CC BY
222
Оценка зараженности клещей вирусом клещевого энцефалита с использованием различных методов исследования. Неоднозначность трактовки результатов
И.С. Холодилов1 ([email protected]), О.А. Белова1- 5 ([email protected]), О.В. Мотузова1 3 ([email protected]), А.П. Гмыль1- 2 ([email protected]), Л.Ю. Романова1 ([email protected]), В.А. Бойко4 ([email protected]), Р.А. Крючков4 ([email protected]), О.Е. Орлова3 ([email protected]), Н.Д. Пакскина6 ([email protected]), А.Ф. Шамсутдинов4 ([email protected]), Г.Г. Карганова1, 2 ([email protected])
1ФГБУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова» РАМН, Москва
2ФГБОУ ВПО «Московский государственный университет им. М.В. Ломоносова», биологический факультет
3ФГБУ «Научный центр акушерства, гинекологии и перинатологии им. акад. В.И. Кулакова» Минздрава России, Москва 4ФБУН «Казанский НИИ эпидемиологии и микробиологии» Роспотребнадзора 5ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва 6Федеральная служба в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека, Москва
Резюме
По данным Роспотребнадзора, выявляемость вируса клещевого энцефалита (ВКЭ) в клещах с помощью иммуноферментного анализа (ИФА) значительно выше, чем при использовании полимеразной цепной реакции (ПЦР). Мы предположили, что это может быть обусловлено: 1) перекрестной реакцией с уже известными вирусами, входящими в род Flavivirus; 2) циркуляцией неизвестного флавивируса, антигенно близкого к ВКЭ; 3) перекрестной реакцией с микроорганизмами, обитающими в клещах; 4) нарушением протокола постановки ИФА. В представленной работе мы постарались выявить факторы, влияющие на специфичность и чувствительность ИФА и ПЦР. Для оценки возможных перекрестных реакций с вирусами, входящими в род Flavivirus, были исследованы штаммы ВКЭ (представители трех основных генотипов), вирус омской геморрагической лихорадки, вирус Лангат и вирус шотландского энцефаломиелита овец (ШЭО). Коммерческий набор на основе ИФА (ВектоВКЭ-антиген,ЗАО«Вектор-Бест») выявлял все исследованные вирусы рода Flavivirus, но в разных концентрациях. Коммерческий набор на основе ПЦР в режиме реального времени (ПЦР-РВ) (ИнтерЛабСервис, АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum, E. chaffeensis/ E. muris-FL) выявлял три генотипа ВКЭ и вирус ШЭО.
Исследование экспериментально зараженных ВКЭ клещей из лабораторной культуры показало, что ПЦР-РВ и ПЦР с последующим электрофоретическим анализом (ОТ-ПЦР) значительно более чувствительны, чем ИФА, а нарушение протокола пробопод-готовки снижает чувствительность ИФА более чем в два раза.
Исследование возможных перекрестных реакций с микроорганизмами, обитающими в клещах, проводили с помощью ИФА и ОТ-ПЦР на клещах, собранных из природы на территории Московской области и Республики Татарстан. В ОТ-ПЦР все клещевые суспензии показали отрицательный результат. При исследовании с помощью ИФА 34% клещевых суспензий оказались положительными на наличие антигена ВКЭ. Из положительных в ИФА клещевых суспензий были выделены чистые культуры микроорганизмов. Из них были получены суспензии, которые после уравнивания по общему белку проверили на наличие антигена ВКЭ в коммерческом наборе на основе ИФА. Четыре суспензии микроорганизмов из 15-ти показали положительные результаты. Были сделаны попытки выявления в клещах с помощью ОТ-ПЦР флавивируса, не являющегося ВКЭ, с использованием родоспе-цифических праймеров. При исследовании клещей из Московской области и Республики Татарстан вирусную РНК выявить не удалось. Мы также проанализировали 128 клещей из Республики Тыва. Выявить флавивирус, не являющийся ВКЭ, не удалось, однако были обнаружены четыре пробы, содержащие продукт ПЦР с длиной, близкой к ожидаемой. Для них была определена нуклеотидная последовательность, которая соответствовала фрагменту генома бактерии рода Pseudomonas. Один вид из представителей этого рода давал положительный результат и в ИФА.
Таким образом, представленные данные показывают, что все методы могут давать ложноположительные реакции при выявлении ВКЭ в полевом материале за счет взаимодействия с другими флавивирусами или микроорганизмами, обитающими в клещах. ОТ-ПЦР и ПЦР-РВ значительно более чувствительны и специфичны, чем ИФА. Для установления циркуляции ВКЭ на новых территориях и в спорных случаях необходимо определение нуклеотидной последовательности продукта ПЦР для идентификации инфекционного агента.
Ключевые слова: вирус клещевого энцефалита, Flavivirus, иммуноферментный анализ, полимеразная цепная реакция, вирусо-форность клещей, антигенный перекрест, микрофлора клещей
Ambiguous Interpretation of the Results of TBEV prevalence in Ticks Evaluation Using Different Methods
I.S. Kholodilov1 ([email protected]), O.A. Belova1 5 ([email protected]), O.V. Motuzova13 ([email protected]), A.P. Gmyl112 ([email protected]), L.Yu. Romanova1 ([email protected]), V.A. Boiko4 ([email protected]), R.A. Kryuchkov4 ([email protected]), O.E. Orlova3 ([email protected]), N.D. Pakskina6 ([email protected]), A.F. Shamsutdinov4 ([email protected]), G.G. Karganova1,2 ([email protected])
1Federal State Budget Institution «M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides» Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
2Federal State Educational Institution of Higher Professional Education M.V. Lomonosov Moscow State University, Faculty of Biology 3Federal State Budget Institution «V.I. Kulakov Research Center for Obstetrics, Gynecology and Perinatology» of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Moscow
4Federal Budget Institution of Science «Каzan' Research Institute of Epidemiology & Microbiology» of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance
5Federal Budget Institution of Science «Central Research Institute of Epidemiology» of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Moscow
6Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance, Moscow Abstract
According to data of Federal Service on Customers' Rights Protection and Human Well-Being Surveillance tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalence in ticks, determined by enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA), is several times higher than those determined by polymerase chain reaction (PCR). We assumed that this fact can be explained by: 1) serological cross-reaction with known viruses of the genus Flavivirus; 2) circulation of unknown flavivirus, antigenically close to TBEV; 3) serological cross-reaction with microorganisms that inhabit ticks; 4) violation of ELISA protocol. In this study we tried to find out factors affecting specificity and sensitivity of these methods. We used three TBEV strains representing the main subtypes, Omsk hemorrhagic fever virus, Langat virus, and Louping ill virus to evaluate possible cross-reactions with viruses of the genus Flavivirus. A commercial ELISA-based kit (VectoTBE-antigen, JSC «Vector-Best») detected all studied viruses of the genus Flavivirus, but in various concentrations. A commercial kit based on Real-Time PCR (AmpliSens® TBEV, B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum, E. chaffeensis/E. muris-FL, InterLabService) detected three TBEV subtypes and Louping ill virus.
Analysis of experimentally TBEV infected ticks from laboratory line has shown that Real-Time PCR and PCR with electrophoretic detection of the product (RT-PCR) are significantly more sensitive than ELISA. Moreover, violation of sample preparation protocol of ELISA kit reduced sensitivity of this method in more than 2 times.
Investigation of possible cross-reactions with microorganisms that inhabit ticks using ELISA and RT-PCR was performed on field-collected ticks from Moscow region and Republic of Tatarstan. All tick suspensions showed negative results in RT-PCR. When examined by ELISA, 34% ticks showed positive results on the presence of TBEV antigen. We isolated pure cultures of microorganisms from ELISA-positive tick suspensions, equilibrated them by total protein using Bradford's method and tested in commercial ELISA-based kit on TBEV antigen presence. Positive results showed 4 suspensions of 15 tested. We made attempts to identify non-TBEV flavivirus in ticks using RT-PCR with genus-specific primers. We didn't reveal any viral RNA in ticks from Moscow region and Republic of Tatarstan. We also studied 128 ticks from Republic of Tuva. Our attempts to identify flavivirus failed. However, there were four samples containing PCR product, which length was close to the one expected. For those samples we determined nucleotide sequence, which corresponded to the genome fragment of Pseudomonas spp. bacteria. Similar species of this bacterium showed positive result in ELISA. Thus, according to our data all methods can show false-positive results during analysis of ticks from nature on the presence of TBEV due to interactions with other flaviviruses or microorganisms that inhabit ticks. RT-PCR and Real-Time PCR are more sensitive and specific than ELISA. Sequencing of the PCR product to identify infectious agent is obligatory to establish TBEV circulation on new territories and in controversial cases.
Key words: tick-borne encephalitis virus, Flavivirus, ELISA, polymerase chain reaction, TBEV prevalence in ticks, antigenic cross-reaction, ticks microflora
Введение
Клещевой энцефалит - природно-очаговое заболевание, которое вызывается вирусом клещевого энцефалита (ВКЭ), входящего в род Flavivirus,
и представляет серьезную проблему для здравоохранения. Данные о зараженности клещей ВКЭ являются основой для выбора тактики экстренной профилактики пациентов после присасывания ин-
фицированного клеща и важны для определения характера и масштаба профилактических мероприятий на эндемичных территориях.
Для выявления ВКЭ в клещах на территории России используют следующие методы: иммунофер-ментный анализ (ИФА), полимеразную цепную реакцию с обратной транскрипцией и последующим электрофоретическим анализом (ОТ-ПЦР) и поли-меразную цепную реакцию с детекцией в режиме реального времени (ПЦР-РВ).
По данным Роспотребнадзора, вирусофорность клещей, определяемая с помощью ИФА, в несколько раз выше, чем определяемая с помощью ПЦР. При использовании ИФА антиген ВКЭ обнаруживают на территориях, где никогда не регистрировали заболеваемость клещевым энцефалитом [1]. В связи с этим остро встает вопрос о чувствительности и специфичности используемых методов.
Ранее нами были проведены исследования по сравнению эффективности детекции ВКЭ в экспериментально инфицированных иксодовых клещах (Acari: Ixodidae) из лабораторных культур с помощью ИФА и ПЦР-РВ и было показано, что метод ИФА почти в 50 раз менее чувствителен, чем ПЦР-РВ [2]. Эксперименты с лабораторной культурой не смогли объяснить причину расхождения данных анализа полевого материала с помощью различных методов. Мы предположили, что на результаты выявления ВКЭ в клещах могут оказывать влияние следующие факторы:
• нарушение протокола постановки ИФА;
• перекрестная реакция с уже известными вирусами, входящими в род Flavivirus;
• циркуляция неизвестного флавивируса, анти-генно близкого к ВКЭ;
• перекрестная реакция с микроорганизмами, обитающими в клещах.
Цель настоящей работы - выявление факторов, влияющих на специфичность и чувствительность ИФА, и различных вариантов ПЦР при исследовании клещей на наличие ВКЭ.
Материалы и методы
Клещи
1. 241 клещ, собранный в весенне-летний период 2012 года в Московской области и Республике Татарстан: Ixodes ricinus Linnaeus, 1758 г. - 71 самка и 31 самец, I. persulcatus Schulze, 1930 г. - 27 самок и 33 самца, Dermacentor marginatus Sulzer, 1776 г. - 4 самки, D. reticulatus Fabricius, 1794 г. - 47 самок и 28 самцов.
2. 128 клещей, собранных в весенний период 2008 года в Республике Тыва: I. persulcatus -58 самок и 47 самцов, D. silvarum Olenev, 1931 г. - 21 самец и 2 самки.
3. 236 экспериментально зараженных ВКЭ клещей из лабораторной культуры в первом поколении видов I. ricinus, I. persulcatus, D. marginatus,
D. reticulatus, D. nuttalli Olenev, 1929 г. Исходные самки клещей, давшие начало лабораторным культурам, были проверены на отсутствие зараженности четырьмя инфекциями (Ин-терЛабСервис, АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum, E. chaffeensis/E. muris-FL) на основе ПЦР-РВ [2].
Вирусы
В работе использовали следующие вирусы:
• ВКЭ - штамм Абсеттаров (GenBank: AF091005; [3]) европейского генотипа, выделенный от больного человека в Ленинградской области, где в основном встречается I. ricinus;
• ВКЭ - штамм ЭК-328 (GenBank: DQ486861; [4]) сибирского генотипа, первоначально выделенный из пула клещей I. persulcatus в 1972 году в Эстонии;
• ВКЭ - штамм Софьин КГГ (GenBank: GU121963; [3]) дальневосточного генотипа, выделенный из мозга больного человека в 1937 году;
• вирус омской геморрагической лихорадки -штамм Никитина (GenBank: GU290187 [5]);
• вирус Лангат - штамм Тр-21 (GenBank: AF253419 [6]);
• вирус шотландского энцефаломиелита овец -штамм S1. Принадлежность к последнему вирусу установлена по результатам секвенирования фрагмента РНК длиной 250 нуклеотидов, кодирующего участок белка NS5 (предоставляется по требованию).
Заражение клещей из лабораторной культуры
Заражение клещей проводили, как описано ранее [7, 8], штаммами ВКЭ Абсеттаров и ЭК-328. Титры вируса в клещевых суспензиях варьировались от 3 до 5 lg БОЕ/мл (БОЕ - бляшкообразующая единица - максимальное разведение вируса, способное вызвать образование одной негативной колонии - «бляшки» на монослойной культуре клеток).
Получение клещевых суспензий
Клещей однократно промывали в 70%-ном этаноле и трехкратно в физиологическом растворе, индивидуально или пулами по три - семь особей, и гомогенизировали пестиком в ступке. Добавляли среду 199 на растворе Эрла (ФГУП «ПИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН») и переносили в пробирки типа «эппендорф».
Выявление РНК флавивирусов методом ОТ-ПЦР
Выделение РНК проводили с помощью TRI Reagent LS (SIGMA) согласно инструкции производителя. Осадок высушивали при 37 оС, растворяли в необходимом количестве тридистил-лированной воды и использовали для обратной транскрипции (ОТ).
Обратную транскрипцию проводили с использованием праймера Random-6 («Синтол», Россия) и ревертазы M-MLV (Promega, США) согласно методике, прилагаемой к ферменту.
ПЦР проводили в соответствии с ранее описанной методикой [9], используя наборы праймеров на род Flavivirus MAMD и cFD2 [10, 11] и на ВКЭ -Kgg19 и Kgg31 [9] с последующим электрофорети-ческим анализом.
Выявление антигена ВКЭ методом ИФА
ИФА проводили с использованием набора «Век-тоВКЭ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест») согласно инструкции производителя с описанными ниже модификациями пробоподготовки.
1. Экспериментально зараженные клещи из лабораторной культуры
1-й метод: клещей из лабораторной культуры индивидуально суспензировали в 700 мкл среды 199 на растворе Эрла, и 100 мкл полученной суспензии (без добавления коммерческого раствора для разведения исследуемых образцов (РРИО)) вносили в лунки стрипов. Дальнейшее исследование проводили согласно инструкции производителя;
2-й метод: клещей из лабораторной культуры индивидуально суспензировали в 100 мкл среды 199 на растворе Эрла, 50 мкл полученной суспензии смешивали с 50 мкл РРИО из набора, а затем 100 мкл вносили в лунки стрипов. Дальнейшее исследование проводили согласно инструкции производителя;
3-й метод: клещей из лабораторной культуры исследовали индивидуально, строго следуя инструкции производителя.
2. Клещи из природной популяции
При суспензировании на каждого клеща из пула добавляли по 100 мкл среды 199 на растворе Эрла, на каждого клеща, исследованного индивидуально, - по 500 мкл среды 199 на растворе Эрла. Отбирали 50 мкл клещевой суспензии и добавляли 50 мкл РРИО из набора, 100 мкл полученной смеси вносили в лунку стрипа. Дальнейшее исследование проводили согласно инструкции производителя.
3. Определение чувствительности и специфичности ИФА с использованием вирусных суспензий с известным титром вируса
К 50 мкл вирусной суспензии добавляли 50 РРИО из набора, 100 мкл полученной смеси вносили в лунку стрипа для постановки ИФА. Дальнейший анализ проводили согласно инструкции производителя.
Получение колоний микроорганизмов из клещевых суспензий на плотной питательной среде
50 мкл клещевой суспензии, положительной в ИФА на наличие антигена ВКЭ, вносили на чашки Петри с колумбийским агаром с 5%-ной бараньей кровью (BIO-RAD) и рассевали методом секторных посевов (по Голду-Родоману) [12]. Чашки Петри помещали в СО2-инкубатор на 24 часа. Идентификацию микроорганизмов проводили с помощью MALDI-TOF-масс-спектрометрии [13].
Анализ перекрестных реакций между ВКЭ и бактериями методом ИФА
Чистую культуру микроорганизмов суспензировали в среде 199 на растворе Эрла. Бактериальные суспензии уравнивали по концентрации белка, определенной по методу Бредфорд. Для постановки ИФА суспензии микроорганизмов разводили средой 199 на растворе Эрла до 3 и 6 мг/мл общего белка. К 50 мкл бактериальной суспензии добавляли 50 мкл РРИО, 100 мкл полученной смеси вносили в лунку стрипа для постановки ИФА. В дальнейшем анализ проводили с помощью набора «ВектоВКЭ-антиген» (ЗАО «Вектор-Бест») согласно прилагаемой к набору инструкции.
Полимеразная цепная реакция с детекцией в режиме реального времени
Выделение вирусной РНК проводили с помощью комплекта реагентов для выделения РНК/ ДНК «РИБО-преп» (ИнтерЛабСервис, «АмплиСенс») согласно инструкции; кДНК получали с помощью набора для обратной транскрипции «РЕВЕРТА-L» (ИнтерЛабСервис, «АмплиСенс») и использовали для детекции ВКЭ методом ПЦР в реальном времени с применением набора реагентов для выявления РНК/ДНК возбудителей инфекций, передаваемых иксодовыми клещами, в биологическом материале методом ПЦР с гибридизационно-флуоресцент-ной детекцией АмплиСенс® TBEV, B. burgdorferi s.l., A. phagocytophilum, E. chaffeensis/E. muris-FL.
Статистическая обработка
В ходе работы для сравнения показателей зараженности клещей ВКЭ использовали точный двусторонний критерий Фишера.
Результаты и обсуждение
Влияние отклонений в пробоподготовке на эффективность выявления ВКЭ в клещах с помощью ИФА
Пробоподготовку 80-ти экспериментально зараженных ВКЭ клещей и 10-ти незараженных проводили, строго следуя инструкции производителя. В дальнейшем пробы анализировали на наличие вирусного антигена с помощью коммерческого набора на основе ИФА «ВектоВКЭ-антиген», используя протокол «Инкубация 3 часа». Чувствительность набора составила 82,5% и не зависела от пола, вида и степени насыщенности зараженного клеща.
Часто клещевые суспензии необходимо анализировать на наличие нескольких инфекционных агентов различными методами, что требует использования различных растворов на стадии пробоподготовки.
Для оценки влияния отклонений от протокола пробоподготовки (использование среды для выращивания клеток вместо РРИО, отсутствие обработки клещей 70%-ным этанолом перед гомогенизированием) на чувствительность ИФА были проведены специальные эксперименты.
Для того чтобы клещевые суспензии можно было использовать в вирусологических исследованиях, экспериментально зараженных ВКЭ лабораторных клещей пяти видов (I. ricinus, I. persulcatus, D. marginatus, D. nuttalli, D. reticulatus) суспензировали в среде 199 на растворе Эрла. Одну часть клещевых суспензий вносили в лунки стрипов сразу (1-й способ), а в другую добавляли РРИО в соотношении 1:1 и потом вносили в лунки стрипов (2-й способ).
При подготовке 94 клещей 1-м способом чувствительность ИФА составила 36,2%, при подготовке 51 клеща 2-м способом - 39,2%. Полученные данные статистически достоверно различаются с чувствительностью ИФА (82,5%), проведенного по протоколу «Инкубация 3 часа» в строгом соответствии с инструкцией (точный двусторонний критерий Фишера, P < 0,01). Таким образом, при нарушении протокола пробоподготовки чувствительность метода снизилась более чем в два раза.
Во втором эксперименте 205 иксодид разных видов, собранных в Московской области и Республике Татарстан, разбили на пулы по три - семь особей (всего 47 пулов) и 36 особей исследовали по отдельности. Из этих особей, исследованных индивидуально, и 28 пулов были получены клещевые суспензии (клещей гомогенизировали в среде 199 на растворе Эрла, а потом добавляли РРИО в соотношении 1:1). Из оставшихся 19 пулов были приготовлены пробы тем же способом, но перед суспензированием клещей не промывали в 70%-ном этиловом спирте. В группе проб, при подготовке которых клещей промывали в 70%-ном этаноле перед суспензированием, 4 из 28 пулов и 5 клещей из 36-ти, приготовленных индивидуально, оказались положительными на наличие ВКЭ (14% положительных проб). В случае когда клещей не промывали в спирте перед суспензированием, 13 пулов из 19-ти показали положительный результат (68% положительных проб). Все пулы были проверены методом ОТ-ПЦР на наличие РНК вирусов рода Flavivirus с использованием праймеров MAMD и cFD2 и 25 пулов - на наличие ВКЭ с использованием праймеров Kgg19 и Kgg31 с последующим электрофоретическим анализом. Ни одна из проб не содержала вирусной РНК.
Таким образом, несмотря на то что нарушение протокола пробоподготовки при постановке ИФА может приводить к снижению чувствительности метода более чем в два раза, с помощью ИФА были выявлены инфицированные ВКЭ клещи, в то время как более чувствительным методом вирусная РНК в этих пробах не была обнаружена. Положительные пробы были среди суспензий, приготовленных из клещей, собранных не только на территории Республики Татарстан, но и на территории Московской области, где циркуляция ВКЭ не доказана.
Оценка возможности неспецифических реакций в ИФА с микроорганизмами, обитающими в клещах
При микробиологическом исследовании положительных в ИФА клещевых суспензий (клещи
из природы) были получены 12 видов бактерий, представленные 15 изолятами. Бактериальные суспензии были уравнены по концентрации белка, определенной по методу Бредфорд, до 3 и 6 мг/мл и исследованы с помощью набора «ВектоВКЭ-анти-ген» (ЗАО «Вектор-Бест»).
Из 15-ти исследованных изолятов микроорганизмов четыре изолята, представлявшие виды Pseudomonas luteola, Stenotrophomonas maltophilia, Bacillus weihenstephanensis, оказались положительными в ИФА на наличие ВКЭ (табл. 1). Два вида бактерий были выделены из клещей, не обработанных 70%-ным спиртом перед суспензированием, один - из обработанных клещей.
Таким образом, одной из причин ложноположи-тельных реакций при проведении ИФА может быть неспецифическое взаимодействие с микроорганизмами, обитающими в клещах.
Оценка специфичности ИФА и ПЦР-РВ в отношении представителей серокомплекса клещевого энцефалита рода Flavivirus
Для оценки специфичности методов мы взяли три штамма ВКЭ, относящихся к разным генотипам, и три вируса, входящих в серокомплекс клещевого энцефалита, которые, как известно [14], характеризуются перекрестами в серологических реакциях.
Все вирусы, использованные в работе, давали положительный результат при исследовании с помощью коммерческого набора «ВектоВКЭ-антиген», но в разных концентрациях (табл. 2).
При исследовании вирусов с помощью набора реагентов серии «МультиПрайм» для выявления РНК/ДНК возбудителей инфекций, переносимых иксодовыми клещами (ИнтерЛабСервис, «Ампли-Сенс»), три штамма ВКЭ - представители всех трех генотипов вируса - выявлялись в концентрации
2.2 - 2,6 lg БОЕ/мл. Вирус шотландского энцефаломиелита овец был выявлен в концентрации
2.3 lg БОЕ/мл. В инструкции по применению набора производителем указывается, что вирусы ОГЛ и Лангат не детектируются. В наших исследованиях это подтвердилось (см. табл. 2).
ПЦР-РВ является более специфичным методом, однако и он давал положительную реакцию с филогенетически наиболее близким к ВКЭ вирусом шотландского энцефаломиелита овец, который не вызывает заболевания человека.
Попытки выявления неизвестного флавивируса
Для выявления возможной циркуляции в природной популяции клещей неизвестного флави-вируса клещевые суспензии были исследованы в ОТ-ПЦР с набором праймеров на род Flavivirus MAMD и cFD2, которые позволяют выявлять вирусы в концентрации 2,2 - 2,7 lg БОЕ/мл (см. табл. 2). При анализе клещевых суспензий (клещи из Московской области и Республики Татарстан) мы не выявили ни одной положительной пробы. На данном этапе неизвестный флавивирус в клещевых
Таблица 1.
Анализ микроорганизмов, обитающих в клещах, на серологические перекресты в коммерческом наборе на основе ИФА для выявления антигена вкЭ
Отдельные клещи и пулы Выделенные микроорганизмы Количество колониеобразующих единиц в клещевых суспензиях, КОЕ/50 мкл Результаты ИФА*
6 мг/мл 3 мг/мл
6 I. persulcatus Pantoea agglomerans Сливной Отрицат. Отрицат.
5 I. ricinus Нет
5 I. persulcatus Cupriavidus pauculus 14 КОЕ Отрицат. Отрицат.
7 I. persulcatus Нет
5 I. ricinus Enterobacter asburiae Сливной Отрицат. Отрицат.
Serratia liquefaciens Сливной Отрицат. Отрицат.
5 I. persulcatus Lactococcus lactis 3 КОЕ Отрицат. Отрицат.
3 D. reticulatus Bacillus megaterium 3 КОЕ Отрицат. Отрицат.
5 I. ricinus Нет
6 D. reticulatus Pseudomonas luteola 4 КОЕ Положит. Положит.
7 I. ricinus Нет
3 I. ricinus Bacillus weihenstephanensis Сливной Положит. Положит.
Acinetobacter calcoaceticus Сливной Отрицат. Отрицат.
5 I. ricinus Нет
5 I. ricinus Нет
1 I. ricinus Pantoea agglomerans 100 КОЕ Отрицат. Отрицат.
Stenotrophomonas maltophilia 200 КОЕ Положит. Положит.
1 I. ricinus Enterobacter cloacae 4 КОЕ Отрицат. Отрицат.
Acinetobacter junii 35 КОЕ Отрицат. Отрицат.
Stenotrophomonas maltophilia 50 КОЕ Положит. Положит.
1 I. ricinus Нет
1 I. ricinus Acinetobacter junii 30 КОЕ Отрицат. Отрицат.
1 I. ricinus Нет
Примечание: *Суспензии микроорганизмов были уравнены по концентрации белка, определенной по методу Бредфорд, до 3 и 6 мг/мл.
суспензиях, положительных в ИФА на наличие антигена ВКЭ, обнаружен не был.
При исследовании клещей из Республики Тыва, отрицательных на наличие РНК ВКЭ, с помощью ОТ-ПЦР с использованием праймеров на род Flavivirus MAMD и cFD2 были обнаружены четыре пробы, содержащие продукт ПЦР с длиной, близкой к ожидаемой. Для них была определена нуклеотидная последовательность, которая соответствовала участку мРНК, кодирующему GTP-связывающий белок бактерии рода Pseudomonas.
Таким образом, ложноположительные реакции возможны и при использовании ОТ-ПЦР с родоспе-цифическими вырожденными праймерами.
На сегодняшний день в России основным методом диагностики клещей на наличие ВКЭ является ИФА. Доля исследований с использованием ПЦР составляет только 40%. В последние годы в запад-
ной и юго-западной частях страны, ранее считавшихся неэндемичными по клещевому энцефалиту, в которых не регистрировалось случаев заболевания, участились случаи обнаружения антигена ВКЭ в клещах с помощью ИФА. Так, в Ставропольском крае в 2010 году с помощью ИФА был обнаружен антиген ВКЭ в клещах D. marginatus [1]. Попытки выявления вируса в этих материалах с помощью вирусологических и молекулярных методов не увенчались успехом. На основании вышесказанного можно было бы предположить, что метод ИФА является более чувствительным по сравнению с ПЦР и его применение более оправдано. Однако экспериментальные данные говорят об обратном.
Работа, проведенная ранее с использованием экспериментально зараженных ВКЭ клещей, показала, что метод ПЦР-РВ как минимум в 50 раз более чувствителен, чем ИФА [2]. Наши данные де-
Таблица 2.
Оценка специфичности различных методов выявления вкЭ с использованием вирусов рода Flavivirus
Название вируса и штамм Минимально выявляемые концентрации вируса, lg БОЕ/мл
ИФА* ПЦР-РВ ОТ-ПЦР
ВКЭ - штамм Абсеттаров 5,2 2,2 2,2
ВКЭ - штамм ЭК-328 5,5 2,5 2,5
ВКЭ - штамм Софьин КГГ 5,6 2,6 2,6
Вирус омской геморрагической лихорадки - штамм Никитина (максимальная концентрация - 8,7 1д БОЕ/мл) 6,3 Не выявили 2,3
Вирус Лангат - штамм Тр-21 (максимальная концентрация - 8,7 1д БОЕ/мл) 6,7 Не выявили 2,7
Вирус шотландского энцефаломиелита овец -штамм S1 3,2 2,2 2,2
Примечание: *Вирусные суспензии были приготовлены на среде 199 на растворе Эрла и разведены коммерческим раствором для разведения исследуемых образцов в соотношении 1:1.
монстрируют, что отклонения в пробоподготовке приводят к снижению чувствительности ИФА.
В настоящей работе мы выявили некоторые возможные причины появления ложноположительных реакций в ИФА: перекрестные реакции с известными вирусами серокомплекса клещевого энцефалита и перекрестные реакции с микроорганизмами, обитающими в клещах.
Вирусы серокомплекса клещевого энцефалита настолько близки антигенно и генетически, что неудивительны возникновение серологических перекрестов в ИФА и выявление вируса шотландского энцефаломиелита овец даже более чувствительным и специфичным методом ПЦР-РВ. На основании этих данных нельзя исключить возможности циркуляции в природной популяции клещей неизвестного флавивируса, который может быть выявлен с помощью как ИФА, так и ПЦР.
В предыдущей работе при анализе клещей, прошедших полную генерацию в лабораторных условиях, ложноположительные реакции при использовании ИФА отсутствовали [2]. При переходе на
последующую фазу развития в клещах снижается уровень бактериальной и вирусной нагрузки, которую они, возможно, получили в природе [15, 16]. Этим можно объяснить полученные нами данные о появлении ложноположительных реакций при анализе клещей из природы в отличие от лабораторной культуры клещей. С помощью ИФА и ПЦР нам удалось выявить бактерии рода Pseudomonas, по-видимому, вследствие накопления большого количества бактерий этого рода в клещах.
Вывод
Представленные данные показывают преимущество ПЦР в определении зараженности клещей ВКЭ по сравнению с ИФА. Для установления циркуляции ВКЭ на новых территориях и в спорных случаях необходимо определение нуклеотидной последовательности продукта ПЦР для идентификации инфекционного агента. ■
Работа была частично поддержана грантом РФФИ № 14-04-31716 мол а.
Литература
1. Ермаков А.В., Василенко Н.Ф., Варфоломеева Н.Г., Кирейцева О.А., Волынкина А.С., Заикина И.Н. и др. Иммунологический мониторинг за трансмиссивными природно-очаговыми инфекциями на территории Кавказских Минеральных Вод. Медицинский вестник Северного Кавказа. 2012; 1: 43 - 45.
2. Белова О.А., Буренкова Л.А., Карань Л.С., Колясникова Н.М., Топычканова Н.Г., Кувшинова И.Н. и др. Эффективность детекции вируса клещевого энцефалита в иксодовых клещах (Acari: Ixodidae) с помощью ИФА и ПЦР в реальном времени. Вопросы вирусологии. 2014; 5: 32 - 36.
3. Kozlovskaya L.I., Shevtsova A.S., Romanova L.I., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I., Lyapustin V.N. et al. Gag-binding variants of Tick-Borne Encephalitis virus. Virology. 2010; 398 (2): 262 - 272.
4. Romanova L.Iu., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.V., Lukashev A.N., Gmyl L.V. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation. Virology. 2007; 362 (1): 75 - 84.
5. Терехина Л.Л., Романова Л.Ю. Возможности выявления РНК вируса Омской геморрагической лихорадки с помощью универсальных для флавивирусов праймеров и тест-систем для диагностики ВКЭ. Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. 2008; 25: 151 - 157.
6. Campbell M.S., Pletnev A.G. Infectious cDNA clones of Langat tick-borne flavivirus that differ from their parent in peripheral neurovirulence. Virology. 2000; 269(1): 225-237.
7. Белова О.А., Козловская Л.И., Романова Л.Ю., Шевцова А.С., Буренкова Л.А. Сравнительный анализ эффективности различных методов заражения иксодовых клещей вирусом клещевого энцефалита. Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. 2008; 25: 47 - 52.
8. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid ticks -Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks and Tick-borne Diseases. 2012; 3: 240-246.
9. Романова Л.Ю., Козловская Л.И., Шевцова А.С., Карганова Г.Г. Метод доказательства отсутствия РНК вируса клещевого энцефалита в биопробах. Вопросы вирусологии. 2006; 51 (1): 38 - 41.
10. Запорожцев В.В., Семенкова Л.О., Козловская Л.И., Романова Л.Ю. Оценка возможности использования универсальной пары праймеров к РНК флавивирусов для детекции вируса клещевого энцефалита с помощью ПЦР в биопробах. Медицинская вирусология. Труды ИПВЭ им. М.П. Чумакова РАМН. 2006; 23: 78 - 81.
11. Scaramozzino N., Crance J., Jouan A., DeBriel D.A., Stoll F., Garin D. Comparison of Flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. Journal of Clinical Microbiology. 2001; 39 (5): 1922 - 1927.
12. Лабораторные методы исследования в клинике: Справочник. Меньшиков В.В., ред. Москва: Медицина; 1987.
13. Маянский Н.А., Калакуцкая А.Н., Мотузова О.В., Ломинадзе Г.Г., Крыжановская О.А., Катосова Л.К. MALDI-TOF масс-спектрометрия в рутинной работе микробиологической лаборатории. Вопросы диагностики в педиатрии. 2011; 3 (5): 20 - 25.
14. Calisher C.H., Karabatsos N., Dalrymple J.M., Shope R.E. Porterfield J.S., Westaway E.G., Brandt W.E. Antigenic relationships between flaviviruses as determined by cross-neutralization tests with polyclonal antisera. The Journal of General Virology. 1989; 70: 37 - 43.
15. Куренков В.Б., Чунихин С.П., Кочетова Г.А., Решетников И.А., Рыльцева Е.В. Экспериментальная характеристика таежного клеща (Ixodes persulcatus) в качестве переносчика ВКЭ. Медицинская паразитология. 1981; 1: 53 - 58.
16. Чунихин С.П., Леонова Г.Н. Экология и географическое распространение арбовирусов. Москва: Медицина; 1985.
References
1. Ermakov A.V., Vasilenko N.F., Varfolomeeva N.G., Kireytseva O.A., Volynkina A.S., Zaikina I.N. et al. Immunological monitoring of transmissible zoonotic infections on Caucasian Mineral Waters territory. Medicinskiy vestnik Severnogo Kavkaza. 2012; 1: 43 - 45 (in Russian).
2. Belova O.A., Burenkova L.A., Karan' L.S., Kolyasnikova N.M., Topychkanova N.G., Kuvshinova I.N. et al. Tick-borne encephalitis virus detection efficiency in ixodid ticks (Acari: Ixodidae) with ELISA and Real-time PCR Voprosy Virusologii. 2014; 5: 32 - 36 (in Russian).
3. Kozlovskaya L.I., Shevtsova A.S., Romanova L.I., Rogova Y.V., Dzhivanian T.I., Lyapustin V.N. et al. GAG-binding variants of Tick-Borne Encephalitis virus. Virology. 2010; 398 (2): 262 - 272.
4. Romanova L.Iu., Gmyl A.P., Dzhivanian T.I., Bakhmutov D.V., Lukashev A.N., Gmyl L.V. et al. Microevolution of tick-borne encephalitis virus in course of host alternation. Virology. 2007; 362 (1): 75 - 84.
5. Terekhina L.L., Romanova L.Yu. The possibility of identification of the Omsk hemorrhagic fever virus RNA with universal primers for flavivirus and kits for TBEV detection. Meditsinskaya virusologiya. Trudy IPVE M.P Chumakova. 2008; 25: 151 157 (in Russian).
6. Campbell M.S., Pletnev A.G. Infectious cDNA clones of Langat tick-borne flavivirus that differ from their parent in peripheral neurovirulence. Virology. 2000; 269 (1): 225 - 237.
7. Belova O.A., Kozlovskaya L.I., Romanova L.Yu., Shevtsova A.S., Burenkova L.A. Comparative analysis of the effectiveness of different ixodid ticks' infection methods with TBEV. Meditsinskaya virusologiya. Trudy IPVE M.P Chumakova. 2008; 25: 47 - 52 (in Russian).
8. Belova O.A., Burenkova L.A., Karganova G.G. Different tick-borne encephalitis virus (TBEV) prevalences in unfed versus partially engorged ixodid ticks - Evidence of virus replication and changes in tick behavior. Ticks and Tick-Borne Diseases. 2012; 3: 240 - 246.
9. Romanova L.Yu., Kozlovskaya L.I., Shevtsova A.S., Karganova G.G. Evidence for the absence of tick-borne encephalitis virus RNA in bioassays. Voprosy Viru-sologii. 2006; 51 (1): 38 - 41 (in Russian).
10. Zaporozhtsev V.V., Semenkova L.O., Kozlovskaya L.I., Romanova L.Yu. Evaluation of the possibility of a universal primer pair to flavivirus RNA usage for the tick-borne encephalitis virus detection in bioassays by PCR. Meditsinskaya virusologiya. Trudy IPVE M.P. Chumakova. 2006; 23: 78 - 81 (in Russian).
11. Scaramozzino N., Crance J., Jouan A., DeBriel D.A., Stoll F., Garin D. Comparison of Flavivirus universal primer pairs and development of a rapid, highly sensitive heminested reverse transcription-PCR assay for detection of flaviviruses targeted to a conserved region of the NS5 gene sequences. Journal of Clinical Microbiology. 2001; 39 (5): 1922 - 1927.
12. Menshikov V.V., ed. Laboratory methods in clinic: Handbook. Moscow: Medicina; 1987 (in Russian).
13. Mayanskiy N.A., Kalakutskaya A.N., Motuzova O.V., Lominadze G.G., Kryzhanovskaya O.A., Katosova L.K. MALDI-TOF mass spectrometry in the clinical microbiology laboratory everyday work. Voprosy diagnostiki v pediatrii. 2011; 3 (5): 20 - 25 (in Russian).
14. Calisher C.H., Karabatsos N., Dalrymple J.M., Shope R.E. Porterfield J.S., Westaway E.G., Brandt W.E. Antigenic relationships between flaviviruses as determined by cross-neutralization tests with polyclonal antisera. The Journal of General Virology. 1989; 70: 37 - 43.
15. Kurenrov V.B., Chunikhin S.P, Kochetova G.A., Reshetnikov I.A., Ryltseva E.V. Experimental characterization of taiga tick (Ixodes persulcatus) as a TBEV vector. Medical parazitology. 1981; 1: 53 - 58 (in Russian).
16. Chunikhin S.P., Leonova G.N. Ecology and geographical distribution of arboviruses. Moscow: Medicina; 1985 (in Russian).
Клинико-эпидемиологическая характеристика инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в хирургических стационарах
О.А. Орлова1, 2([email protected]), В.Г. Акимкин3 - 5 ([email protected]), А.В. Чистова6, Н.П. Ефремова2
1МБУЗ «Городская клиническая больница № 8», г. Челябинск
2ГБОУ ВПО «Южно-Уральский государственный медицинский университет»
Минздрава России, г. Челябинск
3ФБУН «НИИ дезинфектологии» Роспотребнадзора, Москва
4ГБОУ ВПО «Первый Московский государственный медицинский университет
им. И.М. Сеченова» Минздрава России
5ФБУН «Центральный НИИ эпидемиологии» Роспотребнадзора, Москва 6Управление Федеральной службы по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека по Челябинской области, г. Челябинск
Резюме
В настоящее время проблема профилактики и лечения инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи (ИСМП), в хирургических стационарах остается одной из самых актуальных во всем мире. ИСМП утяжеляют общее состояние больных и увеличивают продолжительность пребывания пациента в стационаре.
Цель исследования: провести анализ инфекций, связанных с оказанием медицинской помощи, в хирургических стационарах с учетом их проявлений и этиологических особенностей. тсоответственно.
