CC BY
133
Физико-химическая биология Вестник Нижегородского университета им. Н.И. Лобачевского, 2011, № 2 (2), с. 208-214
УДК 577.37
ОЦЕНКА ВОЗМОЖНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ФЛУОРЕСЦЕНТНЫХ ЗОНДОВ ДЛЯ АНАЛИЗА ИЗМЕНЕНИЙ КОНЦЕНТРАЦИИ ВНУТРИКЛЕТОЧНОГО КАЛЬЦИЯ ПРИ ГЕНЕРАЦИИ ПОТЕНЦИАЛОВ ВОЗБУЖДЕНИЯ У ВЫСШИХ РАСТЕНИЙ
© 2011 г. Л.А. Орлова 1, Е.К. Акинчиц 1, Е.А. Сергеева 2, В.Н. Неруш 1, В.А. Воденеев 1
1 Нижегородский госуниверситет им. Н.И. Лобачевского 2 Институт прикладной физики РАН, Н. Новгород
Поступила в редакцию 24.01.2011
Адаптирована методика загрузки Са2+-чувствительных флуоресцентных зондов внутрь клеток стебля проростков тыквы с целью регистрации изменения концентрации кальция при генерации потенциалов возбуждения. Для контроля загрузки зонда во внутриклеточное пространство был осуществлён анализ изображений и спектров эмиссии, полученных методом конфокальной микроскопии, а также применен кальциевый ионофор А23187. Выявлено, что подобранные в ходе работы условия загрузки обеспечивают накопление зонда в клетках и возможность его использования для изучения изменения внутриклеточной концентрации кальция. С помощью Са2+-чувствительного зонда Fluo-4/AM зарегистрировано увеличение концентрации кальция в клетках стебля проростка при распространении вариабельного потенциала, индуцированного ожогом листа.
Ключевые слова: высшие растения, конфокальная микроскопия, Fluo-4/AM, динамика концентрации Са2+.
Введение
Ионы кальция играют важнейшую роль в функционировании сигнальных систем как животной, так и растительной клетки, в связи с чем определение изменений концентрации внутриклеточного кальция является важным аспектом многих исследований [1-3]. В частности, изучение динамики концентраций внутриклеточного кальция необходимо для формирования целостной картины процессов генерации потенциалов возбуждения у высших растений. У высших растений потенциалы возбуждения представлены двумя видами электрических реакций: потенциалом действия (ПД) и вариабельным потенциалом (ВП) [4-6]. Распространяясь по растению из зоны локального раздражения, как ПД, так и ВП способны индуцировать комплекс неспецифических функциональных изменений - экспрессия генов, изменение фотосинтетической активности, усиление дыхания и др. [4, 7, 8]. Предположено, что распространяющиеся потенциалы возбуждения инициируют различные неспецифические функциональные изменения с помощью концентрационных сдвигов, которые возникают в клетках как следствие ионных потоков, участвующих в генерации реакций [8]. В связи с этим, изучение динамики ионных концентраций, в частности
ГЛ 2+
Ca , важно не только для исследования механизмов генерации потенциалов возбуждения у высших растений, но также для понимания механизмов преобразования электрических сигналов в функциональный ответ.
Наиболее чувствительным и вследствие этого широко применяемым методом регистрации кальциевой динамики является метод флуоресцентного анализа, основанный на применении ряда Са2+-чувствительных флуоресцентных зондов. Все они являются анионами при физиологических значениях рН и не обладают способностью свободно проникать через мембраны [9]. В исследованиях на животных объектах данная проблема решается путем внесения в состав зонда ацетометилового (АМ) компонента, что обусловливает возможность проникновения флуорофора внутрь клетки, где в дальнейшем он подвергается действию внутриклеточных эстераз и, гидролизуясь, освобождает
2+
Са -чувствительный агент.
Ввиду наличия у растений плотной клеточной стенки, которая также может содержать ряд активных эстераз, загрузка флуоресцентного зонда внутрь клеток встречает ряд трудностей. В работе [10] была показана возможность доставки флуоресцентного Са2+-чувствительного зонда Fluo-3/AM внутрь клеток корней пшеницы с помощью введения в процедуру загрузки
низкотемпературного этапа, позволяющего временно подавить активность эстераз и дать зонду возможность диффундировать внутрь клеток. При последующем повышении температуры во внутриклеточном пространстве происходит гидролиз зонда до Fluo-3, способного
связываться с кальцием [10]. Также продемон-
2+
стрирована возможность применения Са -чувствительных АМ-содержащих зондов для работы на изолированных протопластах клеток растений [11].
Объектом, представляющим наибольший интерес для наших исследований, является стебель растения, поскольку преимущественно по нему происходит распространение потенциалов
возбуждения. Цель данной работы - оценка
2+
возможности применения Ca -чувствительных флуоресцентных зондов для анализа изменений концентрации кальция внутри клеток стебля проростка высшего растения при генерации потенциалов возбуждения.
Экспериментальная часть
Исследования проводили на проростках тыквы (Cucurbita pepo L.) и проростках пшеницы (Triticum aestivum L.) возраста 1520 дней. Проростки выращивали в климатической камере KBW-240, Binder (16-часовой световой период, температура 23 °С). В качестве субстрата использовали керамзит; питательным раствором служила 50%-ная среда Хогланда - Арнона.
Для регистрации изменений концентрации свободного кальция применяли флуоресцентные зонды Fluo-3/AM и Fluo-4/AM. Максимум возбуждения обоих зондов лежит в области 490 нм, максимум интенсивности флуоресценции -в области 530 нм [9]. Для загрузки зонда внутрь клеток проростков тыквы и пшеницы применялась методика загрузки флуоресцентных зондов с АМ-компонентами [10], которая включает низкотемпературный этап и этап при комнатной температуре (рис. 1а). С целью предотвращения расщепления АМ-компонента эстеразами апо-пласта участок проростка, погруженный в раствор зонда (2 10-5 M), помещали в темноту при температуре 4оС. Продолжительность низкотемпературного этапа экспериментально подбирали в ходе работы. Затем при комнатной температуре проросток отмывали от зонда путем четырёх-пятикратной замены стандартного раствора (KCl - 10-3, NaCl - 5 10-4, CaCl2 - 5 10-4 M) в ячейке, после чего проросток оставался в растворе на протяжении всего времени регистрации флуоресценции.
Регистрацию флуоресценции осуществляли на комплексе лазерной сканирующей микроскопии Carl Zeiss LSM 510 META (в ее составе инвертированный микроскоп Axiovert 200M, лазерный сканирующий модуль, спектральный модуль Carl Zeiss 23 META) [12]. Проросток помещался на предметный столик микроскопа. Участок стебля проростка, ранее погруженный в раствор зонда, размещали в ячейке, содержащей стандартный раствор объемом 3 мл. Дном ячейки служило покровное стекло (рис. 1б). Формирование изображений осуществляли с использованием объектива Plan Apochromat 40^0.6 Korr. Для возбуждения флуоресценции использовался аргоновый лазер (488 нм) с мощностью излучения на выходе из объектива
0.1^0.15 мВт. Размер получаемых изображений составлял 318^318 мкм с разрешением 512x512 пикселей. Время получения отдельного изображения при регистрации временной серии составляло 1.57 с. Регистрация флуоресценции зонда осуществлялась в диапазоне длин волн 500-550 нм.
С помощью спектрального модуля регистрировали спектр измеряемого сигнала в диапозоне от 506 до 660 нм при возбуждении флуоресценции на длине волны 488 нм. Представленные в результатах изображения получены в спектральном режиме с использованием псевдоцве-товой палитры. Одновременно с регистрацией флуоресценции осуществляли запись электрической активности.
Электрическую активность регистрировали внеклеточно с помощью Ag/AgCl макроэлектродов ЭВЛ-1М3. Измерительный электрод располагался в зоне регистрации флуоресценции, электрод сравнения контактировал с раствором, омывающим корни. Усилителем служил иономер универсальный ИПЛ-112, соединенный с персональным компьютером. ВП индуцировался ожогом семядольного листа открытым пламенем в течение 3 сек.
Каждая серия экспериментов включала 4-6 измерений. Каждое измерение проводилось на отдельном растении. В результатах представлены типичные изображения исследуемых объектов и типичные записи отдельных измерений.
Результаты и их обсуждение
Для начальной апробации стандартной методики [10] производилась загрузка зонда Fluo-3/AM в корни пшеницы. Согласно данной методике, корни пшеницы должны быть инкубированы в растворе зонда в течение 2 часов в темноте при температуре 4°С. Затем в течение
Рис. 1. Схема эксперимента: этапы загрузки флуоресцентного зонда в клетки проростка (а), схема регистрации разности потенциалов (ДЦ) и флуоресценции загруженного зондом проростка методом конфокальной микроскопии (б)
1.5 часов при температуре 20-25°С корни отмываются в стандартном растворе. После отмывания были получены изображения корневого апекса проростков пшеницы в режиме регистрации спектров. Максимум интенсивности спектров флуоресценции соответствует максимуму флуоресценции зонда, т.е. было зарегистрировано накопление Б1ио-3 в корневых волосках проростка (рис. 2а). При проведении аналогичного эксперимента с применением флуоресцентного зонда Р1ио-4/ЛМ были получены сходные результаты.
Для контроля внутриклеточного накопления зонда был использован кальциевый ионофор А23187, который, функционируя как ионообменный «челнок», производит обмен одного иона кальция на два иона водорода [13, 14]. По-
/-л 2+
скольку внутриклеточная концентрация Са в растительных клетках в состоянии покоя со-
ставляет около 10-7 М [1], что значительно ниже содержания кальция во внеклеточной среде (540-4 М в наших экспериментах), добавление
ионофора приведет к увеличению концентрации
2+
Са в клетке, что должно сопровождаться увеличением интенсивности флуоресценции зонда. При внесении ионофора А23187 в конечной концентрации 5 10-6 М было зарегистрировано значительное увеличение флуоресценции зонда (рис. 3 а), что свидетельствует о внутриклеточном накоплении Б1ио-4.
На следующем этапе по аналогичной схеме производилась загрузка зонда Б1ио-3/ЛМ в стебель проростка тыквы, а также в лист пшеницы. При 2-4-часовой продолжительности низкотемпературного этапа загрузки у листа пшеницы и стебля тыквы не было зарегистрировано флуоресценции в области максимума эмиссии Б1ио-3. При увеличении продолжительности
а
/фл, отн. ед.
Длина волны
б
/фл, отн. ед.
Длина волны
Б
/фл, отн. ед.
Длина волны
Рис. 2. Изображения и спектры флуоресценции: корневого апекса проростка пшеницы, загруженного зондом Fluo-3/AM (а); стебля проростка тыквы, загруженного зондом Fluo-3/AM (12-часовой низкотемпературный этап) (б); стебля проростка тыквы, загруженного зондом Fluo-4/AM (12-часовой низкотемпературный этап) (в). Точки снятия спектров отмечены маркерами. Размер изображений 318 х 318 мкм. ^ = 488 нм
низкотемпературного этапа до 14-16 часов искомого максимума также не было выявлено (рис. 2б). Отсутствие накопления зонда в листе и стебле, по-видимому, может быть объяснено различиями в структуре этих органов в сравнении со структурой корня, клетки ризодермы которого лишены кутикулы и образуют выро-
сты - корневые волоски, сильно увеличивающие поглощающую поверхность [15].
В связи с тем, что нами не было выявлено накопления зонда Fluo-3/AM в клетках стебля проростка тыквы, дальнейшие исследования
ГЛ 2+
осуществлялось на другом Са -чувствительном зонде - Fluo-4/AM, который имеет более высо-
Время, сек
а
300
250
200
150
100
50
0
А23187
1 1 1 »
0 100 200 300 400 500
Время, сек
Рис. 3. Изменение интенсивности флуоресценции Иио-4 при добавлении А23187: в клетках корней проростка пшеницы (а); в клетках стебля проростка тыквы (б). Содержание Са2+ во внеклеточной среде - 10-3М. Стрелкой указан момент добавления А23187
кую проникающую способность [9]. Анализ полученных изображений показал, что максимум интенсивности флуоресценции, соответствующий Б1ио-4, был зарегистрирован при продолжительности низкотемпературного этапа загрузки зонда в стебель проростка тыквы не менее 12-14 часов (рис. 2в). На данном этапе был также проведен контроль загрузки зонда Б1ио-4 внутрь клеток проростка с применением кальциевого ионофора А23187. При добавлении в ячейку с проростком тыквы 5 10-6 М А23187 было зарегистрировано значительное увеличение флуоресценции зонда (рис. 3б). Таким образом, проведенный анализ показал, что флуоресцентный зонд F1uo-4/AM, в сочетании с подобранными условиями загрузки, может быть использован для регистрации изменений концентрации внутриклеточного кальция в стебле проростка высшего растения.
В дальнейшем была проведена регистрация изменения интенсивности флуоресценции F1uo-
4, загруженного в клетки стебля проростка тыквы, при генерации ВП, индуцированного ожогом семядольного листа. При генерации ВП было зарегистрировано увеличение интенсивности флуоресценции зонда, которое свидетельствует об увеличении концентрации свободного кальция в цитоплазме (рис. 4). Как видно из рисунка, динамика увеличения концентрации хорошо коррелирует с изменением электрического потенциала. Полученные результаты указывают на то, что процесс генерации ВП связан с входом в клетку ионов кальция. Известно, что при генерации другого типа потенциалов возбуждения - ПД - ионам кальция принадлежит сиг-
2+
нальная роль: увеличение концентрации Ca ведет к активации анионных каналов и инактивации протонной АТФазы, что вызывает развитие быстрой деполяризации [6, 16]. При этом вклад непосредственно ионов кальция в изменение электрического потенциала на мембране незначителен. Можно предположить, что при генерации ВП ионам кальция также принадлежит, главным образом, регуляторная роль. Развитие деполяризации при генерации ВП связывают со снижением активности протонной АТФазы плазматических мембран [2, 17]. Согласно полученным данным (рис. 4), инактивация протонной АТФазы может
быть обусловлена повышением концентра-
2+
ции ^ в цитоплазме, поскольку это ведет к фосфорилированию фермента Ca2+-зависимой протеинкиназой, вызывая снижение его активности [16, 18].
Ранее предположения об участии ионов кальция в процессе генерации ВП были высказаны в работах ряда авторов [19, 20]. В работе Жульен и соавторов [19] при блокировании входящего кальциевого потока с помощью этиленгликоль-й/5-Р-аминоэтилового эфира п'п'-тетрауксусной кислоты и La3+ было продемонстрировано снижение амплитуды медленной
волны деполяризации ВП. Также было показа-
2+
но, что удаление Са из внеклеточной среды вызывает уменьшение количества импульсов в составе ВП в гипокотиле томата [20]. Результаты впервые осуществленной в настоящей работе непосредственной регистрации изменения концентрации внутриклеточного кальция в стебле проростка тыквы при генерации ВП со-
б
ЗО
28
/фл, отн. ед.
Рис. 4. Изменение интенсивности флуоресценции F1uo-4 при генерации вариабельного потенциала, индуцированного ожогом семядольного листа: а - изменение интенсивности флуоресценции во времени, б - изменение разности потенциалов во времени. Регистрацию флуоресценции и электрической активности осуществляли на расстоянии 8 см от зоны раздражения. Стрелкой указан момент нанесения раздражения
а
гласуются с высказываемыми ранее предположениями о роли этого иона в развитии реакции.
Заключение
Полученные результаты показывают, что флуоресцентный зонд Fluo-4/AM в сочетании с подобранными нами условиями загрузки может быть использован для анализа изменения концентрации внутриклеточного кальция у высших растений при генерации потенциалов возбуждения. В частности, при генерации ВП зарегистрировано повышение интенсивности флуоресценции зонда Fluo-4, что свидетельствует об увеличении концентрации внутриклеточного кальция при формировании реакции.
Список литературы
1. Reddy A.S.N. Calcium: silver bullet in signaling // Plant Sci. 2001. V. 160. Р. 381-404.
2. Wheeler G.L., Brownlee C. Ca2+ signalling in plants and green algae - changing channels // Trends Plant Sci. 2008. V. 13. № 9. Р. 506-514.
3. Kader M.A., Lindberg S. Cytosolic calcium and pH signalling in plants under salinity stress // Plant Signalling and Behaviour. 2010. V. 5. № 3. Р. 233-238.
4. Опритов BA., Пятыгин С.С., Ретивин B.r. Биоэлектрогенез у высших растений. М.: Наука, 1991. 213 с.
5. Davies E. New functions for electrical signals in plants // New Phytol. 2004. V. 1б1. Р. б07-б10.
6. Trebacz K., Dziubinska H., Krol E. Electrical Signals in Long-Distance Communication in Plants // In: Communication in Plants. Neuronal Aspects of Plant Life / Eds. F. Baluska, S. Mancuso, D. Volkmann. Berlin, Heidelberg: Springer-Verlag, 200б. Р. 277-290.
7. Fromm J., Lautner S. Electrical signals and their physiological significance in plants // Plant Cell Environ. 2007. V. 30. Р. 249-257.
8. Пятыгин С.С., Опритов BA., Bоденеев BA. Сигнальная роль потенциала действия у высших растений // Физиология растений. 2008. V. 55. № 2. C. 312-319.
9. http://www. invitrogen. com/site/us/en/home/Refer ences/Molecular-Probes-The-Handbook/tables/Parallel-performance-comparison-of-fluo-3-and-fluo-4-on-Mole-cular-Devices-FLIPR-system.html
10. Zhang W.H., Rengel Z., Kuo J. Determination of intracellular Ca2+ in cells of intact wheat roots: loading of acetoxymethyl ester of Fluo-3 under low temperature // The Plant Journal. 1998. V. 15. № 1. P. 147-151.
11. Sang J., Zhang A., Lin F., Tan M., Jiang M. Cross-talk between calcium-calmodulin and nitric oxide in abscisic acid signaling in leaves of maize plants // Cell Research. 2008. V. 18. Р. 577-588.
12. Воденеев В.А., Акинчиц Е.К., Орлова Л.А., Сухов В.С., Балалаева И.В. Регистрация изменений внеклеточного pH методом конфокальной микроскопии при генерации потенциалов возбуждения у высшего растения // Цитология. 2010. Т. 52. С. 549-554.
13. Веселовский В.А., Веселова Т.В. Люминесценция растений. М.: Наука, 1990. 145 с.
14. Рубин А.Б. Биофизика. T. 2. М.: Наука, 2004. 304 с.
15. Кларксон Д. Транспорт ионов и структура растительной клетки. М.: Мир, 1978. 368 с.
16. Воденеев В.А., Опритов В.А., Пяты-гин С.С. Обратимое изменение внеклеточного рН при генерации потенциала действия у высшего растения Cucurbita pepo // Физиол. раст. 2006. Т. 53. № 4. С. 538-545.
17. Stahlberg R., Robert E., Cleland, Elizabeth van Volkenburgh. Slow wave potentials - a propagating
electrical signal unique to higher plants // In: Communication in Plants. Neuronal Aspects of Plant Life / Eds. F. Baluska, S. Mancuso, D. Volkmann. Berlin-Heidelberg: Springer-Verlag, 2006. P. 291-309.
18. De Nisi P., Dell'Orto M., Pirovano L., Zocchi G. Calcium-dependent phosphorylation regulates the plas-ma-membrane H+-ATPase activity of maize (Zea mays L.) roots // Planta. 1999. V. 209. P. 187-194.
19. Julien J.L., Frachisse J.M. Involvement of the proton pump and proton conductance change in the wave of depolarization induced by wounding in Bidens pilosa // Can. J. Bot. 1992. V. 70. P. 1451-1458.
20.Rousset M., de Roo M., Guennec J.-Y., Pichon O. Electrophysiological characterization of tomato hypocotyls putative action potentials induced by cotyledon heating // Physiol. Plant. 2002. V. 115. P. 197-203.
ASSESSMENT OF FLUORESCENT PROBE APPLICATION FOR THE ANALYSIS OF INTRACELLULAR CALCIUM CONCENTRATION CHANGES WHEN GENERATING EXCITATION POTENTIALS IN HIGHER PLANTS
L.A. Orlova, E.K. Akinchits, E.A. Sergeeva, V.N. Nerush, V.A. Vodeneev
A technique for Ca2+-sensitive fluorescent probe loading into pumpkin stem cells has been adapted to register calcium concentration changes when generating excitation potentials. To control the probe loading into the intracellular space, the analysis of confocal images and the emission spectra has been carried out by means of confocal microscopy and the use of the calcium ionophor A23187. We have found that the adapted loading conditions provide fluorescent probe accumulation in the cells and enable its use for studying intracellular calcium concentration changes. The use of the calcium-sensitive fluorescent probe Fluo-4/AM has made it possible to register an increase of calcium concentration in seedling stem cells during the propagation of a variation potential induced by a leaf burn.
Keywords: higher plants, confocal microscopy, Fluo-4 AM, dynamics of Ca2+ concentration.
