CC BY
82
УДК 611.018.83:615.37:[615.322:582.272.46]:577.114
И.Д. Макаренкова1, Н.К. Ахматова2, И.Б. Семенова1, Н.Н. Беседнова1, Т.Н. Звягинцева3
1 НИИ эпидемиологии и микробиологии СО РАМН, (690087 г. Владивосток, ул. Сельская, 1), 2 НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова РАМН (105064 г. Москва, М. Казенный пер., д. 5а), 3 Тихоокеанский институт биоорганической химии ДВО РАН (690022 г. Владивосток, пр-т 100 лет Владивостоку, 159)
СУЛЬФАТИРОВАННЫЕ ПОЛИСАХАРИДЫ ИЗ МОРСКИХ БУРЫХ ВОДОРОСЛЕЙ -ИНДУКТОРЫ СОЗРЕВАНИЯ ДЕНДРИТНЫХ КЛЕТОК
Ключевые слова: дендритные клетки, толл-подобныерецепторы, фукоиданы.
Проведено экспериментальное исследование влияния сульфатированных полисахаридов — фукоиданов, выделенных из морских бурых водорослей Laminaria cichorioides и Laminaria japonica, на созревание дендритных клеток, полученных из костного мозга мышей. Установлено, что фукоиданы индуцируют экспрессию маркера терминальной дифференцировки, усиливают экспрессию активационного маркера, молекул адгезии, поверхностных антигенпред-ставляющих, костимулирующих молекул и толл-подобных рецепторов на мембранах дендритных клеток, что свидетельствует об их созревании.
Одними из ключевых элементов врожденного иммунитета являются дендритные клетки, способные распознавать патогенные микроорганизмы и участвовать в определении направленности и реализации эффекторных функций [4—6, 8, 9]. Отличительной чертой дендритных клеток по сравнению с другими антигенпрезентирующими клетками является их способность представлять антигены и активировать наивные Т-клетки [4, 5, 8].
Созревание дендритных клеток является сложным процессом, который запускается в условиях инфекции, разрушения тканей и воспаления и инициируется различными факторами. К ним относятся патогенассоциированные молекулярные структуры патогенных микроорганизмов, являющиеся лигандами толл-подобных рецепторов (Toll-Like Receptors — TLR), TNF-подобные сигналы, провоспалительные цитокины и продукты некроза тканей, в норме отсутствующие в межклеточной среде [4—6, 9, 10].
В последние годы получены данные, свидетельствующие о том, что иммуномодуляторы микробного происхождения являются не только индукторами созревания дендритных клеток, но и влияют на их функциональную активность, что определяет направление дифференцировки Т-лимфоцитов [1, 6].
Известно, что сульфатированные полисахариды — фукоиданы из морских бурых водорослей — обладают выраженной иммуномодулирующей, антикоагу-лянтной, противовирусной, противовоспалительной, противоопухолевой и антибактериальной активностью [2, 7, 11]. Однако практически неизученным остается их действие на созревание и функциональную активность дендритных клеток. В 2008 г. за рубежом появились единичные работы о стимулирующем влиянии фукоидана из бурой водоросли Fucus vesiculosus
Макаренкова Илона Дамировна — канд. мед. наук, старший научный сотрудник лаборатории иммунологии НИИЭМ СО РАМН; тел.: 8 (4232) 44-24-46; e-mail: ilona_m@mail.ru.
на экспрессию определенных маркерных генов, связанных с созреванием дендритных клеток [12, 15].
Целью настоящей работы был анализ влияния фу-коиданов, выделенных из морских бурых водорослей Laminaria japonica и Laminaria cichorioides на созревание дендритных клеток костного мозга мышей.
Материал и методы. Эксперимент выполнен на 30 мышах линии СВА: самцы весом 18—20 г, полученные из питомника НЦ биомедицинских технологий «Андреевка» (Московская обл.). Животные содержались в стандартных условиях вивария, с соблюдением правил и международных рекомендаций Европейской конвенции по защите позвоночных животных, используемых в экспериментальных работах. Исследования проведены с разрешения комитета по биомедицинской этике НИИ вакцин и сывороток им. И.И. Мечникова.
Выделение, изучение химического состава и структуры фукоиданов из морских бурых водорослей проведено в Тихоокеанском институте биооргани-ческой химии ДВО РАН. Фукоидан, выделенный из бурой водоросли L. japonica, является a-L-фуканом, сульфатированным в основном по С-4 остаткам фу-козы (молекулярная масса 10—30 кДа), отличается высоким содержанием галактозы. Моносахаридный состав представлен галактозой, маннозой, ксилозой и глюкозой в соотношении 65:20:8:4:3 [14]. Фукои-дан, выделенный из бурой водоросли L. cichorioides, представляет собой полностью сульфатированный и высокомолекулярный 1^3-а^-фукан (молекулярная масса 40—80 кДа).
Для получения предшественников дендритных клеток мышей выводили из опыта под эфирным наркозом. Костный мозг гомогенизировали в среде RPMI-1640 (Sigma, США), осаждали центрифугированием и переводили в обогащенную среду культивирования (RPMI-1640 с добавлением 0,1 мг/мл гентамицина сульфата и 10% термоактивированной эмбриональной телячьей сыворотки) в концентрации 106 кл./мл. Для развития незрелых дендритных клеток в 1-й и на 3-й день к суспензии костного мозга добавляли 80 нг/мл мышиного рекомбинантного гранулоцитарно-макрофагального колониестимулирующего фактора и 20 нг/мл интерлейкина-4, который при культивировании ингибирует развитие гра-нулоцитов и макрофагов.
На 6-е сутки инкубации среду меняли и для индукции созревания дендритных клеток вносили
фукоиданы (50 мкг/мл) из L. dchorioides и L. japonica. В качестве положительного контроля использовали классический индуктор созревания этих клеток — фактор некроза опухоли-a (Tumor Necrosis Factor-а — TNFa) — 20 нг/мл. На 9-е сутки клетки отмывали от среды культивирования и использовали в экспериментальных целях. Для определения поверхностных маркеров, связанных с созреванием, исследовали:
1) незрелые дендритные клетки (контроль),
2) дендритные клетки, созревшие под действием TNFa (положительный контроль),
3) дендритные клетки, созревшие под действием фу-коидана из L. achorioides,
4) дендритные клетки, созревшие под действием фу-коидана из L. japonica.
Определение экспрессии поверхностных маркеров проводили при помощи моноклональных антител (Caltag Laboratories, США) против соответствующих антигенов — кластеров дифференцировки (Claster of Differentiation - CD): CD34, CD38, CD40, CD11c, CD86, CD83. Кроме этого исследовали экспрессию молекул главного комплекса гистосовмети-мости (Major Histocompatibility Complex — MHC) I и II класса, F4/80, TLR-2, TLR-4 и TLR-9. Клетки отмывали 2 раза холодным фосфатно-солевым буфером с 1% эмбриональной телячьей сыворотккой, обрабатывали флуоресцинизотиоционат- и фикоэритрин-мечеными антителами и фиксировали в фосфатносолевом буфере, содержавшем 1% параформальдегида. Результаты учитывали на проточном цитометре FacsCalibur (Becton Dickinson, США). Данные анализировали после выделения логического гейта клеточной популяции в dot/plot распределении клеток по их линейному переднему и боковому светорассеянию. Анализировали минимум 10000 событий в гейте. Статистическую обработку проводили при помощи программного пакета WinMdi 2.8 и программы Primer of Biostatistics 4.03.
Результаты исследования. Изучение иммунофенотипа дендритных клеток, полученных из костного мозга мышей, проводили на разных стадиях созревания. Установлено, что добавление сульфатированных полисахаридов из морских бурых водорослей в среду культивирования индуцировало созревание клеток, о чем свидетельствовала экспрессия на их поверхности маркера терминальной дифференцировки CD83: под действием фукоиданов из L. achorioides — 10,27±0,63% и L. japonica — 16,13±1,45% при отрицательном контроле. Также отмечено выраженное снижение экспрессии маркера незрелых дендритных клеток (CD34) на их поверхности под действием фукоиданов из L. acho-rioides (0,66±0,33%) и L. japonica (0,24±0,14%), по отношению к контролю (23,2±0,82%, разница статистически значима).
Увеличение экспрессии активационного маркера CD38 под действием фукоиданов из L. achorioides (58±3,85%) и L. japonica (63,6±3,84%) по сравнению с контролем (5,43±0,14%) и молекулы адгезии CD11c
указывало на способность созревших дендритных клеток взаимодействовать с Т-лимфоцитами. При этом отмечено, что фукоидан из L. cichorioides, способствовал достоверно более выраженной экспрессии молекулы адгезии CD11c (73,63±2,23%) по сравнению с фукоиданом из L. japonica (48,76±7,35%) и контролем (43,13±0,55%).
Для эффективной активации Т-лимфоцит должен получить от антигенпрезентирующей клетки не только антигенспецифический, но и костимулиру-ющий сигнал. Результаты исследования экспрессии молекул МНС I и II классов показали, что фукоиданы из L. сichorioides и L. japonica вызывали значительное увеличение экспрессии молекулы МНС II класса (41,8±2,91% и 44,03±6,73%), по сравнению с показателями в контроле (19,07±0,63%). На поверхности дендритных клеток, созревших под действием фукоиданов из L. сichorioides и L. japonica, показано статистически недостоверное увеличение экспрессии CD40 и значительное увеличение экспрессии CD86 (16,2±1,55 и 16,17±1,93% соответственно, контроль — 4,0±0,11%). Это свидетельствовало о способности созревших дендритных клеток к активации наивных Т-клеток в эффекторные (рис. 1).
Известно, что TLR являются одними из паттерн-распознающих рецепторов дендритных клеток, ответственных за распознавание структур различных классов патогенов, что ведет к выработке и передаче сигналов для экспрессии разнообразных генов иммунного ответа [3, 5, 6, 9, 10]. Результаты исследования показали, что фукоиданы способствуют увеличению экспрессии TLR-2 и TLR-4, но не оказывают влияния на экспрессию TLR-9 на дендритных клетках. Установлено, что увеличение экспрессии TLR-2 под действием фукоиданов из L. сichorioides и L. japonica составило 26,5±1,04 и 25,8±3,78%, контроль — 14,8±0,3%, а увеличение экспрессии TLR-4 — 8,13±0,08 и 7,2±0,89%, контроль - 1,46±0,08% (рис. 2).
Обсуждение полученных данных. Результаты исследования указывают на то, что фукоиданы, выделенные из морских бурых водорослей, являются индукторами созревания дендритных клеток, о чем свидетельствуют экспрессия маркера терминальной дифференцировки (CD83), увеличение экспрессии поверхностных молекул антигенного представления (МНС II класса), костимулирующих молекул (CD40 и CD86), молекулы адгезии (CD11с) и активационного маркера (CD38), способствующих образованию иммунного синапса для обмена информации между антигенпрезентирующими клетками и Т-лимфоци-тами и дифференцировке активированных Т-клеток в эффекторные.
В процессе созревания дендритные клетки теряют способность захватывать антиген, но приобретают способность экспрессировать процессированный пептидный антиген в контексте собственных молекул МНС
I и II класса. Представление пептида в комплексе
80 -|
70 -
60 -
50 -
40 -
30 -
20 -
10 -
п
| Незрелые дендритные клетки | Дендритные клетки+ТОТа Дендритные клетки+/,. ]арошса
I I Дендритные клетки+Х. скИогюМев
П
п
______г* .
СОМ СБ83 И4/80 СБ38 СБПс С040 С086 МНС1
Рис. 1. Влияние фукоиданов на экспрессию поверхностных молекул дендритных клеток.
МНС II
с МНС I класса необходимо для активации Т-лимфо-циов СD8+, тогда как представление пептида в комплексе с МНС II класса необходимо для активации CD4+-лимфоцитов (Т-хелперы 1-го типа) [4]. Выраженное увеличение экспрессии молекулы МНС II класса на поверхности дендритных клеток, созревших под действием фукоиданов, является одним из важных показателей их способности осуществлять антигенное представление и позволяет предположить прямое представление этими клетками антигена в комплексе с МНС II класса CD4+-лимфоцитам. Увеличение же экспрессии костимулирующих молекул (CD40 и CD86) свидетельствует о том, что полученные дендритные клетки способны активировать наивные Т-лимфоциты.
Известно, что направление дифференцировки CD4+-лимфоцитов зависит не только от характера возбудителя или антигена, проникшего в организм, но и от типа паттерн-рецепторов, участвующих в распознавании патогенассоциированных молекулярных структур микроорганизмов [3, 6, 10]. Одними из рецепторов, ответственных за инициацию сигнала и формирование врожденного иммунитета, являются TLR, играющие главную роль в распознавании лигандов различных классов патогенов, а также ряда эндогенных продуктов, выработке и передаче сигналов для экспрессии разнообразных генов иммунного ответа (включая провоспалительные цитокины и ин-терферониндуцибельные гены). Кроме того, стимуляция TLR вызывает созревание дендритных клеток, что приводит к индукции антигенпредставляющих и костимулирующих молекул и способствует последу-
ющей индукции адаптивного иммунного ответа [3, 5, 6, 9, 10, 13].
Усиление экспрессии TLR-2 и TLR-4 на дендритных клетках под действием фукоиданов из морских бурых водорослей свидетельствует, что созревшие дендритные клетки способны оказывать влияние на стимуляцию различных защитных эффекторных механизмов врожденного иммунитета и индуцировать развитие адаптивного иммунного ответа.
Результаты исследования подтверждают, что сульфатированные полисахариды из L. сichorioides и L. japonica являются индукторами созревания дендритных клеток. Следует отметить, что действие фу-коиданов на их созревание у мышей было сопоставимо с действием классического индуктора созревания дендритных клеток — TNFa. В исследованиях Т.С. Запорожец [2] показано, что сульфатированные полисахариды индуцируют синтез и секрецию провоспа-лительных цитокинов (TNFa, интерлейкинов 1а и 8) клетками моноцитарно/макрофагального ряда, что способствует экспрессии молекул адгезии, активации нейтрофилов, макрофагов и NK-клеток, усилению фагоцитоза и пролиферации лимфоцитов, а также увеличению синтеза 7-интерферона NK-клетками. Известно, что созревание дендритных клеток инициируется различными факторами, к которым относятся TNF-подобные сигналы и провоспалительные цитокины [4, 5, 6, 9, 10]. Поэтому способность фуко-иданов индуцировать синтез последних, в частности TNFa, может являться механизмом, который обеспечивает действие фукоиданов из L. сichorioides и L. japo-п^ на созревание дендритных клеток.
II
II
Незрелые
дендритные клетки
Дендритные
клетки+TNFa
Дендритные клетки+L. japonica
Дендритные клетки+Z,. cichorioides
II
35
30 -
25 -
20 -
15 -
10 -
5 -
TLR-2 TLR-4 TLR-9
Рис. 2. Влияние фукоиданов на экспрессию TLR.
Полученные результаты согласуются с данными Mi-Hyoung Kim и Hong-Gu Joo [12]. Было показано, что фукоидан из морской бурой водоросли Fucus vesiculosus увеличивает экспрессию молекулы MHC
II класса, молекул адгезии (CD54) и костимуляции (CD86). Это, по мнению авторов, свидетельствует о способности фукоидана стимулировать экспрессию определенных маркерных генов, связанных с созреванием дендритных клеток.
В работе M. Yang et al. также показано, что фуко-идан из F. vesiculosus стимулирует созревание моно-цитпроизводных дендритных клеток человека, повышает экспрессию костимулирующих и антиген-представляющих молекул, способствует снижению эндоцитоза, а также усиливает продукцию этими клетками фактора некроза опухоли-а и интерлейкина-12. Полученные авторами результаты показывают, что фукоидан способствует созреванию дендритных клеток и поляризации клеточного Т-хелперного 1-го типа ответа [15].
Таким образом, результаты проведенного эксперимента и данные литературы позволяют считать, что сульфатированные полисахариды из морских бурых водорослей, обладающие широким спектром биологической активности, являются активаторами системы врожденного иммунитета.
Литература
1. Ахматова Н.К. Молекулярные и клеточные механизмы действия иммуномодуляторов микробного происхождения на функциональную активность эффекторов врожденного иммунитета: автореф. дис. ... д-ра мед. наук. М., 2006. 48 с.
2. Запорожец Т.С. Клеточные и молекулярные механизмы иммуномодулирующего действия биополимеров морс-
ких гидробионтов: дис. ... д-ра мед. наук. Владивосток, 2006. 352 с.
3. Ковальчук Л.В., Хорева М.В., Варивода А.С. Врожденные компоненты иммунитета: Toll-подобные рецепторы в норме и при иммунопатологии // Журн. микробиол. эпиде-миол. и иммунобиол. 2005. № 4. С. 96—104.
4. Пащенков М.В., Пинегин Б.В. Основные свойства дендритных клеток // Иммунология. 2001. № 4. С. 7—16.
5. Пащенков М.В. Пинегин Б.В. Физиология клеток врожденной иммунной системы: дендритные клетки // Иммунология. 2006. № 6. С. 368—378.
6. Семенов Б.Ф. Зверев В.В. Концепция создания быстрой иммунологической защиты от патогенов//Журн. микробиол. эпидемиол. и иммунобиол., 2007. № 4. С. 93—100.
7. Cumashi A., Ushakova N.A., Preobrazhenskaya M.E. et al. A comparative study of the anti-inflammatory, anticoagulant, an-tiangiogenic, and antiadhesive activities of nine different fucoi-dans from brown seaweeds // Glycobiology. 2007. Vol. 17, No. 5. P. 541-552.
8. Frantz S., Vincent K.A., Feron O., Kelly R.A. Innate immunity and angiogenesis // Circ. Res. 2005. Vol. 96, No. 1. P. 15-26.
9. Hochrein H.O., Keeffe M. Dendritic cell subsets and toll-like receptors // Handb. Exp. Pharmacol. 2008. Vol. 183. P. 153-179.
10. Janeway C., Medzhitov R. Innate immune recognition //Annu. Rev. Immunol. 2002. Vol. 20. P. 197-216.
11. MandalP., Mateu C.G., Chattopadhyay K. et al. Structural features and antiviral activity of sulphated fucans from the brown seaweed Cystoseira indica //Antivir. Chem. Chemother. 2007. Vol. 18, No. 3. Р. 153-162.
12. Mi-Hyoung Kim, Hong-Gu Joo. Immunostimulatory effects of fucoidan on bone marrow-derived dendritic cells // Immunology Letters. 2008. Vol. 115. P. 138-143.
13. Takeda K., Akira S. Toll-like receptors in innate immunity // Int. Immunol. 2005. Vol. 17, No. 1. P. 1-14.
14. Zvyagintseva T.N., Shevchenko N.M., Chizhov A.O. et al. Water-soluble polysaccharides of some far-eastern brown seaweeds. Distribution, structure, and their dependence on the developmental conditions // J. Exp. marine Biol. Ecol. 2003. Vol. 294, No. 1. P. 1-13.
15 Yang M., Ma C., Sun J. et al. Fucoidan stimulation induces a functional maturation of human monocyte-derived dendritic cells // Int. Immunopharmacol. 2008. Vol. 8, No. 13-14. P. 1754-1760.
Поступила в редакцию 07.04.2009.
SULPHATED POLYSACCHARIDES DERIVED FROM SEA BROWN ALGAE AS INDUCING SUBSTANCES FOR DENDRITIC CELL MATURATION I.D. Makarenkova1, N.K. Akhmatova2, I.B. Semenova2,
N.N. Besednova1, T.N. Zvyagintseva1
1 Research Centre of Epidemiology and Microbiology of the RAMS, Siberian Branch (1 Selskaya St. Vladivostok 690087Russia),
2 I.I. Mechnikov Research Institute of Vaccines and Serums,
RAMS (5a M. Kazenniy Lane Moscow 105064 Russia), 3 Pacific Institute of Bioorganic Chemistry, FEB RAS (159 100-Anniversary Av. Vladivostok 690022 Russia)
Summary — The paper presents experimental study into the effects of sulphated polysaccharides — fucoidans derived from the sea brown algae Laminaria cichorioides and Laminaria japonica on maturation of dendritic cells extracted from the mice bone marrow. As reported, the fucoidans tend to induce expression of terminal differentiation markers, intensify activation marker, adhesion molecules, surface antigen-presenting and bone marrow inducing molecules, as well as Toll-like receptors on the dendritic cell membranes that appears to be indicative of their maturation.
Key words: dendritic cells, Toll-like receptors, fucoidans.
Pacific Medical Journal, 2009, No. 3, p. 36—39.
