CC BY
114
Медицинская Иммунология 2008, Т. 10, № 4-5, стр. 463-466 © 2008, СПб РО РААКИ
Краткие сообщения
АНАЛИЗ КОНТРОЛЬНЫХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ «РЕПЛИКАТЫ Т-КЛЕТОК» И «СУММА Т-КЛЕТОК»
при исследовании иммунного статуса у вич-инфицированных больных и выявление дубль-негатибных
субпопуляций Т-ЛИМФОЦИТОВ
(CD45+CD3+CD4CD8)
Шестакова Е.В.1, Зурочка А.В.2, Квятковская С.В.1, Бецков С.Г.1, Дукардт В.В.1, Хайдуков С.В.3
1 Клиника ГОУ ВПО Челябинской государственной медицинской академии, г. Челябинск
2 ГОУ ВПО Челябинская государственная медицинская академия, г. Челябинск
3 Институт биоорганической химии им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН, Москва
Резюме. Нами было проанализировано использование аналитических контрольных показателей «репликаты Т-клеток» и «сумма Т-клеток» на примере 174 больных ВИЧ-инфекцией вне зависимости от возраста и стадии заболевания. Учитывая это, пациенты были разделены нами на 2 группы. Больные, у которых сумма CD45+CD3+CD4+ и CD45+CD3+CD8+ лимфоцитов совпадает с процентным и абсолютным содержанием CD45+CD3+ лимфоцитов, либо разница несовпадения абсолютных значений не превышает разницу «репликатов Т-клеток». Лица этой группы составили 36,78%. Пациенты, у которых сумма CD45+CD3+CD4+ лимфоцитов и CD45+CD3+CD8+ меньше процентного и абсолютного содержания CD45+CD3+, либо разница несовпадения абсолютных значений превышает разницу «репликатов Т-клеток» (41,38% больных). Подобное несовпадение контрольных сумм может быть связано с высоким содержанием в образце yS-Т-клеток, имеющих дважды негативный фенотип CD45+CD3+CD4CD8-.
Ключевые слова: проточная цитометрия, T-клетки, ВИЧ.
Shestakova E.V., Zurochka A.V., Kviatkovskaya S.V., Betskov S.G., Dukardt V.V., Haidukov S.V.
ANALYSIS OF CONTROL MEASUREMENTS OF «Т-CELL REPLICATES» AND «Т-CELL SUMMARY»
in investigation of the immune status of hiv-infected patients and DETECTION
DOUBLE NEGATIVE SUBPOPULATION OF T-LYMPHOCYTES (CD45+CD3+CD4CD8)
Abstract. We analyzed efficiency of application for analytic control parameters, i.e., «T-cell replicates» and «T-cell summary» in a sample of 174 HIV-infected patients, independently of age or disease stage. The patients were divided in two groups. Group 1 consisted of patients with total CD45+CD3+CD4+ and CD45+CD3+CD8+ lymphocyte concentrations being similar to relative and absolute concentrations
Адрес для переписки:
Хайдуков Сергей Валерьевич
Институт биоорганической химии
им. акад. М.М. Шемякина и Ю.А. Овчинникова РАН,
117997, Москва, ул. Миклухо-Маклая, 16/10.
Тел.: (495) 336-02-55.
E-mail: [email protected]
463
Шестакова Е.В. и др.
Медицинская Иммунология
of CD45+CD3+ lymphocytes, or the difference between absolute measurements not exceeding «T-cell replicates» differences. Group 1 included 36.78% of the whole cohort. Group 2 consisted of patients with total CD45+CD3+CD4+ & CD45+CD3+CD8+ lymphocytes concentrations being lower than relative and absolute concentrations of CD45+CD3+ lymphocytes, and the differences in absolute values being higher than «T-cell replicates» differences (41.38% of total sample). Such difference between control sums may be connected with high concentrations of double-negative yS-T-cells (CD45+CD3+CD4CD8) in the specimens under study. (Med. Immunol., 2008, vol. 10, N4-5, pp 463-466)
Введение
В диагностике и прогнозировании заболеваний, обусловленных иммунодефицитом, в частности при ВИЧ-инфекции, чрезвычайно важное значение имеет определение относительных и абсолютных концентраций Т-лимфоцитов (CD3+), Т-хелперов (CD3+CD4+) и цитотоксических Т-лимфоцитов (CD3+CD8+). В данном случае происходит критическое нарушение функционирования защитных сил организма преимущественно за счет селективной гибели Т-хелперов (CD3+CD4+). Прогрессивное ухудшение клинической и иммунологической картины в значительной степени коррелирует со снижением концентрации CD3+CD4+ лимфоцитов в периферической крови. Выявление точных абсолютных значений концентрации данной субпопуляции лимфоцитов является наиболее важным параметром для уточнения стадии заболевания и принятия решения о назначении пациенту антиретровирусной и патогенетической терапии.
Приказами Минздрава РФ от 26.05.2003 № 220 «Правила проведения внутрилабораторного контроля качества количественных методов клинических лабораторных исследований с использованием контрольных материалов» и от 02.02.2000
100 101 102 103
CD45-FITC
Рисунок 1. Двухпараметрическая гистограмма распределения клеток по флуоресценции и светорассеянию под углом 90° для выделения области лимфоцитов
№ 45 «О системе мер по повышению качества клинических лабораторных исследований в учреждениях здравоохранения Российской Федерации» отмечается важная роль контроля качества проводимых исследований. В связи с изложенным выше, одним из основных условий корректной оценки иммунного статуса пациентов является постоянное проведение внутрилабораторного контроля качества. Для этих целей необходимо посредством аттестованных контрольных материалов с известными значениями контролировать состояния проточного цитометра и оценивать качество проведения пре- и аналитического этапов исследования (пробоподготовка, реакционная способность антител и т.д.) [1, 2].
Кроме изложенного выше и согласно общепринятым рекомендациям, в процессе непосредственного выполнения каждого исследования необходимо проведение аналитического контроля качества с учетом следующих контрольных показателей: «репликаты Т-клеток» и «сумма Т-клеток» [1, 2].
Целью данной работы была проверка эффективности использования данных показателей аналитического контроля при ежедневном выполнении внутрилабораторного контроля качества на базе лаборатории прочной цитометриии центра СПИД Клиники ЧГМА.
Материалы и методы
Исследование иммунного статуса у пациентов, инфицированных вирусом иммунодефицита человека (ВИЧ), в рамках Национального проекта «Здоровье», проводилось методом проточной цитометрии с использованием прямой иммунофлуоресценции цельной периферической крови и «безотмывочной» технологии.
Клетки периферической крови окрашивали трехцветными комбинациями моноклональных антител к CD45/CD4/CD3 и CD45/CD8/CD3, конъюгированных с флуоресцентными красителями FITC/PE/PC5. Окрашенные образцы анализировали на проточном цитометре EPICS XL («Beckman Coulter», США) с помощью мультипараметрического анализа. Данный тест основан на способности моноклональных антител специфически взаимодействовать с дискретными антигенными детерминантами, экспрессированными на поверхности лейкоцитов. Данная процедура
464
2008, Т. 10, № 4-5
Анализ контрольных показателей...
позволяла вести одновременную идентификацию и подсчет общего количества Т-лимфоцитов (CD45+CD3+), общего количества Т-хелперов (CD45+CD3+CD4+) и общего количества цитотоксических Т-лимфоцитов (CD45+CD3+CD8+). Эритроциты удаляли из исследуемых образцов за счет прямого лизиса с использованием лизирующих и фиксирующих реагентов ImmunoPrep Reagent System и автоматической рабочей станции Q-PREP («Beckman Coulter», США). Популяцию лимфоцитов выделяли при помощи гетерогенного гейтирования [область событий, имеющих яркую флуоресценцию CD45-FITC и низкий уровень сигнала светорассеяния под углом 90о (SS)] (рис. 1). Подсчет абсолютного количества клеток проводился с использованием одноплатформенной технологии и референс-ных частиц Flow-Count Fluorespheres («Beckman Coulter», США).
Оценку качества работы цитометра проводили ежедневно, включая проверку сигналов светорассеяния и флуоресценции с использованием калибровочных частиц Flow Check Fluorespheres («Beckman Coulter», США) и стандартных настроечных протоколов. Качество аналитического этапа оценивали путем окрашивания контрольного материала Immuno-Trol Cells («Beckman Coulter», США) с заведомо известным диапазоном допустимых значений относительного и абсолютного количества позитивных клеток. Контрольные образцы анализировали в тех же условиях, что и опытные, с использованием тех же реагентов, концентраций и стандартных рабочих протоколов настройки цитометра. После приведенных выше процедур оценивали относительные и абсолютные количества Т-лимфоцитов (CD45+CD3+), Т-хелперов (CD45+CD3+CD4+) и Т-цитотоксических (CD45+CD3+CD8+) лимфоцитов.
В ходе выполнения каждого анализа проверяли контрольные показатели «репликаты Т-клеток» (рекомендованная разница в содержании субпопуляции CD45+CD3+ клеток в каждой пробирке не должна превышать 2%). Другим контрольным показателем была «сумма Т-клеток». Она представляет собой сумму как относительного, так и абсолютного содержания Т-хелперов (CD45+CD3+CD4+) и цитотоксиче-
ТАБЛИЦА 1. АТТЕСТОВАННЫЕ ЗНАЧЕНИЯ КОНТРОЛЬНОГО МАТЕРИАЛА IMMUNO-TROL CELLS
(по данным «beckman coulter»)
LY% ±2s Cells/pL ±2s
CD3+ 71 9 799 260
CD3+/CD4+ 45 9 518 165
CD3+/CD8+ 23 6 259 118
ских Т-лимфоцитов (CD45+CD3+CD8+) и должна быть равна значению относительного и абсолютного содержания Т-лимфоцитов (CD45+CD3+), причем разброс не должен превышать ±5%.
Результаты и обсуждение
Анализ работы проточного цитофлуориметра EPICS XL показал высокую стабильность работы прибора, причем коэффициенты вариаций (CV) на каналах флуоресценции FL1, FL2, FL3 и FL4 находились в допустимых пределах (< 1,5%). В свою очередь коэффициент вариаций на канале малоуглового светорассеяния FS находился в диапазоне < 1,3%. Стандартным отклонением для всех параметров было < 0,11.
Проведение внутрилабораторного контроля качества с использованием аттестованного контрольного материала Immuno Trol и встроенного программного обеспечения (QC) позволило определить средние значения положения максимума пика позитивных клеток, их коэффициенты вариаций и значения стандартного отклонения. Эти параметры были получены как для относительных, так и для абсолютных показателей Т-лимфоцитов (CD45+CD3+), Т-хелперов (CD45+CD3+CD4+) и цитотоксических (CD45+CD3+CD8+) Т-лимфоцитов.
Ниже приведены таблицы допустимых значений, полученные от производителей контрольных материалов (табл. 1) и значения, полученные в результате проведения контроля качества в лаборатории (табл. 2).
Полученные данные свидетельствуют об удовлетворительном прохождении лабораторией внутреннего контроля качества и высокой точности как на преаналитическом, так и аналитическом этапах работы.
На следующем этапе было проверено использование аналитических контрольных показателей «репликаты Т-клеток» и «сумма Т-клеток» на примере 174 больных ВИЧ-инфекцией вне зависимости от возраста и стадии заболевания.
При использовании аналитического контрольного показателя «репликаты Т-клеток» рекомендован только процентный разброс (±2%) и не указаны рекомендуемые разбросы в определении абсолютного числа Т-лимфоцитов. Однако
таблица 2. значения контрольного материала immuno-trol cells (по данным лаборатории проточной цитометрии центра спид)
LY% ±2s Cells/pL ±2s
CD3+ 71,1 2,34 752,5 71
CD3+/CD4+ 45,5 2,6 480 50,2
CD3+/CD8+ 21,9 1,42 255 29
465
Шестакова Е.В. и др.
Медицинская Иммунология
абсолютное число Т-лимфоцитов является более важным показателем при определении уровня Т-хелперов при использовании одноплатформенной технологии. Таким образом, для определения границ допустимых вариаций было применено четвертое правило Вестгардта (R4S), используемое для выявления случайных ошибок в пределах одной аналитической серии в случае, когда расстояние между результатами измерения контрольного материала в данной аналитической серии составляло более 4S.
В свою очередь, внутрилабораторный контроль качества проводимых процедур выявил, что значение стандартного отклонения для абсолютного числа Т-лимфоцитов составляло 35,5 клеток/мкл (табл. 1).
Исходя из приведенного выше, анализ контрольного показателя «репликатов Т-клеток» у пациентов с разницей относительного содержания CD45+CD3+лимфоцитов в разных пробирках, превышающей 2%, был расценен как проявление случайной ошибки. То же относилось и к абсолютным значениям CD45+CD3+ лимфоцитов, превышающим 140 клеток/мкл. По-видимому, это было связано с погрешностями на этапах пробоподготовки (неточность дозирования, плохое перемешивание крови и т.д.). Данные образцы отправляли на повторное исследование. В результате, данную особенность выявили у 21,8% (38 человек) пациентов.
Данные цитометрического анализа остальных пациентов были использованы для оценки аналитического контрольного показателя «сумма Т-клеток». Сумма как относительного, так и абсолютного содержания CD45+CD3+CD4+ и CD45+CD3+CD8+ клеток в конечном итоге должна быть равна как относительному, так и абсолютному содержанию CD45+CD3+ клеток и не превышать ±5%.
В результате проделанной работы обследованные пациенты были разделены на 2 группы:
1) Сумма CD45+CD3+CD4+ и CD45+CD3+CD8+ лимфоцитов у которых совпадает с относительным и абсолютным содержанием CD45+CD3+ лейкоцитов, либо несовпадение абсолютных значений не превышает разницу «репликатов Т-клеток». Пациенты этой группы составили 36,78% (64 человека)
2) Сумма CD45+CD3+CD4+ и CD45+CD3+CD8+ лимфоцитов у которых меньше относительного и абсолютного содержания CD45+CD3+ лейкоцитов, и это несовпадение абсолютных значений превышает разницу «репликатов Т-клеток». Пациенты этой группы составили 41,38% (72 человека).
Согласно литературным данным, подобное несовпадение контрольных сумм может быть связано с высоким содержанием в образце yS-Т-клеток, которые достаточно часто представлены дубль-негативным фенотипом CD45+CD3+CD4—CD8— [2,3,6]. Данный эффект особенно проявляется как у ВИЧ-инфицированных [5], так и у пациентов с цито-мегаловирусной инфекцией [4].
Заключение
Таким образом, для повышения аналитической точности работы и выявления случайных ошибок необходимо использовать оценку не только относительных, но и абсолютных значений «репликатов Т-клеток». Также необходимо учитывать данные допустимых отклонений, полученные в результате ежедневного анализа контрольного материала. Достаточно высокий процент пациентов, включенных во вторую группу с несовпадением контрольных сумм абсолютных и относительных значений, свидетельствует о необходимости дальнейшего более подробного исследования дубль-негативных субпопуляций Т-лимфоцитов, в частности yS-Т-клеток.
Список литературы
1. ВИЧ-инфекция // Информационный бюллетень № 28. — М., 2006. — 24 с.
2. Canadian Guidelines for Flow Cytometric Im-munophenotyping. 2001. Edition.
3. De Paoli P., Gennari D., Martelli P, Basa-glia G., Crovatto M., Battistin S., Santini G. A subset of gamma delta lymphocytes is increased during HIV-1 infection // Clin. Exp. Immunol. — 1991. — Vol. 83. - P. 187-191.
4. Dechanet J., Merville P, Lim A., Retiere C., Pitard V, Lafarge X., Michelson S., Meric C., Hal-let M.M., Kourilsky P, Bonneville M., Moreau J.F. Implication of yST cells in the human immune response to cytomegalovirus // J. Clin. Invest. — 1999. — Vol. 103. — P 1437-1449.
5. Lambert C., Genin C. CD3 bright lymphocyte population revel gamma delta T cells // Cytometry B. Clin. Cytom. — 2004. — Vol. 61, N 1. — P 45-53.
6. Margolick J.B., Scott E.R., Odaka N., Saah A.J. Flow Cytometric analysis of gamma delta T cells and natural killer cells in HIV-1 infection // Clin. Immunol. Immunopathol. — 1991. — Vol. 58. — P 126-138.
поступила в редакцию 30.06.2007 принята к печати 13.09.2007
466
