Keywords: PfS-lymphocytes, HIV infection, helper Т cells, cytotoxic T lymphocytes, immunophenotyping.

Адрес для переписки:

Зурочка Александр Владимирович, 454000 г.Челябинск, ул. Воровского, 15б, МЛЦ «Familia».

Тел.: 8-919-307-75-98.

E-mail: [email protected]

Введение

ySТ-лимфоциты впервые были описаны в середине 1980-х Saito et al. и Brenner et al. (1986) как гетерогенная субпопуляция Т-клеток с Т-клеточным рецептором, состоящим из у- и S-цепей (yS^R) [2, 4, 6]. У людей и многих животных большинство

425

Зурочка А.В. и др.

Медицинская Иммунология

Т-клеток экспрессируют Т-клеточный рецептор, состоящий из а- и в-цепей, и лишь небольшое количество Т-клеток несет Т-клеточный рецептор с у- и S-цепями. В отличие от авТ-клеток, у8Т-клетки напрямую распознают белковые и небелковые фосфолиганды без участия главного комплекса гистосовместимости. ySТ-клетки участвуют в антимикробном иммунитете и обладают эффекторными функциями. Роль ySТ-клеток в иммунных процессах при различных заболеваниях и их взаимодействие с другими клетками организма до сих пор остаются до конца не выясненными. Но уже накопилось достаточно информации, которая доказывает необходимость существования подобной популяции клеток. Известно, что VS1+yS вовлечены в механизмы местной иммунной защиты при ВИЧ- и цитомегало-вирусной (ЦМВ) инфекции и при определенных бактериальных инфекциях [3]. Так же оказалось, что ySТ-клетки оказывают цитотоксическое действие с участием механизмов апоптоза [1, 7]. Приведенные выше факты свидетельствуют в пользу того, что для более полной характеристики Т-клеток пациента анализ следует проводить не только по таким специфическим и безусловно важным при ВИЧ-инфекции маркерам как CD3+, CD3+CD4+ и CD3+CD8+, но и по наличию субпопуляций авТ-клеток и yS^ клеток. Важность определения последних очевидна при ВИЧ-инфекции, сопровождающейся длительной персистенцией антигена в организме на фоне депрессии Т-клеточного звена иммунной системы, для контроля эффективности терапии, прогноза развития и течения заболевания.

Материалы и методы

Нами было проведено исследование иммунного статуса 150 больных ВИЧ-инфекцией, средний возраст которых составил 30,9±5,8 лет. Все пациенты находились на диспансерном учете в Центре по профилактике и борьбе со СПИД и инфекционными заболеваниями Клиники ЧелГМА г. Челябинска. Мы распределили больных на три группы согласно классификации стадий ВИЧ-инфекции у взрослых и подростков в редакции CDC (США). В первую группу вошло 23 пациента с абсолютным числом CD4+ Т-лимфоцитов в периферической крови более 500 клеток/мкл. Вторую группу составили 69 человек с абсолютным числом CD4+Т-лимфоцитов 200-499 клеток/мкл. Третью группу составили 53 пациента с абсолютным уровнем CD4^-лимфоцитов менее 200 клеток/мкл. Различие показателей в зависимости от пола в обследуемых группах не имело статистической значимости, в связи с чем мы сочли возможным объединить пациентов без учета их половой принадлежности.

Для определения общего количества лейкоцитов, подсчета абсолютного и относительного соотношения лимфоцитов, моноцитов и грану-лоцитов, а также популяционного и субпопуляционного состава лимфоцитов методом проточной цитометрии кровь брали из локтевой вены в вакуумную пробирку, содержащую антикоагулянт K3EDTA (1,5±0,15 мг на 1 мл крови). Подсчет общего числа лейкоцитов проводился с использованием одно-платформенной технологии с помощью гетерогенного гейтирования по панлейкоцитарному маркеру CD45+ и показателям светорассеяния с применением калибровочных частиц Flow-Count Fluorespheres фирмы Beckman Coulter, США. Популяции лимфоцитов выделяли при помощи гетерогенного гейтирования — область событий, имеющих яркую флуоресценцию CD45-FITC и низкий уровень сигнала светорассеяния под углом 90° (SS), моноцитов — область событий, имеющих менее яркую флуоресценцию CD45-FITC и более высокий уровень сигнала светорассеяния под углом 90°, гранулоци-тов — область событий, имеющих самую низкую флуоресценцию CD45-FITC и высокий уровень сигнала светорассеяния под углом 90°.

С целью определения популяционного состава лимфоцитов для окрашивания нами были использованы четырехпараметрические реагенты линии IQTest: CD45-FITC/CD4-RD1/CD8-ECD/CD3-PC5, а также смесь монопараметрических реагентов CD45-PC5, TCR Pan ав-PE, TCR Pan yS-FITC фирмы Beckman Coulter, США. Наличие пан-Т-лимфоцитарного маркера CD3+ при отсутствии CD19+ характерно для Т-лимфоцитов; коэкспрессия CD3+ и CD4+ — для Т-хелперно/ индукторных лимфоцитов; коэкспрессия CD3+ и CD8+ — для T-цитотоксических лимфоцитов; коэкспрессия CD3+ и CD4+CD8+ — для субпопуляции дубльпозитивных Т-лимфоцитов, экспрессия CD3+ при отсутствии экспрессии CD4+ и CD8+ — для дважды негативной субпопуляции Т-лимфоцитов, коэкспрессия CD45+ и TCR Pan ав — для авТ-лимфоцитов, коэкспрессия CD45+ и TCR Pan yS — для ySТ-лимфоцитов.

Результаты

При анализе лейкограммы (табл. 1) нами выявлено падение от стадии к стадии общего уровня лейкоцитов, связанное с этом значительное снижение относительного и абсолютного числа лимфоцитов при переходе заболевания в последующие стадии и снижении уровня Т-хелперов, снижение абсолютного числа моноцитов, а также повышение относительного числа гранулоцитов в группах по сравнении с пациентами с уровнем Т-хелперов CD3+CD4+ более 500/мкл.

При анализе популяций лимфоцитов (табл. 2) нами выявлено значительное статистиче-

426

2010, Т. 12, № 4-5

у8Т-клетки при ВИЧ-инфекции

ТАБЛИЦА 1. ПОКАЗАТЕЛИ ЛЕЙКОГРАММЫ ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УРОВНЯ CD3+CD4+ (M±m)

Показатели обследованных лиц Группа 1 (CD3+CD4+ 500 клеток/мкл и более) Группа 2 (CD3+CD4+ 200-499 клеток/мкл) Группа 3 (СD3+CD4+ 199 и менее клеток/мкл)

n =28 n = 69 n = 53

Лейкоциты, х109/л 6,07±1,72 5,14±1,6* 4,4±1,7***

Гранулоциты, % 55,86±7,67 61,28±11,0* 63,4±13,9*

Гранулоциты, х109/л 3,45±1,3 3,24±1,47 2,93±1,46

Моноциты,% 8,11±1,79 8,41±2,9 8,7±2,8

Моноциты, 109/л 0,49±0,16 0,42±0,17* 0,38±0,17*

Лимфоциты, % 36,04±8,08 29,96±10,0* 25,1± 9,9***

Лимфоциты, х109/л 2,14±0,57 1,47±0,48* 1,04±0,36***

Примечание. * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни (р < 0,05); ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р < 0,05.

ски значимое снижение абсолютного уровня Т-лимфоцитов при переходе заболевания в последующие стадии, сопровождающееся падением относительного и абсолютного уровня Т-хелперов (CD3+CD4+) и ростом относительного уровня цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+), что обусловливает резкое снижение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+. Но при этом мы выявили снижение абсолютного числа CD3+CD8+ лимфоцитов в группах с уровнем Т-хелперов от 200 до 499/мкл и CD3+CD4+ менее 200/мкл, что связано со снижением общего числа Т-лимфоцитов. Со стороны дважды позитивной субпопуляции Т-лимфоцитов в исследуемых группах прослеживается снижение абсолютного их числа по сравнению с группой лиц с уровнем CD3+CD4+ более

500/мкл, при этом наблюдается рост абсолютного уровня дважды негативной субпопуляции Т-лимфоцитов, наблюдаемый во всех сравниваемых группах.

Так как популяция Т-лимфоцитов характеризуется такими двумя вариантами в зависимости от вида TcR, как авТ- и у8Т-клетки, то мы более подробно изучили их в зависимости от изменений уровня Т-хелперов. При анализе авТ- и у8Т- клеток мы выявили статистически значимое снижение во всех группах относительного и абсолютного уровня авТ-лимфоцитов, что связано также с падением общего числа Т-лимфоцитов и значительное падение абсолютного уровня у8Т-клеток в группах с уровнем CD3+CD4+ 200-499/мкл и CD3+CD4+ менее 200/мкл по сравнению с груп-

таблица 2. показатели иммунофенотипирования лимфоцитов вич-инфицированных лиц В зависимости ОТ уровня СD3+СD4+ (M±m)

Показатели обследованных лиц Группа 1 (СD3+СD4+ 500 кпеток/мкп и более) Группа 2 (CD3+CD4+ 200-499 клеток/мкл) Группа 3 (CD3+CD4+ 199 и менее клеток/мкл)

n =28 n = 69 n = 53

CD3+CD19-,% 75,88±7,49 79,46±6,9* 75,5±7,1**

CD3+CD19-, % 1650,0±542,37 1164,41±406,7* 784,4± 274,9***

CD3+CD4+,% 31,83±6,2 25,88±8,8* 12,3±5,0***

CD3+CD4+, абс 668,54±190,69 346,97±79,5* 120,2± 48,6***

CD3+CD8+,% 41,5±9,6 49,53±11,1* 57,3±9,0***

CD3+CD8+, абс 908,79±384,03 756,01±382,6* 598,1±241,8***

CD4+/CD8+, у.е. 0,83±0,36 0,58±0,3* 0,2±0,1***

CD3+CD4+CD8+,% 1,61±1,0 1,31±0,9 1,6±1,1

CD3+CD4+CD8+, абс 24,93±14,59 14,84±10,2* 17,2±17,6*

CD3+CD4-CD8-,% 5,24±2,19 6,96±3,3* 9,6±6,1***

CD3+CD4-CD8-, абс 86,5±45,63 79,93±45,1 85,0±72,0

Примечание. * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р < 0,05; ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р < 0,05.

427

Зурочка А.В. и др.

Медицинская Иммунология

ТАБЛИЦА 3. орТ-ЛИМФОЦИТОВ И убТ-ПИМФОЦИТОВ У ВИЧ-ИНФИЦИРОВАННЫХ ЛИЦ В ЗАВИСИМОСТИ ОТ УРОВНЯ CD3+CD4+ (M±m)

Показатели обследованных лиц Группа 1 (CD3+CD4+ 500 клеток/мкл и более) Группа 2 ^3^4+ 200-499 клеток/мкл) Группа 3 (СD3+СD4+ 199 и менее клеток/мкл)

n =28 n = 69 n = 53

арТ-лимфоциты, % 72,18±6,49 74,39±6,9 69,7±8,7**

арТ-лимфоциты, абс 1553,04±505,51 1091,45±391,7* 723,8±269,4* **

у8Т-лимфоциты,% 3,24±1,8 3,4±1,9 4,5±3,7

у8Т-лимфоциты, абс 70,5±47,66 48,97±31,9* 41,3±30,2*

Вирусная нагрузка 184,19±69,7 2261,2±2064,5* 572376±437603* **

Примечание: * - достоверность различий показателей в группах 2 и 3 по сравнению с группой 1 по U-критерию Манна-Уитни: р < 0,05; ** - достоверность различий показателей больных группы 3 по сравнению с группой 2 по U-критерию Манна-Уитни: р < 0,05.

пой лиц с уровнем CD3+CD4+ более 500/мкл при сохранном их относительном содержании. При этом мы наблюдаем рост уровня ВН, коррелирующий с падением уровня Т-хелперов (CD3+CD4+) (табл. 3). Все это также указывает на истощение резервов иммунной системы в ответ на длительно персистирующий в организме антиген.

Обсуждение

Таким образом, мы наблюдаем во всех исследуемых группах падение общего числа Т-лимфоцитов, снижение уровня как Т-хелперов, так и цитотоксических Т-лимфоцитов, как следствие падение соотношения CD3+CD4+/CD3+CD8+ (за счет более глубокого угнетения Т-хелперов), снижение уровня дважды позитивной субпопуляции, т.е. истощение всех субпопуляций Т-лимфоцитов, коррелирующее со стадией заболевания. Все это также указывает на отсутствие активности Т-клеточного звена иммунной системы в ответ на рост как количества, так и длительности персистенции антигена в организме. Помимо этого, снижение CD3+CD4+ клеток у ВИЧ-инфицированных лиц находится в тесной взаимосвязи с падением количества Т-клеток, несущих TCRy8 рецептор, что подтверждается данными зарубежных исследований [8] о положительной корреляции у8Т-клеток с уровнем CD3+CD4+ лимфоцитов. Это указывает на формирование нарушения ответа на антиген не только зависимого от главного комплекса гистосовместимости (MHC), но также и независимого от MHC. Механизмы количественного и качественного истощения субпопуляции у8Т-клеток неизвестны, частично потому, что эти клетки не несут рецептор CD4 и, следовательно, устойчивы к ВИЧ. Помимо этого в течение ВИЧ-инфекции, происходит ослабление функциональных способностей у8Т-лимфоцитов, что может влиять на прогрессирование заболевания [5].

Список литературы

1. Boullier S., Dadaglio G., Lafeuillade A. V delta 1 T cells expanded in the blood throughout HIV infection display a cytotoxic activity and are primed for TNF-alpha and INF-gamma production but are not selected in lymph nodes // J. Immunol. — 1997. - Vol. 159. - P. 3629-3667.

2. Bucy P, Chen C.L., Cihak J. Avian T-cells expressing y8 receptors localise in the splenic sinusoids and the intestinal epitelium // J. Immunol. — 1988. — Vol. 141. — P. 2200-2205.

3. Dechanet J., Merville P, Lim A. Implication of y8 T cells in human immune response to cytomegalovirus // J. Clin. Invest. — 1999. — Vol. 103. — P 1437-1449.

4. Hein WR., Mackay C.R. Prominance of y8 Т-cell in the ruminant immune system // Immunol. Today. — 1991. — Vol. 12. — P 30-34.

5. Kosub D.A., Lehrman G., Milush J.M. Gamma/ delta T-cell functional responses differ after pathogenic human immunodeficiency virus and nonpathogenic simian immunodeficiency virus infections // J. Virol. — 2008. — Vol. 82. — P 1155-1165.

6. Kuziel WA., Takashima A., Вonyhadi M. Regulation of T-cell receptor g chain expression in murine thy-1 (+) dendritic epidermal cells // Nature. — 1987. — Vol. 3238. — P. 263-266.

7. Li H., Peng H., Ma P, Pauza D., Shao Y. Association between Vy2V82 T cells and disease progression after infection with closely-related viral strains of HIV in China // Clin. Infect. Dis. — 2008. — Vol. 46. — P 1466-1472.

8. Pawelec G., Sayers T, Busch F. Regulation of normal myelopoiesis and chronic myelogenous leukemia cell proliferation through a non-cytotoxic mechanism by a y8 cell clone // M. Immunol. Lett. — 1989. — Vol. 22. — P 199-204.

поступила в редакцию 08.02.2010 принята к печати 15.02.2010

428