CC BY
13
УДК 616.65-006-018.2-037
ОЦЕНКА ПРОГНОСТИЧЕСКОЙ РОЛИ УРОВНЯ ЭКСПРЕССИИ
ГЛАДКОМЫШЕЧНОГО АКТИНА В РАКЕ ПРЕДСТАТЕЛЬНОЙ ЖЕЛЕЗЫ
А. К. Гриб, В. А. Басинский Гродненский государственный медицинский университет
По данным иммуногистохимического и морфометрического исследования проанализирована экспрессия гладкомышечного актина в раке предстательной железы. Выявлено, что ее низкий уровень в строме новообразований и в стенках сосудов характерен для низ-кодифференцированных раков и опухолей с более высоким метастатическим потенциалом. При этом в низкодифференцированных раках обнаружено нарушение формирования гладкомышечного каркаса сосудов, снижение его толщины, появление прерывистости и дефектов гладкомышечного слоя, что отражает несовершенство неоангиогенеза и может являться одним из прогностических маркеров новообразования.
Ключевые слова: рак предстательной железы, иммуногистохимия, гладкомышечный актин, неоангиогенез.
ASSESSMENT OF PROGNOSTIC VALUE OF SMOOTH MUSCLE ACTIN EXPRESSIONS IN PROSTATE CANCER
A. K. Grib, V. A. Basinskii Grodno State Medical University
Based оп the data yielded by immunohistochemical and morphometric research, expressions of smooth muscle actin in the prostate cancer were analysed. It was revealed, that its low expression in a stroma of neoplasms and in walls of vessels is more characteristic of low-grade cancers and tumours with higher metastatic potential. In addition, low-grade cancers featured disturbance of the formation of vessels' smooth muscle skeleton, decrease of its thickness, appearance of discontinuity and defects of smooth muscle layer, which reflect imperfection of neoangiogenesis and can be a prognostic marker of a neoplasm.
Key words: prostate cancer, immunohistochemistry, smooth muscle actin, neoangiogenesis.
Введение
Рак предстательной железы относится к числу наиболее тяжелых онкологических заболеваний мужской половой сферы, которое имеет склонность к быстрому метаста-зированию. В начале 70-х годов ежегодно в Беларуси раком предстательной железы заболевали около 200 мужчин. В последующие два десятилетия число новых случаев увеличивалось и в 1990 г. достигло 549 (увеличение в 2,2 раза). В целом за 36-летний период число ежегодно заболевающих раком предстательной железы увеличилось в 8,1 раза и достигло 1681 случаев в 2005 году [2]. Приведенные данные позволяют предположить, что рост данной патологии будет продолжаться, а это требует, наряду с совершенствованием методов своевременной
диагностики, шире внедрять и методы прогнозирования выявленного рака предстательной железы. Одним из важнейших критериев прогноза карцином предстательной железы является оценка гистологической структуры новообразования по данным операционного и биопсийного материала. Данное исследование является высокоинформативным и позволяет не только верифицировать диагноз, но и предсказать его клиническое поведение. Основным гистологическим критерием прогноза рака предстательной железы остается оценка степени дифференцировки опухоли с использованием шкалы Глиссона [5], позволяющей прогнозировать выживаемость больных [1]. Однако данная система учитывает только морфологию эпителиального составляющего
рака предстательной железы и не всегда адекватно оценивает инвазивный и метастатический потенциал новообразования.
Вместе с тем известно, что значительную роль как в канцерогенезе, так и в про-грессировании новообразования играет стро-мальное микроокружение. При неопластических заболеваниях развивается нарушение стромально-эпителиальных взаимодействий, способных оказывать существенное влияние на поведение опухолевых клеток. Для многих эпителиальных злокачественных новообразований доказано возникновение характерной стромальной реакции в ответ на опухолевую прогрессию [3, 5]. Тем не менее к настоящему времени не изучены в достаточной степени механизмы стромально-эпителиальных взаимоотношений и их влияния на прогрессирование злокачественных новообразований. В тех опухолях, где наблюдается стромальная реакция, отмечено, что она заметно отличается от реакции при других патологических процессах, в которых также наблюдается нарушение стромально-паренхиматозных взаимоотношений. Так, при заживлении ран стро-мальная реакция сопровождается повышенной продукцией компонентов экстрацел-люлярного матрикса, факторов роста и ре-моделирующих экстрацеллюлярный матрикс ферментов, которые и формируют поддерживающее рост паренхиматозных клеток стромальное микроокружение [8]. При злокачественных новообразованиях стромальная реакция, как правило, способствует опухолевому росту посредством стимулирования ангиогенеза, повышения выживаемости раковых клеток, пролиферации и инвазии.
Факторы роста, вырабатываемые эпителиальными и стромальными клетками при раке простаты, задействованы в еще более сложных взаимоотношениях, становясь участниками гормональной регуляции клеточного роста, индуцируя лиганднеза-висимую активацию или супрессию андро-геновых рецепторов [6]. Потеря баланса между факторами, стимулирующими и ин-гибирующими пролиферацию, может индуцировать простатическую стромальную гиперплазию, наблюдаемую при доброкачественных формах, или гиперпластическую реакцию эпителия, наблюдаемую при раке [4]. При исследовании стромально-паренхиматозных взаимоотношений с ис-
пользованием клеточных культур рака предстательной железы были выявлены значительные изменения в составе стромального микроокружения рака предстательной железы по сравнению с доброкачественной гиперплазией и простатической интраэпители-альной неоплазией: увеличение количества миофибробластов и уменьшение зрелых глад-комышечных клеток, увеличение количества гиалуроновой кислоты, матриксных метал-лопротеаз и тенасцина [7, 8, 10]. Замещение полноценных гладкомышечных клеток миофибробластами ведет к несовершенному ангиогенезу с формированием неполноценных сосудов микроциркуляторного русла с низкой экспрессией гладкомышечного актина. Таким образом, резюмируя приведенные выше литературные данные, можно предположить, что при раке предстательной железы стромальный компонент значительно видоизменяется и формирует так называемое реактивное стромальное микроокружение, которое, с одной стороны, стимулирует опухолевый рост, а с другой стороны, может ему препятствовать.
Целью настоящего исследования явилось сравнительное изучение эксперессии одного из компонентов стромального микроокружения — гладкомышечного актина в строме рака предстательной железы и в стенке сосудов микроциркуляторного русла в зависимости от степени дифференци-ровки опухоли и сопоставление выраженности экспрессии с клиническим течением и исходом заболевания.
Материалы и методы
Материалом данного исследования стали 47 наблюдений рака предстательной железы, полученные при трансуретральной резекции за период с 1996 по 2000 год. Всем больным применялась сходная схема комбинированной терапии новообразования. При первичном гистологическом исследовании все они являлись аденокарци-номами различной степени дифференци-ровки: высокодифференцированные раки (Глиссон 2-5) составили 12 случаев, уме-реннодифференцированные (Глиссон 6-7) — 15 и низкодифференцированные (Глиссон 710) — 20 случаев. При анализе клинических данных весь исследуемый материал был разделен на клинические группы с выявленными регионарными или отдаленными метастазами (17 случаев) и без выяв-
ленных метастазов (30 наблюдений). Кроме этого, анализируемый материал исследовался в зависимости от выживаемости больных. Больных, проживших менее года, выявлено 7, от 1 года до 5 лет — 29, более 5 лет — 12 человек. Для выявления глад-комышечного актина в строме опухолей и стенке сосудов использовали иммуногисто-химическое окрашивание с применением моноклональных мышиных антител фирмы «Dako», клон 1A4 в стандартном разведении. Из парафиновых блоков готовились срезы толщиной 5 микрон, переносились на предметные стекла, покрытые полиси-ланом, срезы в вертикальном положении высушивали 18 часов при комнатной температуре и помещали в термостат на 30 мин при температуре 60°С. Депарафинация проводилась в ксилоле (в батарее из 3 емкостей по 3 минуты в каждой), дегидратация в этиловом спирте (в батарее из 3 емкостей в спиртах восходящей крепости по 3 мин в каждой). В последующем предметные стекла со срезами переносились в цитратный буфер РН 6.0 и помещались в водяную баню при температуре 98°С на 30 мин. Для блокирования эндогенной пероксидазы срезы обрабатывались 3% перекисью водорода в течение 5 минут, и наносились первичные антитела в стандартном разведении. Срезы инкубировались в течение 30 минут при комнатной температуре. В качестве визуализирующей системы использовали комплекс вторичных антител EnVision фирмы «Dako» с диаминбензидином. Затем срезы промывали проточной водой, докрашивали гематоксилином и заключали в полистерол.
Для морфометрической оценки экспрессии гладкомышечного актина микропрепараты фотографировали в 6 полях зрения (объектив 20) с разрешением 1600 на 1200 пикселей при помощи микроскопа Axiostar и цифровой камеры Canon A620. Для более тонкой визуализации иммуноги-стохимической реакции, устранений артефактов окрашивания и фоновой реакции в фоторедакторе Adobe Photoshop CS 8.0 при помощи инструмента «color range» выделяли характерную коричневую окраску, которую дают продукты реакции диаминбензи-дина, а окружающий фон удаляли при помощи инструмента «magic wand». Для количественного подсчета экспрессии глад-комышечного актина использовали анали-
затор изображений Aperio Image Scope, который подсчитывает количество позитивных пикселей (пиксели, имеющие коричневую окраску). Изучены следующие морфо-метрические параметры: общая площадь, занимаемая гладкомышечным актином, количество отдельных гладкомышечных волокон и средний размер гладкомышечного волокна. Для морфометрического исследования экспрессии гладкомышечного актина в стенке сосудов микропрепараты фотографировались с использованием объектива 40, выбирались сосуды, которые имели четкий поперечный срез и диаметр 40-50 мкм. Толщина стенки измерялась в 4-х взаимно перпендикулярных точках сосудистой стенки. Изучены следующие параметры: толщина гладкомышечного составляющего стенки сосуда, площадь стенки и просвета сосуда. Подсчет вышеуказанных параметров производили с использованием анализатора изображений WCIF ImageJ.
Полученные данные были обработаны при помощи табличного процессора Excel из пакета MS Office 2003 c модулем статистического анализа «AtteStat 3.4», использовался t- критерий Стьюдента.
Результаты исследования
Окраска микропрепаратов рака предстательной железы с использованием антител к гладкомышечному актину позволила четко выявить гладкомышечную составляющую стромы и мышечную стенку сосудов микроциркуляторного русла. Количественная оценка степени экспрессии гладкомышечного актина показала, что в группе опухолей с выявленными метастазами общая площадь, занимаемая гладкомышечным составляющим стромы, составила: 29594,93 ± 1803,27 мкм на единицу исследуемой площади. При исследовании сосудов толщина гладкомы-шечного слоя сосудов микроциркулятор-ного русла составила 3,10 ± 0,4 мкм. Средняя площадь гладкомышечного компонента сосудистой стенки составила 778,44 ± 15,36 мкм2, а средняя площадь просвета сосуда — 340,41 ± 12,76 мкм2.
В группе опухолей без выявленных метастазов средняя площадь, занимаемая экспрессией гладкомышечного актина, составила 36912,93 ± 1472,9 мкм2, толщина глад-комышечной составляющей стенки сосуда — 5,07 ± 0,42 мкм, площадь экспрессии гладкомышечного актина в стенке — 801,63 ±
20,01, средняя площадь просвета сосуда — 320 ± 5,1 мкм2. При статистическом сравнении данных групп больных с использованием ^критерия Стьюдента достоверные различия получены при сравнении площади, занимаемой экспрессией гладкомышеч-ного актина (1 = 2,79, р = 0,0077), толщины гладкомышечного компонента сосудистой стенки (1 = 2,933817, р = 0,0053), площади экспрессии гладкомышечного актина в сосудистой стенке (1 = 2,677304, р = 0,012).
Анализ материала в зависимости от степени злокачественности опухоли показал, что среднее значение площади экспрессии гладкомышечного актина составило в группе высокодифференцированных опухолей 43715,18 ± 1589,07 мкм2, в группе умерено дифференцированных опухолей — 34969,29 ± 1262,54 мкм2, низкодиф-ференцированных — 29270,84 ± 1443,36 мкм2. При статистическом анализе вышеуказанного параметра выявлены достоверные различия между всеми исследуемыми группами (Р < 0,05). Толщина сосудистой стенки и площадь экспрессии гладкомышечного актина в стенке сосуда в опухолях с высокой степенью дифференцировки составили, соответственно, 7,19 ± 0,29 мкм и 910,74 ± 13,99 мкм2; в группе умереннодиффереци-рованных опухолей толщина гладкомы-шечного компонента стенки сосуда — 4,65 ± 0,32 мкм, площадь экспрессии гладкомы-шечного актина сосудистой стенки — 829,68 ± 9,99 мкм2. Группа низкодиффе-ринцированных опухолей характеризовалась следующими морфометрическими данными: толщина гладкомышечного слоя — 2,47 ± 0,22 мкм, площадь экспрессии глад-комышечного актина — 706,62 ± 5,74 мкм. При статистическом анализе с использованием критерия Стьюдента статистически достоверные различия (р < 0,05) получены между всеми исследуемыми группами и по всем исследуемым признакам. Таким образом, полученные данные свидетельствуют о том, что с уменьшением степени диффе-ренцировки рака предстательной железы уменьшается и гладкомышечная составляющая стромы. Кроме этого, при микроскопическом исследовании, выявлены значительные изменения созревания сосудов, участвующих в неоангиогенезе: стенка сосудов низкодифференцированных опухолей характеризовалась потерей и наруше-
нием структуры гладкомышечного слоя, уменьшением толщины сосудистой стенки и увеличением просвета сосудов. Все вышеуказанные морфометрические показатели согласуются с данными, полученными в группах с выявленными метастазами и без них.
При сопоставлении морфометрических параметров экспрессии гладкомышечного актина стромы и сосудистой стенки с общей выживаемостью больных были получены следующие данные.
В группе больных, проживших более 5 лет, выявлены следующие морфометри-ческие показатели экспрессии гладкомы-шечного актина: площадь его экспрессии в строме составила 37957,91 ± 2570,62 мкм2, толщина гладкомышечного компонента сосудистой стенки — 5,66 ± 0,53 мкм, площадь экспрессии гладкомышечного актина в стенке сосудов — 827,15 ± 23,69 мкм2, площадь просвета сосудов — 289,94 ± 8,36 мкм2. В группе больных, проживших от 1 года до 5 лет, были получены следующие результаты: экспрессия актина в строме —33844,85 ± 1382,91 мкм2, толщина гладкомышечной основы стенки сосудов — 4,05 ± 0,41 мкм, площадь экспрессии в сосудистой стенке — 793,29 ± 19,46 мкм2, средняя площадь просвета сосудов — 329,12 ± 7,7 мкм2. В группе больных, проживших менее 1 года, выявлена следующая характеристика экспрессии гладкомышечного актина: площадь экспрессии в строме — 27 976±3043,57 мкм2, толщина гладкомышечного слоя — 3,62 ± 1,12 мкм, площадь экспрессии в сосудистой стенке — 752,44 ± 25,39 мкм2, площадь просвета сосуда — 359,68 ± 8,68 мкм2. Статистически достоверная разница по всем перечисленным параметрам (р < 0,05) была получена в крайних группах, т. е. в группах больных, проживших более 5 лет и менее 1 года.
Выводы
Таким образом, экспрессия гладкомы-шечного актина в строме рака предстательной железы значительно варьирует в зависимости от степени дифференцировки злокачественного новообразования, что наряду с оценкой эпителиального компонента по Глиссону должно учитываться в оценке прогноза опухоли. При этом количество гладкомышечного актина значительно больше в опухолях более высокой дифференцировки и низкого метастатиче-
ского потенциала. Обнаруженные в низ-кодифференцированных раках нарушения формирования гладкомышечного каркаса сосудов со снижением его толщины, появлением прерывистости и дефектов глад-комышечного слоя отражают несовершенство неоангиогенеза и могут являться одним из прогностических маркеров новообразования.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ СПИСОК
1. Первичная культура аденокарциномы простаты: модель для изучения стромально-эпителиаль-ных взаимодействий / О. П. Гладских [и др.] // Архив патологии. — 2002. — Вып. 6. — С. 40-43.
2. Эпидемиология рака предстательной железы в Республике Беларусь // Актуальные вопросы диагностики и лечения рака предстательной железы: материалы международной научно-практической конференции / И. В. Залуцкий, Ю. И. Аверкин. — Минск, 27-28 октября, 2006 г. — С. 5-12.
3. Морфункциональная характеристика микро-циркуляторного русла в серозных опухолях яичника / Л. М. Михалева [и др.] // Архив патологии. — 2005. — Вып 6. — С. 28-31.
4. Dvorak, H. F. Tumors: wounds that do not heal. Similarities between tumor stroma generation and wound healing / H. F. Dvorak // N. Engl. J. Med. — 1986. — Vol. 315. — Р. 1650-1659.
5. Gleason, D. F. Classification of prostatic carcinomas / D. F. Gleason // Cancer Chemother. Rep. — 1966. — Vol. 50. — P. 125-128.
6. Reactive stroma in human prostate cancer: induction of myofibroblast phenotype and extracellular matrix remodeling / A. Jennifer [et al.] // Clinical Cancer Research — 2002. — Vol. 8. — Р. 2912-2923.
7. Stromal and epithelial expression of tumor markers hyaluronic acid and HYAL1 hyaluronidase in prostate cancer / V. B. Lokeshwar [et al.] // J. Biol. Chem. — 2001. — Vol. 276. — Р. 11922-11932.
8. Murphy, W. M. Prognostic factors in the pathological assessment of prostate cancer / W. M. Murphy // Hum.Pathol. — 1998. — Vol. 29. — P. 427-430.
9. Elevated levels of versican but not decorin predict disease progression in early-stage prostate cancer / C. Ricciardelli [et al.] // Clin. Cancer Res. — 1998. — Vol. 4. — Р. 963-971.
10. In situ hybridization studies of metallopro-teinases 2 and 9 and TIMP-1 and TIMP-2 expression in human prostate cancer / M. Wood [et al.] // Clin. Exp. Metastasis. — Vol. 15. — Р. 246-258.
Поступила 17.05.2007
УДК 616.72-002-092.9)
ПАТОМОРФОЛОГИЧЕСКАЯ ХАРАКТЕРИСТИКА ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНОГО ОСТЕОАРТРОЗА
В. И. Николаев, О. А. Голубев
Гомельский государственный медицинский университет
На примере белых лабораторных крыс рассматриваются патоморфологические характеристики экспериментального остеоартроза в различные сроки развития патологического процесса. В оригинальном исследовании предложен способ формирования патологических изменений в суставе и методы морфологической оценки тканевых изменений, которые позволяют дать объективную характеристику морфогенетических процессов.
Ключевые слова: патоморфологические характеристики, экспериментальный остео-артроз, эксперимент.
PATНОMORPHOLOGICAL CHARACTERISTIC EXPERIMENTAL OSTEOARTROZIS
V. I. Nikolaev, O. A. Gol^v Gomel State Medical University
By the example of white laboratory rats are considered pathomorphological characteristics experimental osteoartrozis in various terms of development of pathological process. In original research the way of formation of pathological changes in a joint and methods of a morphological estimation of fabric changes which allow to give the objective characteristic morphogenetic processes is offered.
Key words: pathomorphological characteristics, experimental osteoartrozis, experiment.
