CC BY
22
© Коллектив авторов, 2016 г. УДК [611.013.395:616-018.2]-092.19
Л. А. Александрова, Н. А. Филиппова, Т. Ф. Субботина, Е. С. Алексеевская, А. А. Жлоба, В. И. Трофимов
ОЦЕНКА ПРОЯВЛЕНИЙ ОКИ-СЛИТЕЛЬНО-НИТРОЗИЛЬНОГО СТРЕССА ПРИ СИСТЕМНЫХ ЗАБОЛЕВАНИЯХ СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ
Первый Санкт-Петербургский государственный медицинский университет имени академика И. П. Павлова
Концепция патогенеза системных заболеваний соединительной ткани с поражением суставов (СЗСТПС) включает участие окислительного стресса (ОС) в повреждении клеток, обусловленном иммунным нарушением и воспалением. Особое внимание уделяется вопросам патогенетической роли активных форм кислорода (АФК) в развитии воспалительно-деструктивных процессов у больных ревматоидным артритом (РА) [9] и анкилозирую-щим спондилитом АС [11]. АФК, генерируемые моноцитами, полиморфноядерными нейтрофила-ми, синовиальными макрофагами, в биологических средах организма в условиях недостаточности эндогенной антиоксидантной системы (АОС) вызывают нарушения в соединительной ткани [8, 12]. Адгезия активированных нейтрофилов на поверхности эндотелиальных клеток, где происходит де-грануляция, может запускать процесс эндотелиаль-ной дисфункции [8].
Важнейшим внутриклеточным регуляторным пептидом является восстановленный глутатион (СБИ). Он входит в систему антиоксидантной защиты, предупреждения и ограничения ОС, а также играет ключевую роль в аутоиммунных процессах [1, 16]. Гомеостаз СБИ в клетке поддерживается
Циническая характеристика обследованных лиц
согласованным действием глутатионпероксидазы (ГПО) и глутатионредуктазы (ГР). ГПО использует GSH в качестве косубстрата для восстановления гидроперекиси и липопероксидов. Основная функция ГР состоит в восстановлении окисленного глу-татиона до сульфгидрильной формы GSH. Наряду с супероксиддисмутазой (СОД), инактивирующей избыточные супероксидные радикалы, ГПО и ГР входят в систему ферментативной АОС.
Внутриклеточный GSH является основным акцептором молекул оксида азота (NO) и, депонируя их в клетке в виде S-нитрозоглутатиона [3], поддерживает его внутриклеточный пул. В качестве межклеточного и внутриклеточного мессенджера NO вовлечен в регуляцию метаболических реакций, обеспечивающих жизнеспособность и функциональную активность клеток и всего организма в целом, но при определенных условиях участвует в протекании патологических процессов [3, 12]. Отмечено его влияние на развитие иммунного воспаления при РА путем селективной стимуляции пролиферации Thl-клеток и индукцию костной резорбции [14].
Некоторые полиморфные варианты (4a/4b) гена эндотелиальной NOS рассматривают как факторы риска иммунологических сдвигов при РА [4]. Про-грессирование воспалительного процесса в ответ на гипоксию в синовиальных клетках связывают с индукцией NOS НАДФН-оксидазой [6].
В литературе роль показателей ОС в качестве маркеров развития СЗСТПС оценена неоднозначно [17, 18], а взаимосвязь ОС с нитрозильным стрессом (НС) мало изучена. Вовлечение АФК в патогенез РА и АС делает важным поиск маркеров свободно-радикального окисления и особенно состояния АОС при этих заболеваниях. Целью исследования являлось изучение взаимосвязи метаболизма глутатиона эритроцитов с метаболизмом NO в плазме крови при СЗСТПС.
Таблица 1
Показатель Ревматоидный артрит Анкилозирующий спондилит Доноры
N 48 10 45
Возраст, лет 56,0 (47,2-68) 39,8 (31-43,5) 48
Мужчин/женщин 13/35 8/2 14/31
Длительность заболевания, лет 8,5 (3,7-24) 13,9 (5,0-23,0)
СРБ, мг/л 16,9 (3,4-24,3) 29,7 (11,8-69,5) <2,6
СОЭ, мм/ч 26,0 (15,5-37,0) 40,1 (28,2-60,0) <10
Низкая активность РА ОЛБ28 (2,6-3,2) 2,75 (2,55-2,9) <2,6
Средняя активность РА ОЛБ28 (3,2-5,1) 4,04 (3,79-4,45)
Высокая активность РА ОЛБ28 (>5,1) 6,25 (5,6-6,9)
БЛББЛ! 47,3 (34,1-59,5) <40
МАТЕРИАЛ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Были обследованы 64 пациента с СЗСТПС (табл. 1), получавших стационарное лечение в клинике госпитальной терапии ПСПбГМУ им. акад. И. П. Павлова с сентября 2013 по май 2015 г. Группу сравнения составили 45 здоровых лиц. Для определения активности процесса рассчитывали индексы ОЛБ28 для больных РА и БЛБОЛ1 для больных АС. Ревматоидный фактор, определяемый нефелометрическим методом на приборе 1шшаде, выявлен у 63 % больных РА. Определение СОЭ проводили методом Панчен-кова. Концентрацию С-реактивно-го белка определяли высокочув-
ОРИГИНАЛЬНЫЕ РАБОТЫ
ствительным иммунотурбидимет-рическим методом.
Во всех случаях имелось информированное согласие обследуемых на анонимное использование полученных данных, а протокол исследования был одобрен Этическим комитетом.
Эритроциты образцов крови, стабилизированной цитратом натрия, отмывали дважды холодным физиологическим раствором, замораживали и хранили в морозильной камере при — 82 оС до проведения анализа. В 10 % гемолизатах проводили [2] определение активности ферментов ГПО, ГР, СОД и содержание GSH. Концентрацию гемоглобина измеряли гемоглобинцианид-ным методом, используя наборы реагентов фирмы «Синтакон» (Россия). Концентрацию высших окислов азота (NOx) в плазме крови измеряли спектрофотометрическим методом, основанным на реакции Грисса, с использованием рекомбинант-ной нитратредуктазы в качестве восстановителя нитратов [21].
Статистический анализ полученных данных проводили с помощью программы «SPSS 15.0 for Windows». Результаты представляли в виде медианы и межквартильного размаха M (Q1-Q3). Непараметрический критерий Манна —Уитни для независимых выборок использовали для проверки гипотезы о различии выборок. При p<0,05 различия между выборками считались достоверными. Для оценки корреляционных связей использовали ранговый коэффициент корреляции Спирмена.
РЕЗУЛЬТАТЫ ИССЛЕДОВАНИЯ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ
Как видно из данных табл. 2, у всех больных с СЗСТПС наблюдались признаки окислительного и нитрозильного стресса, выражавшиеся в угнетении метаболизма глутатиона при значительном снижении уровня основного клеточного антиокси-данта GSH и активности антиоксидантных ферментов ГПО, ГР и СОД в эритроцитах на фоне увеличенной концентрации NOx в плазме крови.
Выявленные отрицательные корреляции между NOx в плазме крови и уровнем GSH в эритроцитах при РА (R=—0,450; р = 0,036); между активностью ГПО и уровнем NOx (R=-0,900; р = 0,037) при АС, а также между GSH и NOx (R=-0,524; р = 0,002) в общей группе больных СЗСТ подтверждают данные о взаимосвязи между ОС и НС у больных СЗСТ [15] и суждение о возможной патогенетической роли недостаточности AOC [13]. Оксид азота включен в механизмы неспецифического иммунитета и в комплексный механизм тканевого повреждения
Та блица 2
Содержание GSH, активность ГПО, ГР и СОД в эритроцитах и концентрация NOx в плазме крови у больных с сЗСтпС и здоровых людей
Диагноз GSH, мкмоль/г Hb ГПО, ед/г Hb ГР, ед/г Hb СОД, ед/г Hb Nox, мкмоль/л
Ревматоидный 1,98* 7,7* 0,9* 11,9* 10,8*
артрит (N = 48) (1,60-2,47) (5,7-10,9) (0,6-1,2) (6,8-16,7) (6,1-17,9)
1,59* 10,8* 0,61* 12,72* 14,1*
Анкилозирующий (1,38-1,66) (6,9-14,8) (0,55-1,19) (5,5-14,5) (5,3-28,0)
спондилит (N = 10)
Доноры (N = 45) 2,80 13,6 1,38 23,50 8,9
(2,30-3,30) (10,6-16,9) (1,18-1,93) (19,2-31,0) (6,3-11,6)
* - р<0,05 статистическая значимость различий между показателями группы больных с группой доноров.
через модуляцию воспалительного процесса и апоптоза [4, 7, 12]. На ранней фазе воспалительной реакции, при усилении генерации гистамина, брадикинина, простагландинов и лейкотриенов, активируется эндотелиальная NOS, а на поздней фазе воспаления происходит усиление генерации NO, в основном макрофагальной индуцибельной NOS [10]. Нарушение функции эндотелия приводит к недостаточному образованию оксида азота или к его инактивации, в особенности супероксидными радикалами, с образованием токсичного перокси-нитрита [13].
Менее отчетливой оказалась связь с выраженностью воспалительного процесса, что соответствует неоднозначным данным, полученным другими исследователями [7, 19, 20]. Так, в исследованиях [7, 20] не выявлены корреляции между уровнем NOx в сыворотке крови и клинико-лабораторными параметрами активности РА. По данным [10], NOx плазмы крови является одним из маркеров эффективности лечения препаратом инфликсимаб, что предполагает участие NO в генезе воспалительного процесса у больных РА.
В нашем исследовании корреляции уровня NOx с активностью процесса по шкале DAS28 и BASDAI не обнаружены, что согласуется с результатами исследования J. W. Choi [7]. Однако уровень NOx в плазме в общей группе больных СЗСТПС коррелировал с показателем СОЭ (R = 0,373; p = 0,025).
ВЫВОДЫ
1. При СЗСТПС, у больных как с РА, так и АС, выявлен нитрозильный стресс с повышенным уровнем NOx в плазме крови.
2. В организме больных СЗСТПС установлен низкий антиоксидантный статус организма, который является возможным фактором риска развития СЗСТПС.
3. Обнаружена взаимосвязь уровня NOx в плазме крови с метаболизмом глутатиона в эритроцитах, наиболее выраженная у больных АС.
4. Выявленные нарушения метаболизма глута-тиона и оксида азота при СЗСТПС, по-видимому, напрямую не связаны со степенью активности процесса и серопозитивностью.
ЛИТЕРАТУРА
1. Александрова Л. А., Жлоба А. А., Алексеевская Е. С. Окислительный стресс при активации внутрисосудистого свертывания и фибринолиза // Регионарное кровообращение и микроциркуляция. — 2014. — Т. 13. — № 1.-С. 79-82.
2. Александрова Л. А., Миронова Ж. А., Агафонова Ю. И. и др. Состояние системы глутатиона в эритроцитах у пациентов с пароксизмальной ночной гемоглобинурией // Региональное кровообращение и микроциркуляция. -2015. - № 4 (56). - С. 60-65.
3. Каминская Л. Ю., Жлоба А. А., Александрова Л. А. и др. Влияние донатора NO нитрозотиола глутатиона на уровень окислов азота и малонового диальдегида в крови крыс // Артериальная гипертензия. - 2005. - Т. 11. - №1. -С. 5-9.
4. AlFadhli S. Influence of endothelial nitric oxide synthase gene intron-4 27bp repeat polymorphism on its expression in autoimmune diseases // Dis Markers. - 2013. - Vol. 34. -№5. - P. 349-356.
5. Ben MansourR., Lassoued S., Gargouri B. et al. Increased levels of autoantibodies against catalase and superoxide dis-mutase associated withoxidative stress in patients with rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus// Scandinavian Journal of Rheumatology. - 2008. - Vol. 37. -№ 2. -Р. 103-108.
6. Chenevier-Gobeaux C., Simonneau C., Therond P. et al. Implication of cytosolic phospholipase A2 (cPLA2) in the regulation of human synoviocyte NADPH oxidase (Nox2) activity// Life Sci.- 2007. -Vol. 81. - № 13. - P. 1050-1058.
7. Choi J. W. Nitric oxide production is increased in patients with rheumatoid arthritis but does not correlate with laboratory parameters of disease activity // Clin Chim. Acta. - 2003. -Vol. 336. - P. 83-87.
8. Falk R. J., Terrell R. S., Charles L. A., Jennette J. C. Anti-neutrophil cytoplasmic autoantibodies induce neutrophils to degranulate and produce oxygen radicals in vitro // Proc. Natl. Acad. Sci USA. - 1990. - Vol. 87. - P. 4115-4119.
9. Garacia-GonzalezA., Gaxiola-Robles R., Zenteno-Savin T. Oxidative stress in patients with rheumatoid arthritis // Rev. Invest. Clin. - 2015. - Vol. 67. - P. 46-53.
10. Gonzalez-Gay M. A., Garcia-Unzueta M. T., Berja A. et al. Short-term effect of anti-TNF-alpha therapy on nitric oxide production in patients with severe rheumatoid arthritis // Clin. Exp. Rheumatol. - 2009. - Vol. 27. - № 3. - P. 452-458.
11. Karakoc M., Altindag O., Keles H. et al. Serum oxidative-antioxidative status in patients with ankylosing spondylitis// Rheumatol. Int. - 2007. - Vol. 27. - P. 1131-1134.
12. Martinon F. Signaling by ROS drives inflammasome activation // Eur. J. Immunol. - 2010. - Vol. 40. - P. 616-619.
13. McInnes I. B., Schett G. The pathogenesis of rheumatoid arthritis // N. Engl. J. Med. - 2011. - Vol. 365. - P. 22052219.
14. Nagy G., Koncz A., Telarico T. et al. Central role of nitric oxide in the pathogenesis of rheumatoid arthritis and systemic lupus erythematosus // Arthritis. Res. Ther. - 2010. - Vol. 12. -№3. - P. 210-216.
15. Ozgocmen S., Sogut S., Ardicoglu O. Serum nitric oxide, catalase, superoxide dismutase, and malondialdehyde status in patients with ankylosing spondylitis // Rheumatol. Int. -2004. - Vol. 24. - P. 80-83. Doi 10.1007/s00296-003-0335-y.
16. Perricone C., Carolis C. D., Perricone R. Glutathione: A key player in autoimmunity // Autoimmunity Reviews. -2009. - Vol.8. - P. 697-701.
17. Stanek A., Cholewka A., Wielkoszynski T. et al. Increase in oxidative stress in patients with ankylosing spondylitis // Eur. J. Clin. Invest. - 2013. - Vol. 43 (SI). - P. 87.
18. Taysi S., Polat F., Gul M. et al. Lipid peroxidation, some extracellular antioxidants, and antioxidant enzymes in serum of patients with rheumatoid arthritis // Rheumatol. Int. - 2002. -№ 21. - Р. 200-204.
19. Veselinovic M., Barudzic N., Vuletic M. et al. Oxidative stress in rheumatoid arthritis patients: relationship to diseases activity // Mol. Cell. Biochem. - 2014. - Vol. 391. - № 1.2. - P. 225-232.
20. Weinberg J. B., Lang T., Wilkinson W. E. et al. Serum, urinary, and salivary nitric oxide in rheumatoid arthritis: complexities of interpreting nitric oxide measures // Arthritis. Res. Ther. - 2006. - Vol.8. - №5. - P. 140-145.
21. Zhloba A. A., Subbotina T. F., Alekseevskaya E. S. et al. The level of circulating PGC16 in cardiovascular diseases // Biochemistry (Moscow) Supplement Series B: Biomedical Chemistry. - 2015. - Vol. 9. - № 2. - Р. 143-150.
РЕЗЮМЕ
Л. А. Александрова, Н. А. Филиппова, Т. Ф. Субботина, Е. С. Алексеевская, А. А. Жлоба, В. И. Трофимов
Оценка проявлений окислительно-нитрозильного стресса при системных заболеваниях соединительной ткани
У больных системными заболеваниями соединительной ткани c поражением суставов (ревматическим артритом и анкилозирующим спондилитом) выявлен сниженный анти-оксидантный статус с низкой активностью супероксиддис-мутазы, глутатионпероксидазы и глутатионредуктазы эритроцитов при низком уровне восстановленной формы глу-татиона на фоне повышенного уровня NOx в плазме крови. Выявленные нарушения не коррелировали с активностью процесса и серопозитивностью.
Ключевые слова: ревматоидный артрит, анкилозирую-щий спондилит, глутатион, оксид азота, антиоксидантный статус.
SUMMARY
L. A. Alexandrova, N. A. Filippooa, T. F. Sub-botina, E. S. Alekseevskaya, A. A. Zhloba, V. I. Trofimov
Evaluation of the oxidation-nitrosyl stress manifestations at systematic connective tissue diseases
Reduction in antioxidant status with low activity of superoxide dismutase, glutathione peroxidase and glutathione reductase red blood cells at a low level of reduced glutathione in the background and increased NOx levels in blood plasma was detected in patients with systematic connective tissue and joint diseases: rheumatoid arthritis and ankylosing spondylitis. Detected violations are not correlated with the activity of the process, and seropositivity.
Keywords: rheumatoid arthritis, ankylosing spondylitis, glutathione, nitric oxide, antioxidant status.
