CC BY
20
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
ВАКЦИНОЛОГИЯ
© КОЛЛЕКТИВ АВТОРОВ, 2018
Ахматова Н.К.1, Калиниченко Е.О.1, Ахматова Э.А.1, Макаренкова И.Д.2, Сходова С.А.1, Столпникова В.Н.1, Ивин Ю.А.3, Михайлова Н.А.1
ОЦЕНКА ВЛИЯНИЯ БЕЛКОВ OPRF И ATOX PSEUDOMONAS AERUGINOSA НА СОЗРЕВАНИЕ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК МЫШЕЙ IN VITRO
1 ФГБНУ НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова, Москва, Россия;
2 ФГБНУ НИИ эпидемиологии и микробиологии им. ГП. Сомова, Россия;
3 ФГБНУ «Институт полиомиелита и вирусных энцефалитов им. М.П. Чумакова», Москва, Россия
В настоящее время накоплены многочисленные экспериментальные и клинические данные об успешном применении в иммунотерапии онкологических и инфекционных заболеваний клеточных вакцин на основе дендритных клеток (ДК). Цель: исследовать морфологические и иммунофенотипические особенности ДК, генерированных из клеток-предшественников костного мозга мышей линии BALB/c под воздействием рекомбинантных антигенов OprF и aTox Pseudomonas aeruginosa.
Материалы и методы. Препараты. 25 мкг OprF, 50 мкг aTox, сорбированные на 75 мкг гидроксида алюминия (ФГБНУ НИИВС, Россия). Препарат рекомбинантных белков смешивали в равных весовых долях с гелем гидроксида алюминия, разводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и проводили сорбцию в течение 12 часов при температуре 4 °С. Дендритные клетки (ДК) получали из клеток костного мозга мышей линии BALB/c при культивировании с GM-CSF и IL-4 (Biosource, США). В качестве индуктора созревания использовали белки OprF и aTox P. аeruginosa (15 мкл/мл) и коммерческий TNF-a (20 нг/мл, Biosource, США).
Оценку иммунофенотипа ДК осуществляли методом проточной цитометрии. Окраску актинового цитоскелета производили с использованием фаллоидина с флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 594 phalloidin, Invitrogen). Результаты. Установлено, что морфологические характеристики дендритных клеток при использовании в качестве индуктора созревания как белков OprF и aTox, так их сочетания с гидроксидом алюминия, не имеют существенных отличий. Исследуемые препараты вызывали снижение численности незрелых клеток (CD34), увеличение клеточной популяции с маркерами адгезии и межклеточных взаимодействий (CD38), антигенной презентации MHCII, костимулирующими молекулами CD80/CD86 и молекулой терминальной дифференцировки. Но все же белки в присутствии адъюванта активнее стимулировали дифференцировку ДК.
Выводы. Кандидатная вакцина против синегнойной палочки на основе ее рекомбинантных белков OprF и aTox индуцирует созревание дендритных клеток из клеток-предшественников костного мозга мышей. Полученные данные расширяют возможности для разработки новых источников индукции созревания дендритных клеток, а также могут служить критерием оценки эффективности разрабатываемой вакцины против синегнойной инфекции.
Ключевые слова: рекомбинантные белки OprF и aTox Pseudomonas aeruginosa; дендритные клетки.
Для цитирования: Ахматова Н.К., Калиниченко Е.О., Ахматова Э.А., Макаренкова И.Д., Сходова С.А., Столпникова В.Н., Ивин Ю.А.3, Михайлова Н.А. Оценка влияния белков oprfи atoxpseudomonas aeruginosa на созревание дендритных клеток мышей in vitro. Иммунология. 2018; 39(5-6): 270-275. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-270-275
Akhmatova N.K.1, Kalinichenko E.O.1, Akhmatova E.A.1, Makarenkova I.D.2, Skhodova S.A.1, Stolpnikova V.N.1, Ivin Yu.A.3, Mikhaylova N.A.1
EVALUATION OF THE EFFECT OF PROTEIN OPRF OF PSEUDOMONAS AERUGINOSA AND ATOX FOR THE MATURATION OF DENDRITIC CELLS IN MICE IN VITRO.1 MECHNIKOV SCIENTIFIC RESEARCH INSTITUTE FOR VACCINES AND SERA, MOSCOW, RUSSIA;
2 Somov Scientific Research Institute of Epidemiology and Microbiology, Vladivostok, Russia;
3 SBSI «M.P. Chumakov Institute of Poliomyelitis and Viral Encephalitides» Moscow, Russia
There are multiple experimental and clinical evidences (data) of the successful using of the cellular vaccines based on the DC in immunotherapy of the oncological and infectious diseases.
Objective: To study the morphological features and immunophenotype of DC, generated from BALB/c mice bone marrow progenitor cells, under the influence of recombinant OprF и aTox Pseudomonas aeruginosa antigens. Materials and methods. Preparation: 25 |jg of OprF, 50 |jg of aTox sorbed by 75 |jg of aluminum hydroxide. The recombinant protein preparation was mixed in equal weight fractions with an aluminum hydroxide gel, diluted in phosphate buffered saline (PbS), and sorbed for 12 hours at 4 °C.
Dendritic cells (DC) were obtained from bone marrow cells of BALB/c mice when cultured with recombinant GM-CSF and IL-4 (Biosource, USA) for 6 days. OprF and aTox of P. aeruginosa (15 jil/ml) and commercial TNF-a (20 ng/ml, Biosource, USA) were used as the inducer of maturation of DC.
Immunophenotype of the DC was estimated by using of the flow cytometry method.
Для корреспонденции: Ахматова Нэлли Кимовна, д-р мед. наук, зав. лаб. механизмов регуляции иммунитета ФГБНУ НИИВС им. И.И. Мечникова, e-mail: anelly@mail.ru
ORIGINAL ARTICLE
Results. We reviled that morphological features of the DC when used OprF/aTox antigens and their combination with aluminium hydroxid as inductor of DC maturation, have no sufficiently differences.
Test preparations caused a decrease in the number of immature cells (CD34), an increase in the cell population with adhesion markers (CD38), antigen presentation of MHCII, costimulatory CD80 / CD86 molecules and a terminal differentiation molecule (CD83).
Conclusions. The candidate Pseudomonas aeruginosa vaccine based on its recombinant OprF and aTox proteins OprF u aTox induces the maturation of the DC generated from mice bone marrow cells. The obtained data expand the possibilities for developing new sources of the inducers of DC maturation, and can also serve as a criterion for evaluating the effectiveness of the developed vaccine against Pseudomonas aeruginosa.
Keywords: recombinant proteins OprF and aTox Pseudomonas aeruginosa; dendritic cells.
For citation: Akhmatova N.K., Kalinichenko E.O., Akhmatova E.A., Makarenkova I.D., Skhodova S.A., Stolpnikova V.N., Ivin Yu.A., Mikhaylova N.A. Evaluation of the effect ofprotein oprf ofpseudomonas aeruginosa and atox for the maturation of dendritic cells in mice in vitro. Immunologiya. 2018; 39(5-6): 270-275. DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-270-275
For correspondence: Akhmatova Nelli Kimovna, Dr. Sci. Med., Head. Lab. of Mechanisms of Immunity Regulation, I.I. Mechnikov Research Institute for Vaccines and Sera, e-mail: anelly@mail.ru
Information about author:
Akhmatova N.K., https://orcid.org/my-orcid
conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Acknowledgments. The study had no sponsorship.
Received 02.11.17 Accepted 16.03.18
введение
Ключевую роль в инициации иммунных реакций играют дендритные клетки (ДК) - наиболее активные и высокоспециализированные антигенпрезентирующие клетки. Они принимают участие на всех этапах реализации эффекторных функций иммунитета, обладают уникальной способностью регулировать иммунные процессы в организме и поддерживать гомеостаз иммунокомпетентных клеток. От эффективной работы этих клеток как основных участников системы контроля иммунного ответа прежде всего зависит регуляция центральной и периферической толерантности как к ауто-, так и к аллоантигенам [1, 2].
Способность ДК эффективно представлять антиген Т-лимфоцитам активно используется для генерации специфических иммунных клеток-эффекторов и для создания про-тивоинфекционных и противоопухолевых вакцин [3, 4].
ДК, являясь ключевыми эффекторами врожденного иммунитета, обеспечивают не только первую линию защиты от патогена, но играют ключевую роль в процессинге, презентации антигена Т-лимфоцитам, тем самым, определяют поляризацию T-хелперов в иммунном ответе [5]. В настоящее время актуален поиск препаратов, активирующих ДК. Наиболее перспективным считается применение препаратов микробного происхождения, поскольку они несут лиганды для TLRs системы врожденного иммунитета. К таким препаратам относится комплекс рекомбинантных антигенов Pseudomonas aeruginosa OprF и aTox, обеспечивающий наличие патоген-ассоциированных молекулярных структур (ПАМС), которые, возможно, могут распознаваться TLRs антигенпрезентирующих клеток.
В НИИВС им. И.И. Мечникова ведется разработка кандидат-ной вакцины против синегнойной палочки на основе ее рекомби-нантных белков OprF и aTox (делеционной атоксической формы экзотоксина А), сорбированных на гидроксиде алюминия.
Цель исследования: изучение влияния рекомбинантных антигенов Pseudomonas aeruginosa OprF и aTox на созревание ДК, генерированных из клеток-предшественников костного мозга мышей. Исследование морфологических и имму-нофенотипических характеристик клеток.
Материал и методы
Мыши. Мышей линии BALB/c, массой 18-20 г получали из питомника «Столбовая» Московской области. Для получения дендритных клеток (ДК) использованы клетки костного
мозга 30 мышей. Животных выводили из эксперимента под эфирным наркозом в соответствии с «Правилами проведения работ с использованием экспериментальных животных».
Препараты. 25 мкг OprF, 50 мкг aTox, сорбированные на 75 мкг гидроксида алюминия (ФГБНУ НИИВС). Препарат рекомбинантных белков смешивали в равных весовых долях с гелем гидроксида алюминия, разводили в фосфатно-солевом буфере (ФСБ) и проводили сорбцию в течение 12 ч при температуре 4 °С.
Культивирование ДК. ДК получали из клеток костного мозга мышей линии BALB/c. Костный мозг мышей гомогенизировали в среде RPMI -1640 (Sigma, США), трижды осаждали центрифугированием (250 g x 5 мин) и переводили в обогащенную среду культивирования (106 клеток в 1 мл среды RPMI-1640 с добавлением 10 мкг/мл гентамицина сульфата и 10 % термоинактивированной эмбриональной телячьей сыворотки - ЭТС), содержащую по 20 нг/мл реком-бинантные GM-CSF и IL-4 (Biosource, США). На шестые сутки производили смену среды и в культуру незрелых ДК (нДК) мышей вносили вакцинный препарат по 15 мкл (0,75 мкг OprF и 1,5 мкг aTox) на миллилитр культуральной жидкости. В качестве классического индуктора созревания (позитивный контроль) использовали коммерческий TNF-a (20 нг/мл, Biosource, США).
Оценку иммунофенотипа ДК осуществляли методом проточной цитометрии на приборе Cytomix FC-500 (Beck-man Coulter, США) с применением моноклональных антител (МКА) (eBiosciences, США), меченных флуорохромом, к определяемому маркеру: CD34-FITC (clone RAM 34, кат. №. 11-0341-82), CD38-FITS (clone 90, кат. № 11-0381-82), CD83-PE (clone Michel-17, кат. № 12-0831-80), CD86-PE (GL-1, кат. №120862-81), CD80- FITS (clone 16-10A1, кат. № 11-080182), CD11c-FITS (clone 418, кат. №11-0114-81), MHCII-FITS (clone NIMR-4, кат. №11-5322-82), СD14-PE (clone Sa2-8, кат. №12-0141-82), CD282 (TLR2)-FITS (clone 6C2, кат. №119021-82), CD-284 (TLR4)-PE (clone UT41, кат. №12-9041-80) (eBioscience, США).
Фиксация и окраска клеток. Клетки культивировали в культуральных плоскодонных планшетах с покровным стеклом 24, 48 или 72 часа. Отбирали среду из лунок со стеклами и фиксировали клетки 3,7 % раствором параформаль-дегида на PBS 15 мин при комнатной температуре. Окраску актинового цитоскелета производили с использованием фаллоидина с флуоресцентным красителем (Alexa Fluor 594
ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
phalloidin, Invitrogen) в разведении 1 : 150. Молекулу ДНК клеток окрашивали водным раствором красителя Hoechst 33342 (Sigma), разведенном до концентрации 1цг/мл.
Получение снимков ДК, окрашенных антителами. Фотографии клеток на стеклах делали при помощи микроскопа Nikon Eclipse Ti-U, оснащенного камерой Infinity 3, и флуоресцентными фильтрами UV-1A (для препаратов, окрашенных красителем Hoechst 33342 [Sigma]), B-2A (для наблюдения флуоресценции в зеленом диапазоне) и G-2A (для наблюдения флуоресценции в красном диапазоне).
Статистическую обработку данных проводили с помощью программы «Statistwa 10». Достоверность различий между сравниваемыми величинами определяли в рамках непараметрической базовой статистики с использованием ^-критерия Mann-Whitney. Различия рассматривались как значимые при p < 0,05.
Результаты
Инвертированное изображение клеток, генерированных из клеток-предшественников костного мозга мышей, под микроскопом (рис.1) было представлено звездчатыми формами с характерными цитоплазматическими отростками, что соответствует описанию ДК другими исследователями [1, 2, 6, 7]. Клетки, прилипшие к покровным стеклам, при культивировании в плоскодонных планшетах имели крупные размеры, овальную или неправильную форму, вуалевидный характер, эксцентрично расположенное ядро с многочисленными инвагинациями, на поверхности клеток располагались многочисленные длинные, тонкие, иногда ветвящиеся отростки (рис. 2).
Влияние рекомбинантных белков Pseudomonas aeruginosa OprF и aTox на созревание дендритных клеток у мышей оценивали по изменению иммунофенотипических особенностей клеток.
ДК, обладающие фенотипическими признаками незрелых, проявляющимися низким уровнем экспрессии костимулирую-щих и MHC молекул, были получены из предшественников костного мозга в результате инкубации с GM-CSF и IL-4 (табл. 1).
Таблица
Влияние белков OprF и aTox Pseudomonas aeruginosa на созревание дендритных клеток у мышей
Маркёр M±g (%); Me ± (LQ-UQ)
ДК OprF и aTox OprF и aTox + Al(OH)3 TNF-a 1 Н-ДК
CD34+ 18,53 ± 1,3* 15,46 ± 2,4* 17,36 ± 1,35* 42,9 ± 1,9**
19,9(47,3-54,1) 18(13,2-18) 18,8(16,1-18,8) 45(41,1-45)
CD14 44,27 ± 3,72*,** 42,1 ± 2,87*,** 37,6 ± 3,19* 58,2 ± 3,32**
45,1(40,2-47,5) 42,5(39-44,7) 38,7(34-40,1) 57(55,7-62)
CD38 30,4 ± 3,05*,",# 51,2 ± 2,78* 45,03 ± 3* 18,6 ± 2,26**
30,5(27,3-33,4) 51,7(48,2-53,7) 45,1(42-48) 19,2(16,1-20,5)
MHCII 50,7 ± 3,4*,# 73,1 ± 3,3*,** 52,3 ± 3,1* 22,36 ± 2,35**
50,9(46,3-54,1) 73,1(70,1-76,7) 52,6(49,1-55,3) 22,2(20,1-24,8)
CD80 51,56 ± 2,2*, ** # 63,3 ± 3,3* 66,43 ± 2,4* 29,5 ± 2,1**
51,5(49,4-53,8) 63,2(60,1-66,7) 66,39(64,1-68,9) 29,8(27,3-31,5)
CD86 61,2 ± 3,96* 67,2 ± 4* 63,86 ± 3,85* 13,7 ± 2,1**
61,6(57,1-65) 67,6(63,1-71,1) 63,7(60,1-67,8) 13,4(11,7-16)
CD80/ 50,2 ± 2,7*,# 60,2 ± 1,97* 50,43 ± 2,46* 21,33 ± 2,08**
MHCII 50(47-53) 60,5(48,1-53) 50,2(48,1-53) 20,5(19,8-23,7)
CD83 48,2 ± 2,2* 64,5 ± 4,1*,** 53,4 ± 3,5* 8,1 ± 1,95**
48,3(45-51,4) 64(60,4-68,6) 53,1(50-57) 8,1(6,1-10)
TLR2 31,2 ± 2,56* 36,1 ± 2,85* 35,7 ± 4,9* 54,86 ± 3,8 **
31,5(28,5-33,6) 36,2(33,2-38,9) 36,6(30,5-40,2) 56,7(505,5-57,4)
TLR4 22,57 ± 2,3* 20,9 ± 2,8* 24,7 ± 3,03 28,9 ± 1,71
22,7(20,2-24,8) 21,8(17,8-23,2) 25,5(21,3-27,2) 29,1(27,1-30,5)
Примечание. M±a - средняя арифметическая±стандартное отклонение; Me - медиана значений, LQ-UQ - нижний и верхний квартили. * -p < 0,05 по сравнению с группой контроля; **-p < 0,05 по сравнению с TNF-a; #-p < 0,05 по сравнению с сорбированными белками (критерий Mann-Whitney).
Степень дифференцировки и зрелости ДК, полученных из клеток костного мозга мышей, определяли по изменению уровня экспрессии дифференцировочных молекул CD34, CD38, CD80, CD86, CD83, CD14, MHC II через 3 суток после добавления к незрелым ДК рекомбинантных белков P.aeruginosa OprF и aTox и TNF-a. (см. табл. 1, рис. 3-6).
Комплекс белков OprF и aTox вызывал снижение численности незрелых (CD34) ДК с 42,9 до18,53% (в 2,3 раза), а белки, сорбированные на гидроксиде алюминия - до 15,46% (в 2,77 раза). Классический индуктор созревания TNF-a вызывал снижение количества незрелых ДК в 2,47 раза. Это свидетельствует о том, что поверхностные белки синегнойной палочки снижают численность недифференцированных клеток.
По мере созревания в культуре ДК снижалось содержание CDM-экспрессирующих клеток - с 58,2 до 44,27% (OprF/ aTox, в 1,31 раза), до 42,1% OprF/aTox+AL (в 1,38 раза; p < 0,05); до 37,6% TNF-a (в 1,55; p < 0,05). Наличие CD14-экспрессирующих клеток предполагает присутствие в культуре также определенного пула клеток миело-моноцитарной линии дифференцировки.
OprF/aTox+AL и TNF-a приводили к увеличению численности клеток с маркером CD38, соответственно, с 18,6 до 30,4% и 51,4% (в 2,75 и 2,4 раза). Несорбированные белки повышали число данных клеток в 1,63 раза (30,4%) по сравнению с нДК, уступая активности адъюванта в 1,68 раза.
После стимуляции нДК они приобретали фенотип, свойственный активированным зрелым ДК, так увеличивалась субпопуляция с экспрессией активационного маркера MHCII, обеспечивающая презентацию антигена Т-лимфоцитам.
Численность клеток с маркером костимуляции CD86 на ДК также повышалась при стимуляции OprF/aTox в 4,47 раз (с 13,4 до 61,2%), OprF/aTox+AL - в 4,9 раз (до 67,2%) и TNF-a - в 4,66 раза (до 63,86%),p < 0,05.
В культуре нДК численность CD80-экспрессирующих клеток составила 29,5%. OprF/aTox без и с гидроксидом алюминия, а также TNF-a индуцировали нарастание количества клеток с костимулирующими молекулами, соответственно до 51,5, 63,3 и 66,43% (в 1,74, 2,14 и 2,25 раза).
В культуре активированных белками синегнойной палочки без и с адъюван-том, а также ДК, стимулированных классическим индуктором созревания TNF-a, существенно увеличивалась численность клеточной популяции с маркерами CD80/ MHCII (соответственно с 21,33 до 50,2 %, 60,2 и 50,43 %) в 2,35, 2,82 и 2,35 раза (p < 0,05). При этом активность белков, сорбированных на гидроксиде алюминия, была наиболее высокой, превышающей активность самих белков и TNF-a в 1,19 раза.
Все исследуемые препараты индуцировали дифференцировку ДК, так как обладали способностью стимулировать их созревание. На OprF/aTox-ДК возрастала экспрессия маркера терминальной диф-ференцировки CD83 с 8,1 до 48,2 % (в 5,95 раза), OprF/aTox+AL-ДК - до 64,5 % (в 7,96 раза), TNF-a-ДК - до 53,4% (в 6,59 раза). Сорбированные белки в 1,34 раза сильнее индуцировали дифференцировку ДК по сравнению с несорбированными.
Введение исследуемых препаратов в культуру нДК приводило к увеличению численности популяции CD11+ миело-идных ДК. Если среди нДК их было не более 16,76%, то поверхностные белки синегнойной палочки индуцировали их
1
ORIGINAL ARTICLE
Рис. 1. Дендритные клетки, генерированные из клеток-предшественников костного мозга мышей Balb/c, в культуре на 9-е сутки (3-и сутки после обработки OprF/aTox (в 0,5 мл 25 мкг OprF, 50 мкг aTox).
Микрофотография дендритных клеток при фазово-контрастной микро-скопиии культуральной взвеси, ок. 10, об. 40.
до 25,3 % (в 1,5 раза), белки, сорбированные на гидроксиде алюминия - 38,37 % (в 2,3 раза), ТОТ-а - 39,93 (в 2,38 раза), p <0,05. Белки с адъювантом обладали большим потенциалом к дифференцировке миелоидных клеток по сравнению с несор-бированными белками.
нДК в большей степени экспрессировали на своей поверхности TLR2 (54,86 %). По мере созревания под воздей-
Рис. 2. Дендритные клетки, генерированные из клеток-предшественников костного мозга мышей Balb/c.
a - незрелые ДК, б - созревшие под воздействием TNF-a (20 нг/мл), в - OprF/aTox+AL (в 0,5 мл 25 мкг OprF, 50 мкг aTox, сорбированные на 75 мкг гидроксида алюминия), г - OprF/aTox (в 0,5 мл 25 мкг OprF, 50 мкг aTox). В культуру вносили по 15 мкл/мл препаратов. Микрофотография дендритных клеток при флуоресцентной микроскопиии стекол с адгезированными ДК, ок. 10, об. 40. Использованы фильтры UV-1A (для препаратов, окрашенных красителем Hoechst 33342), B-2A (для наблюдения флуоресценции в зеленом диапазоне) и G-2A (Alexa Fluor 594 phalloidin, для наблюдения флуоресценции в красном диапазоне).
ствием исследуемых препаратов снижалась численность клеток с данным маркером: 31,2% - OprF/aTox (1,75 раза), 36,1%
- OprF/aTox+AL (1,52 раза), 35,7% - TNF-a (1,54 раза).
В отношении TLR4 также отмечалась тенденция к снижению клеток с его экспрессией с 28,9% до 22,57% - OprF/aTox (в 1,28 раза;p < 0,05); до 20,9 % - OprF/aTox+AL (в 1,38 раза; p < 0,05); до 24,7 % - TNF-a (в 1,17 раза; p > 0,05).
Обсуждение полученных результатов
Исследование иммунофенотипа и морфологии клеток, полученных из предшественников костного мозга мышей при воздействии GM-CSF и IL-4, позволяет отнести их к популяции незрелых дендритных клеток.
Зрелость ДК определяется совокупностью морфологических, иммунофенотипических и функциональных параметров [6]. ДК при применении в качестве индукторов созревания комплекса белков OprF/aTox и TNF-a обладали типичной морфологической характеристикой зрелых клеток
— имели многочисленные разветвленные отростки на поверхности, необходимые для контакта с окружающими клетками, в частности для эффективного представления антигена Т-лимфоцитам, овальную форму с эксцентрично расположенным ядром, чаще неправильной формы с хроматином.
Исследование иммунофенотипа ДК показало, что комплекс белков OprF и aTox с гидроксидом алюминия, так и без него способствовал дифференцировке ДК, поскольку вызывал снижение численности незрелых клеток более чем в 2 раза. В то же время, ДК под воздействием исследуемых препаратов начинали экспонировать маркеры CD38, что может свидетельствовать о приобретении способности к контактным взаимодействиям с клетками эндотелия, активационную молекулу MHCII, которая также служит средством, обеспечивающим презентацию антигенов [7, 8]. Важную роль в процессе презентации играют костимуляционные молекулы CD80/CD86, усиливающие клеточные контакты при представлении антигена Т-лимфоцитам [7]. В наших исследованиях численность клеток с экспрессией костимулирующих молекул увеличивалась в присутствии исследуемых белков в 4,5-5 раз (CD86) и 1,7-2 (CD80) раза, что также является показателем созревания ДК. Но более надёжным критерием, свидетельствующим о дифференцировке клеток, служит показатель терминальной дифференцировки ДК - CD83. Популяция ДК без индуктора созревания, экспрессирующая данную молекулу, составила лишь 8%, а внесение комплекса белков синегнойной палочки или сорбированных белков увеличивали численность созревших клеток до 48 % и выше. Следует отметить, что активность препарата в присутствии адъюван-та была выше.
Процессу распознавания отводится важная роль в иммунологической защите, так как только отобранные посредством специфических рецепторов антигены могут быть пре-зентированы и элиминированы в процессе иммунного ответа. Именно такие распознающие рецепторы (PRRs) передают сигналы для активации клеток с высвобождением каскада цитокинов [9-11]. К таким молекулам относят Toll-like-рецепторы (TLRs), распознающие PAMPs (патоген-ассоциированные молекулярные структуры), присутствующие как на живых микробных клетках, так и их компонентах (антигены, вакцины) [, 12].
Больше половины незрелых ДК экспрессировали на своей поверхности TLR2 и около 30% - TLR4. В процессе созревания под
%
Иммунология. 2018; 39(5-6)
DOI: http://dx.doi.org/10.18821/0206-4952-2018-39-5-6-270-275 ОРИГИНАЛЬНЫЕ СТАТЬИ
Рис. 3. Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров дифференцировки) зрелых ДК, полученных с использованием ТОТ-а (20 нг/мл).
Здесь и на рис. 4—6: дотплот - светорассеяние (популяция зрелых ДК в очерченной области), на гистограммах левый пик - аутофлюоресценция клеток при использовании изотипического контроля, правый - флюоресценция ^1ТС - флюоресциинизотиоционат и R-PE фикоэритрин) после окрашивания соответствующими антителами.
По оси абсцисс - интенсивность флюоресценции, по оси ординат - количество клеток.
Рис. 4. Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров дифференцировки) незрелых ДК, полученных с использованием GM-CSF и ^-4 (по 20 нг/мл).
Рис. 5. Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров дифференцировки) незрелых ДК, полученных с использованием Ор^/аТох (25 мкг Ор^, 50 мкг аТох).
ORIGINAL ARTICLE
Рис. 6. Гистограммы, отражающие экспрессию поверхностных молекул (кластеров дифференцировки) незрелых ДК, полученных с использованием OprF/aTox+AL (25 мкг OprF, 50 мкг aTox, сорбированные на 75 мкг гидроксида алюминия).
Таблица 2.
Индекс стимуляции созревания дендритных клеток мышей под воздействием белков Pseudomonas aeruginosa OprF и aTox
Индекс стимуляции, у. е. *
Маркер ДК OprF и aTox OprF и aTox +Al(OH)3 TNF-a
CD34+ 2,3 2,77 2,47
CD14 1,31 1,38 1,55
CD38 1,63 2,75 2,4
MHCII 2,26 3,27 2,34
CD80 1,74 2,14 2,25
CD86 4,47 4,9 4,66
CD80/MHCII 2,35 2,82 2,36
CD83 5,95 7,96 6,59
TLR2 1,75 1,52 1,54
TLR4 1,28 1,38 1,17
Примечание. * - индекс стимуляции - кратность изменения показателя по отношению к нДК (незрелые ДК).
влиянием белков синегнойной палочки снижалась численность TLR2+ и TLR4+-клеток соответственно в 1,75 и 1,28 раза, и в 1,52 и 1,38 раза - белков с адъювантом. Вероятно, данный механизм можно объяснить тем, что по мере созревания у дендритных клеток снижается возможность распознавания лигандов, но повышается способность к антигенной презентации уже процессированного антигена.
Таким образом, в наших исследованиях продемонстрирована возможность получения культуры клеток, состоящей как из зрелых ДК, так и клеток миело-моноцитарного ряда из костномозговых предшественников мышей при цитокиновой стимуляции с использованием в качестве индуктора созревания ДК не только TNF-a, но и рекомбинантных антигенов OprF и aTox Pseudomonas aeruginosa.
Возможно, создание вакцин на основе ДК для адоптивной иммунотерапии может быть перспективным в профилактике и терапии инфекционных заболеваний, а также может служить критерием оценки эффективности разрабатываемой вакцины против синегнойной инфекции.
Финансирование. Исследование не имело спонсорской поддержки.
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
литература (пп. 2-12 см. В REFERENCES)
1. Ахматова Н.К., Киселевский М.В. Врожденный иммунитет: противоопухолевый и противоинфекционный. М.: Практическая медицина, 2008.
references
1. Akhmatova N.K., Kiselevskiy M.V. Innate immunity: antitumor and anti-infectious. [Vrozhdennyy immunitet: protivoopukholevyy i pro-tivoinfektsionnyy]. Moscow: Practical medicine; 2008.
2. Castell-Rodríguez A., Piñón-Zárate G., Herrera- Enríquez M., Jarquín-Yáñez K., Medina-Solares I. Dendritic Cells: Location, Function, and Clinical Implications. In: Biology of Myelomonocytic Cells, ed. by Anirban Ghosh, ISBN 978-953-51-3124-3, Print ISBN 978-953-51-3123-6, InTech, 2017.
3. Aandahl E.M., Michaelsson J., Moretto W.J., Hecht F.M., Nixon D.F. . Human CD4+ CD25+ regulatory T cells control T-cell responses to human immunodeficiency virus and cytomegalovirus antigens. J. Virol. 2004; 78: 2454-9.
4. Doherty M.T., Arditi M. TB, or not TB: that is the question - does TLR signaling hold the answer? Clin Invest. 2004; 114(12): 1699-703.
5. Chow K., Lew M., Sutherland R., Zhan Y. Monocyte-Derived Dendritic Cells Promote Th Polarization, whereas Conventional Dendritic Cells Promote Th Proliferation. J. Immunol. 2016; 196(2): 624—36.
6 Dalod M., Chelbi R., Malissen B., Lawrence T. Dendritic cell maturation: functional specialization through signaling specificity and transcriptional programming. EMBO J. 2014; 33(10): 1104-16.
7. Paul W.E. Fundamental Immunology, 6th edition. Philadelphia: WoltersKluwer. Lippincott Williams & Wilkins, 2008.
8. Malavasi F., Deaglio S., Funaro A., Ferrero E., Horenstein A.L., Ortolan E., Vaisitti T., Aydin S. Evolution and function of the ADP ribo-syl cyclase/CD38 gene family in physiology and pathology. Physiol. Rev. 2008; 88(3): 841-86.
9. Kawai T., Akira S. The role of pattern-recognition receptors in innate immunity: update on Toll-like receptors. Nat. Immunol. 2010; 11: 373-84.
10. Satoh T., Akira S. Toll-Like Receptor Signaling and Its Inducible Proteins. Microbiol. Spectr. 2016; 4(6).
11. Takeuchi O., Akira S. Pattern recognition receptors and inflammation. Cell. 2010; 140(6): 805-20.
12. Dowling, J. K., Mansell, A. Toll-like receptors: the swiss army knife of immunity and vaccine development. Clin. Transl. Immunology. 2016; 5(5): e85.
Поступила 02.11.17 Принята в печать 16.03.18
