CC BY
51
I
Лкарю, що практикуе
To General Practitioner
Травма
УДК 616-001.17.1-008.61
ФЕДОРОВА А.А., БОРЗЕНКО Б.Г., ГНИЛОРЫБОВ А.М.
Институт неотложной и восстановительной хирургии им. В.К. Гусака НАМН Украины Донецкий национальный медицинский университет им. М. Горького
ОСОБЕННОСТИ АНТИОКСИДАНТНОЙ ЗАЩИТЫ ПРИ ТЕРМИЧЕСКОЙ ТРАВМЕ
Резюме. ЫО-доноры успешно применяются при лечении разной патологии для расширения сосудов и кардио-протекции. Но инфузии раствора 1-аргинина в больших объемах могут стимулировать окислительный стресс. Мы исследовали суммарную концентрацию нитратов/нитритов в крови, содержание медь-зависимых анти-оксидантов и субстрата для связывания N0 — восстановленного глутатиона у тяжелообожженных, которые при лечении ожоговго шока получали 1-аргинин. Нами было выявлено, что на 3-и сутки лечения по окончании ожоговго шока у 15 % пострадавших наблюдалось более значительное, чем у остальных, увеличение концентрации ЫОх (в 1,5 раза), отсутствие возрастания активности супероксиддисмутазы, низкий уровень восстановленного глутатиона (в 2 раза ниже контрольного) и достоверное снижение в 1,6 раза по сравнению с другими и в 2,5 раза по сравнению с контролем содержания церулоплазмина. Значит, можно говорить о значительном угнетении антиоксидантной защиты клеток при одновременном увеличении продукции оксида азота после инфузии 1-аргинина у этих пациентов. Летальность в этой группе составила 100 %. Таким образом, наши данные свидетельствуют о необходимости исследования вышеперечисленных показателей при индивидуальной оценке эффективности использования ЫО-доноров для лечения тяжелообожженных. Ключевые слова: антиоксиданты, ожоги, ЫО-доноры.
Введение
В течение нескольких часов после получения термической травмы в организме пострадавшего развивается 1-я стадия ожоговой болезни (ОБ) — ожоговый шок (ОШ). Тяжелая гиповолемия, централизация кровообращения и микроциркуляторные расстройства приводят к выраженным гипоксическим изменениям в тканях [1]. В ответ на гипоксию должно происходить адаптационное усиление продукции оксида азота (N0) уже в 1-е сутки ОШ, поскольку N0 обладает антитромбогенным и сосудорасширяющим действием [2]. Поэтому для стимуляции N0-синтаз обожженным назначаются инфузии раствора Ь-аргинина (тивортин), который является субстратом для N0-синтаз и донором N0 [3].
На 3-и сутки периферическое кровообращение восстанавливается и ожоговый шок переходит в стадию острой ожоговой токсемии (ООТ) [4], при которой кислородное снабжение тканей лишь частично нормализуется.
Вследствие гипоксии при ОШ происходит избыточная генерация активных форм кислорода (АФК), в частности супероксидного анион-радикала [4]. О2- взаимодействует с оксидом азота с большой скоростью, в результате образуется пероксинитрит (ПН). При этом N0 утрачивает свою физиологическую активность, тогда как ПН обладает радикальными свойствами и инициирует развитие ни-трозативного стресса [5]. В норме большая часть супероксидного анион-радикала инактивируется медь-зависимой супероксиддисмутазой (СОД). При неадекватном функ-
ционировании антиоксидантной (АО) системы избыток АФК и ПН приводит к развитию окислительного и нитро-зативного стрессов [5]. Известно, что значительные объемы инфузии L-аргинина могут углублять окислительный стресс [6].
SH-группы восстановленного глутатиона (GSH) связывают как оксид азота, так и ПН, в результате чего образуются S-нитрозоглутатионы, которые рассматриваются современными исследователями как легкодоступные депо NO [5, 7]. Кроме того, S-нитрозоглутатионы являются посредниками в реакциях транснитрозилирования белков и ферментов и таким образом регулируют в норме их активность [5, 7].
Регенерация оксида азота из S-нитрозотиолов происходит при участии ионов меди [7]. Ионы меди присутствуют во внутренних средах организма только в связанном виде, в первую очередь в составе антиоксидантного фермента церулоплазмина (ЦП). Ранее было обнаружено, что снижение или возрастание концентрации ЦП в плазме крови оказывает прямо пропорциональное действие на уровень нитритов в крови в норме [8]. Также он осуществляет доставку ионов меди к медь-зависимым ферментам.
Целью нашей работы было оценить активность антиоксидантной защиты у пострадавших с
© Федорова А.А., Борзенко Б.Г., Гнилорыбов А.М., 2014 © «Травма», 2014 © Заславский А.Ю., 2014
Том 15, №4 • 2014
www.mif-ua.com
129
ожогами, которые получали NO-донор — раствор Ь-аргинина.
Материалы и методы
Было обследовано 60 обожженных в возрасте от 18 до 56 лет в 1-е сутки после травмы до начала лечения и на 3-и сутки лечения при выходе из шока на стадии острой ожоговой токсемии. Все они поступили в Донецкий ожоговый центр в 2008—2012 гг. в результате шахтных травм при взрыве метано-угольной смеси. Пострадавшие с комбинированными травмами в данное исследование не вошли.
Модифицированный индекс тяжести поражения [4] у всех больных превышал 90 ед., то есть это были пациенты с крайне тяжелыми ожогами. Все обожженные получали инфузионную противошоковую терапию, в том числе и раствор Ь-аргинина (тивортин) в объеме, соответствующем степени тяжести ОШ. При анализе результатов биохимического обследования пострадавших была выявлена группа больных с наиболее выраженными метаболическими нарушениями. На основании этих данных обследованные были разделены на две группы: 1-я — 51 пациент, 2-я — 9 пациентов с крайне выраженными дисметаболи-ческими изменениями. Также было обследовано 17 условно здоровых доноров (группа контроля).
Для получения гемолизата эритроцитов набирали 4 мл крови из вены с добавлением 60 мкл 7,5% ЭДТА, после чего центрифугировали ее 10 минут при 3000 об/мин. Плазму отбирали для определения в ней церулоплазмина, из оставшейся клеточной суспензии отбирали 0,4 мл для последующей 3-кратной отмывки физраствором, после чего разводили отмытые эритроциты в 4 раза дистиллированной водой и замораживали.
Для определения концентрации GSH в эритроцитах к 0,6 мл разведенного в 4 раза дистиллированной водой гемолизата добавляли 0,2 мл 20% сульфосалициловой кислоты, центрифугировали 10 минут при 3000 об/мин. Смешивали 0,2 мл супернатанта с 2,55 мл 0,1-М трис«НС1 буфера рН 8,5, содержащего 0,01% ЭДТА, и 0,025 мл 4% раствора 5,5 '-дитиобис-2-нитробензойной кислоты в метаноле, измеряли поглощение при X = 412 нм на КФК-3-01 (Россия), затем рассчитывали концентрацию GSH по калибровочному графику [9].
Для определения активности СОД в стеклянной пробирке 0,1 мл отмытых эритроцитов растворяли в 0,9 мл 5-мМ трис«НС1 рН 7,4 для получения гемолизата, добавляли 0,25 мл этанола и 0,15 мл хлороформа, затем замораживали. После размораживания центрифугат разводили в 2,5 раза 5-мМ К-фосфатным буфером с 0,0001-М ЭДТА рН 7,8.
Через 30 с после добавления 0,2 мл 2,25*10_3 М раствора адреналина в инкубационную смесь (0,25 мл К-фосфатного буфера + 0,25 мл разведенного центрифу-гата + 0,35 мл 0,15-М ^-карбонатного буфера рН 10,2 с ЭДТА 3*10-4 М) в кювете 1 см на спектрофотометре измеряли кинетику окисления адреналина при X = 480 нм через каждые 30 с в течение 2,5 минуты против холостой пробы (в инкубационной смеси вместо центрифугата и раствора адреналина — дистиллированная вода), после чего рассчитывается ДЕ за минуту.
С учетом разведения активность СОД А = 13«Т, где Т — торможение, Т = ДЕ/ДЕа; ДЕ = ДЕа — ДЕо, где ДЕа — изменение экстинкции автоокисления адреналина (в инкубационной смеси вместо центрифугата — дистиллированная вода) за 1 мин [10].
Суммарную концентрацию нитратов/нитритов (N0^ определяли спектрофотометрически по реакции с реактивом Грисса. 0,25 мл сыворотки крови разводили дистиллированной водой в 6 раз, добавляли 0,5 мл 15% уксусной кислоты, после чего встряхивали пробу в течение 1 мин с 30 мг смеси порошка металлического цинка с М^04 в соотношении 1 : 100 для восстановления нитратов в нитриты, потом добавляли 0,25 мл реактива Грисса и измеряли поглощение при X = 538 нм на спектрофотометре Genesys 10Ц^ Расчет производился по калибровочному графику, построенному на основании раствора 10-мкМ [11].
В основе метода определения содержания ЦП лежит инкубация в течение 1 часа при 37 °С 0,05 мл плазмы крови с 4 мл 0,4-М ацетатного буфера рН 5,5 и 0,5 мл 1% водного раствора п-фенилендиамина. Под действием церулоплаз-мина в пробе образуются окрашенные продукты. Реакцию останавливали добавлением 1 мл 1% после чего охлаждали в холодильнике 30 минут. Измеряли поглощение при X = 540 нм на КФК-3-01 против холостой пробы, которая содержала 0,05 мл дистиллированной воды вместо плазмы, и 1% туда добавлялся перед началом инкубации. Для расчета содержания ЦП значение экстинкции умножали на фактор 875 [12].
Для статистической обработки результатов использовали программу Stаtisticа. Результаты выражали в виде: среднее ± стандартная ошибка среднего. Достоверность отличий между группами оценивали по ^критерию Стью-дента, достоверными считались отличия при условии р < 0,05.
Результаты и обсуждение
В 1-е сутки после получения травмы уровень N0х достоверно возрастал почти в два раза по сравнению с контролем только во 2-й группе (табл. 1). Следовательно, наши данные свидетельствовали о недостаточной активации NО-синтаз у больных 1-й группы сразу после получения ожога. Это подтверждает данные литературы [2, 13] о противоположном действии гипоксии на экспрессию гена эндотелиальной N0-синтазы в зависимости от продолжительности кислородной недостаточности и типа эндоте-лиоцитов. В случае с пострадавшими от ожогов уместнее говорить о зависимости повышения уровня N0х от тяжести и глубины травмы. При глубоких ожогах происходит поражение не только клеток кожи, но и клеток сосудов, в том числе и легочных. Таким образом, наши результаты подтверждают целесообразность назначения инфузий Ь-аргинина пациентам 1-й группы. Во 2-й группе необходимость использования доноров N0 при исходно повышенной концентрации нитратов/нитритов не кажется такой очевидной.
Важную диагностическую информацию можно получить при исследовании показателей АО-системы, которые тесно взаимосвязаны с метаболизмом оксида азота.
Лкарю, що практикуе / То Оепега! РгаеШопег |
Так, в норме СОД является основным фактором, предупреждающим образование цитотоксического ПН. Необходимо отметить, что в 1-е сутки после травмы достоверное возрастание активности СОД наблюдалось только в 1-й группе. Во 2-й группе важный фермент зашиты против АФК проявлял активность на уровне контрольной группы.
Церулоплазмин транспортирует медь ко всем ферментам, содержащим этот металл в активном центре, в том числе и к СОД. Однако у обследованных нами пострадавших содержание ЦП было снижено в 2 раза в 1-й группе и в 2,5 раза — во 2-й. Такое резкое снижение уровня основного переносчика меди может отрицательно сказываться на функционировании СОД как медь-зависимого энзима. Соответственно, в данных условиях вероятность образования ПН при взаимодействии О2- и N0 увеличивается.
В клетках присутствует природная ловушка для ПН — восстановленный глутатион. Изменение концентрации восстановленного глутатиона в эритроцитах также достоверно различалось. У пациентов 1-й группы наблюдалось снижение его содержания только в 1,6 раза, тогда как во 2-й группе уровень GSH снижался в 2 раза. То есть у обожженных этой группы уже в 1-е сутки после травмы регистрировалось истощение субстратов для связывания NО и пероксинитрита на фоне значительно возросшей концентрации NОх.
Итак, уже на стадии ОШ у больных с крайне тяжелыми ожогами прослеживалось две тенденции. У большей части пострадавших (1-я группа) не происходило достоверное возрастание NОх, зато увеличивалась активность СОД, при этом содержание GSH умеренно снижалось и резко снижался уровень церулоплазмина в плазме. То есть АО-система эффективно функционировала уже на 1-й линии защиты против свободных радикалов. У 15 % обожженных (2-я группа) была совсем иная картина: суммарная кон-
центрация NОх резко возрастала на фоне явного истощения АО-ресурсов клеток.
На 3-и сутки лечения NО-донорами по окончании шока на стадии ООТ различия в активности АО-системы у пострадавших сохранялись (табл. 2).
Об активации NО-синтаз после инфузионной терапии с использованием Ь-аргинина свидетельствовала достоверно возросшая концентрация NОх у всех обожженных. Однако пул GSH достоверно (р < 0,05) снижался в 1,5 раза по сравнению с исходным уровнем на стадии ОШ у больных 1-й группы и оставался очень низким во 2-й группе. Таким образом, наблюдался очевидный дисбаланс в концентрации субстратов для синтеза физиологически активных депо оксида азота — S-нитрозоглутатионов на этой стадии у всех пострадавших.
Наиболее выраженные изменения сохранялись в медь-зависимом звене АО-защиты. Так, у пациентов 1-й группы активность СОД оставалась на том же повышенном уровне, при этом содержание церулоплазмина достоверно (р < 0,05) увеличивалось в 1,2 раза по сравнению со значениями этого показателя на стадии ОШ в этой группе.
У больных 2-й группы, наоборот, углублялись тенденции к снижению эффективности АО-защиты. СОД не возрастала, а уровень церулоплазмина был снижен уже в 2,5 раза. Возможно, такое низкое содержание переносчика меди у этих пациентов и обусловливало неэффективность 1-й линии инактивации АФК.
По тяжести травмы больные 1-й и 2-й групп принципиально не отличались, лечение им назначалось по одному и тому же принципу, в том числе все они получали NО-донор Ь-аргинин. Но следует отметить, что на 3-и сутки лечения при выходе из ОШ 1-я группа больных характеризовалась положительной динамикой изменений АО-системы, тогда как у пациентов 2-й группы регистрировались самая высокая концентрация NО , низкое содержание GSH, очень
Таблица 1. Суммарная концентрация NОх и показатели антиоксидантной защиты у больных в ожоговом шоке (М ± т)
Группа больных Концентрация NОх в сыворотке крови, мкмоль/л Концентрация GSH, мкмоль/л Активность СОД в эритроцитах, усл.ед./л Содержание церулоплазмина в плазме, мг/л
Контроль(п = 17) 8,60 ± 0,50 1338± 115 11,63 ± 0,20 310 ± 8
1-я (п = 51) 10,20 ± 0,72 837± 56** 12,00 ± 0,07* 166 ± 8**
2-я (п = 9) 15,30 ± 1,50** 663± 72** 11,80 ± 0,40 146 ± 8**
Примечания: * — р < 0,05 в сравнении с контролем; ** — р < 0,001 в сравнении с контролем.
Таблица 2. Суммарная концентрация NОх и показатели антиоксидантной защиты у больных на стадии острой ожоговой токсемии (М ± т)
Группа больных Концентрация NОх в сыворотке крови, мкмоль/л Содержание GSH в эритроцитах, мкмоль/л Активность СОД в эритроцитах, усл.ед./л Уровень церулоплазмина в плазме, мг/л
Контроль(п = 17) 8,58 ± 0,48 1338±115 11,63 ± 0,20 310 ± 8
1-я (п = 51) 11,14 ± 0,83* 555 ± 50* 12,13 ± 0,10* 192 ± 9**
2-я (п = 9) 13,12 ± 2,92* 684± 122* 12,00 ± 0,60 122 ± 23**#
Примечания: * — р < 0,05 в сравнении с контролем; ** — р < 0,001 в сравнении с контролем; # — р < 0,05 в сравнении с 1-й группой.
Том 15, №4 • 2014
www.mif-ua.eom
131
низкий уровень церулоплазмина и отсутствие возрастания активности СОД, то есть наблюдались все условия для углубления окислительного и нитрозативного стрессов. Ретроспективный анализ историй болезни выявил, что в 1-й группе все выжили, а во 2-й летальность составила 100 %.
По нашему мнению, такой явно выраженный анти-оксидантный дисбаланс у пострадавших 2-й группы мог нивелировать положительный эффект назначения NO-доноров у этих пациентов. Следовательно, вышеперечисленные биохимические показатели могут быть информативны при индивидуализации контроля эффективности лечения препаратами L-аргинина тяжелообожженных.
Список литературы
1. Мопальцев В.И. Ожоговый шок: патофизиология, клиника, лечение / В.И. Мопальцев, Т.Т. Григорьева//' Лкування та дiагностика. — 2004. — № 2. — С. 33-39.
2. Ожоговый шок / В.П. Шано, В.К. Гринь, Э.Я. Фисталь и др. — Донецк: Юго-восток, 2006. — 176с.
3. Horton J.W. Arginine in burn injury improves cardiac performance and prevents bacterial translocation / J. W. Horton, J. White, D. Maas et al. // J. Appl Physiol. — 1998. — Vol. 84, № 2. — Р. 695-702.
4. Комбустиология: учебник / Э.Я. Фисталь, Г.П. Козинец, Г.Е. Самойленко и др. — Донецк, 2005. — 272 с.
5. Pacher P. Nitric oxide and peroxynitrite in health and disease / P. Pacher, J.S. Beckman, L. Liandet // Physiol. Rev. — 2007. — Vol. 87, № 1. — Р. 315-424.
6. Ho-Shiang H. Chronic L-arginine administration increases oxidative and nitrosative stress in rat hyperoxaluric kidneys and
Федорова Г.О., Борзенко Б.Г., Гнилорибов А.М. НститутневдкладноÍта вдновноíxipypní¡м. В.К. Гусака НАМН Украни
Донецький нацюнальний медичний ун'терситет ím. М. Горького
ОСОБЛИВОСЛ АНТИОКСИДАНТНОГО ЗАХИСТУ ПРИ TEPMÍ4HM TPABMÍ
Резюме. NO-донори устшно застосовуються при лжуванш рiзноl патологи для розширення судин та кардюпротекци. Але шфузп розчину L-аргшшу у великих об'емах можуть стимулю-вати окислювальний стрес. Ми дослщжували сумарну концен-трацш ттрапв/штрипв у кров^ умiст мщь-залежних антиок-сидантш та субстрату для зв'язування NO — вщновленого глу-татюну у тяжкообпечених, яи при лжуванш опжового шоку отримували L-аргшш. Нами було виявлено, що на 3-тю добу лжування тсля заинчення опжового шоку у 15 % постражда-лих спостерпалось значнше, н!ж у решти, збшьшення концен-трацп NOx (в 1,5 раза), вщсуттсть зростання активносп супер-оксиддисмутази, низький р1вень вщновленого глутатюну (у 2 рази нижче за контроль) i вiрогiдне зниження в 1,6 раза порш-няно з шшими та у 2,5 раза ж^вняно з контролем умiсту це-рулоплазмшу. Отже, можна говорити про значне приг^чення антиоксидантного захисту клиин при одночасному збiльшеннi продукцй оксиду азоту тсля шфузп L-аргшшу у цих пацieнтiв. Лета^ьнiсть в цш групi становища 100 %. Таким чином, нашi данi св!дчать про необхщтсть досл!дження вищеперелiчених показникiв при шдивщуальнш оцiнцi ефективностi викорис-тання NO-донорiв для лгкування тяжкообпечених. K^40BÍ слова: антиоксиданти, опгки, NO-донори.
excessive crystal deposition / H. Ho-Shiang, M. Ming-Chieh, J. Chen //Am. J. Physiol. Renal. Physiol. - 2008. - Vol. 295, august. - Р. 388-396.
7. Каминская Л.Ю. Влияние донатора NO нитрозотио-ла глутатиона на уровень окислов азота и малонового диальдегида в крови крыс/Л.Ю. Каминская, А.А. Жлоба, О.М. Моисеев и др. // Артер. гипертензия. — 2005. — Т. 11, № 1.
8. Samuel T.K.. Copper and nitric meet in the plasma / T.K.. Samuel, J.D. Giltin // Nature Chemical Biology. — 2006. — № 2. — P. 452-453.
9. Медицинские лабораторные технологии: Справочник / Под ред. А.И. Карпищенко. — СПб.: Интермедика, 2002. — 600с.
10. Доронина О.А Определение активности Cu/Zn-супер-оксиддисмутазы и пренатальная диагностика синдрома Дауна /О.А. Доронина, В.А. Бурлев, В.А Бахарев // Пробл. репродукции. — 1996. — №4. — С. 71-74.
11. Шселик 1.А Oсобливостi визначення нiтратiв та ш-тритiв у кровi хворих на вiруснi гепатити та жов-тянищ тшог етюлогн / 1.А. Юселик, М.Д. Луцик, Л.Ю. Шевченко // Лабораторна дiагностика. — 2001. — № 3. — С. 43-45.
12. Горячковский А.М. Клиническая биохимия / AM. Горяч-ковский. — Одесса: Астропринт, 1998. — 608с.
13. Hypoxia-induced endothelial NO synthase gene transcriptional activation is mediated through the tax-responsive element in endothelial cells/ Jiho Min, Yoon-Mi Jin, Je-Sung Moon et al. // Hypertension.. — 2006. — V. 47. — P. 1189-1196.
Получено 12.05.14 ■
Fyodorova A.A., Borzenko B.G., GnilorybovA.M. Institute of Urgent and Reconstructive Surgery named after V.K. Gusak of National Academy of Medical Sciences of Ukraine
Donetsk National Medical University named after M. Gorky, Donetsk, Ukraine
FEATURES OF ANTIOXIDANT PROTECTION IN THERMAL INJURY
Summary. NO-donors are being successfully used for treatment of various pathologies as vasodilators and cardioprotective drugs. But infusion of great volumes of L-arginine solution can stimulate oxidative stress. We have studied total concentration of nitrates/ nitrites in the blood, content of copper-dependent antioxidants and NO-binding — reduced glutathione substrate in patients with severe burns, who received L-arginine during the treatment for burn shock. We have detected that on the 3rd day of treatment after the end of burn shock, 15 % of victims reported more significant, than in other patients, NOx concentration (by 1.5 times), no increase in superoxide dismutase activity, low level of reduced glutathione (2fold lower than the control one) and a significant decrease, by 1.6 times in comparison with other patients, and 2.5-fold compared with the controls, of ceruloplasmin content. Hence, we can talk about a significant inhibition of cell antioxidant protection while increasing nitric oxide production after infusion of L-arginine in these patients. Mortality in this group was 100 %. Thus, our data suggest the need to study the above-mentioned indicators with individual assessment of the effectiveness of using NO-donors for the treatment of patients with severe burns.
Key words: antioxidants, burns, NO-donors.
