CC BY
34
УДК 616.248-053.2:575.113
ОЦЕНКА ПОКАЗАТЕЛЕЙ ФУНКЦИОНАЛЬНОЙ АКТИВНОСТИ РИБОСОМНЫХ ГЕНОВ И ЕЕ ВЗАИМОСВЯЗЬ С НЕКОТОРЫМИ КЛИНИЧЕСКИМИ И СОЦИАЛЬНО-БИОЛОГИЧЕСКИМИ ПОКАЗАТЕЛЯМИ
У ДЕТЕЙ,
БОЛЬНЫХ БРОНХИАЛЬНОЙ АСТМОЙ*
© 2010 В. П. Иванов1,2, Н. В. Стабровская1,3, А. Д. Богомазов4,
12 2 1 1 Е. В. Трубникова ’ , А. А. Дедков , А. Н. Барков , И. Л. Осетрова
1 Курский государственный университет - НИЛ «Генетика»
2Курский государственный медицинский университет - кафедра биологии, медицинской генетики и экологии 3Курский государственный медицинский университет - НИИ Экологической
медицины
4Курский государственный медицинский университет - кафедра педиатрии
e-mail: star_n@inbox.ru
Получены данные, свидетельствующие о наличии тесной взаимосвязи показателей функциональной активности рибосомных генов и некоторых клинических показателей у детей с бронхиальной астмой. Показатели количества копий активных рибосомных генов на геном и количества окрашенных хромосом являются значимыми характеристиками при постановке или подтверждении диагноза бронхиальной астмы.
Ключевые слова: бронхиальная астма, функциональная активность рибосомных
генов.
Сегодня наиболее остро стоит проблема правильности выбора критериев, по которым возможно разделение индивидов на группы для анализа течения и клинических проявлений различных мультифакториальных заболеваний. Одним из признаков, связанных с большим числом морфофункциональных систем организма, является функциональная активность рибосомных генов (ФАРГ).
Рибосомные гены (РГ) являются одними из основных генов в молекуле ДНК. С них транскрибируются рРНК, идущие на постройку рибосом. Рибосомальные РНК входят в состав рибосом: 188-рРНК - в состав малой субъединицы и 28S-, 5,8S- и 5S-рРНК - в состав большой субъединицы. Гены 18S-, 28S- и 5^-рРНК располагаются в зонах так называемых ядрышковых организаторов (вторичные перетяжки D- (13, 14, 15) и G-хромосом (21, 22)) [Raska, Koberna, Malinsky et al. 2004; Вахитов, Чемерис, Гималов и др. 2004]. Изменения активности РГ ведут к изменению количества белков, синтезируемых клеткой, что сказывается на жизнедеятельности организма в целом. Возможность изучения фенотипического проявления дозы РГ появилась совсем недавно. Получены данные по взаимосвязи показателей ФАРГ и среднесуточной прибавки массы тела у детей первого года жизни, фенотипических проявлений при злокачественных новообразованиях различного генеза, язвенной болезни и многих других заболеваний. Также имеются данные об изменении показателей ФАРГ при различных мультифакториальных заболеваниях и различных состояниях организма [Иванов, Трубникова, Бушуева, Колчанова 2008; Мамаев 1997].
Тем не менее в литературе не получили должного освещения вопросы, касающиеся комплексной оценки взаимосвязей показателей ФАРГ и клинических
* Работа выполнена по заказу Федерального агентства по образованию № 1.2.08
проявлений у детей, больных бронхиальной астмой (БА). Сегодня бронхиальная астма - это одно из самых распространенных заболеваний как среди взрослого, так и среди детского населения планеты. У 80-90% больных первый приступ бронхиальной астмы развивается в возрасте до 5 лет. При этом провоцируют наступление приступов даже неантигенные факторы: физическая нагрузка, охлаждение, перегревание, психогенные факторы, резкие изменения метеорологических условий, загрязнения атмосферы [Esevery, Cozzo, Marin, Botey 1998; Holgate 1999; Детская аллергология... 2006].
Целью настоящей работы явилось изучение ФАРГ лимфоцитов периферической крови детей, больных БА и здоровой популяции, их сравнение, выявление корреляционных связей с некоторыми клиническими и социально-биологическими характеристиками у детей.
Комплексное исследование клинических и социально-биологических особенностей детей, больных БА, проводилось на выборке из 78 индивидов. В контрольную группу вошли 45 относительно здоровых детей.
Сбор информации для исследования проводился в условиях стационара по оригинальной анкете, разработанной на кафедре биологии, медицинской генетики и экологии Курского государственного медицинского университета. Клиниколабораторные исследования проводили квалифицированные специалисты на базе областной детской клинической больницы г. Курска.
Цитогенетические препараты для изучения ФАРГ получали при культивировании лимфоцитов периферической крови человека по стандартной методике [Ляпунова, Еголина, Вейко и др. 2001]. Препараты окрашивали азотнокислым серебром по методике, предложенной W. M. Howell и D. A. Black [Мамаев 1997; Назаренко, Васильева 2003] с модификациями. При окрашивании нитратом серебра метафазных хромосом селективно окрашиваются районы вторичных перетяжек. Размер преципитата серебра отражает количество транскрибируемых копий РГ в данной хромосоме. В основе метода лежит сродство ионов серебра к ядрышкообразующим районам, расположенным в районах вторичных перетяжек акроцентрических хромосом. Принято считать, что в ходе реакции происходит восстановление ионов Ag+ до металлического серебра Ag0. Аргентофильными свойствами в метафазных хромосомах обладают только те ядрышковые организаторы, которые были активны в интерфазе, предшествующей митозу [Сабанеева 1989]. Оценку активности РГ определяли визуально под микроскопом по пятибалльной шкале с помощью методики Н. А. Ляпуновой [Ляпунова, Еголина, Вейко и др. 2001].
Статистическую обработку результатов исследования проводили с помощью пакетов прикладных программ MS Excel (MS Office 2003, USA) и Statistica 6.0 (StatSoft inc., USA). Статистически значимые различия принимались при р<0,05.
В ходе проведенных исследований было установлено, что показатели ФАРГ у детей, больных БА, статистически значимо ниже показателей в контрольной группе детей. Полученные данные представлены в таблице 1. Из них видно, что снижение активности РГ в группе детей с БА происходит за счет хромосом группы D.
Сравнительный анализ детей контрольной группы и детей с БА позволил выявить ряд различий. Так, почти в половине случаев в контрольной группе отмечался факт перенесения матерями во время беременности инфекционных заболеваний (44,44%), что превышало более чем в два раза аналогичный показатель у больных детей (20,00%), t=2,8. Статистически значимые различия наблюдались при изучении психоэмоциональной обстановки в семьях детей и в школе. Примечательно, что почти в половине случаев этот показатель в контрольной группе достигал отметки «неудовлетворительная» - 48,89%. Среди больных он составлял лишь 4,00% (t=5,76).
Установлено, что дети, страдающие БА, чаще, чем дети контрольной группы, болели ОРЗ (1=3,53).
Ряд различий отмечен по показателям гемограмм между контрольной и экспериментальной группами. Так, в группе больных БА по сравнению с контрольной группой наблюдается повышенное содержание гемоглобина (137,53 и 119,56 соответственно, 1=11,52), лимфоцитов (43,58 и 22,44 соответственно, 1=12,42), эозинофилов (5,65 и 0 соответственно, 1=11,37) и моноцитов (5,38 и 4,07 соответственно, 1=2,75); снижение показателей эритроцитов (4,16 и 4,34
соответственно, 1=2,95) и сегментоядерных нейтрофилов (42,14 и 68,87 соответственно, 1=15,40).
При этом в группе больных детей отмечалась наследственная отягощенность по различным аллергическим состояниям.
Таблица 1
Показатели функциональной активности рибосомных генов у детей, больных бронхиальной астмой, и в контрольной группе
Признак Бронхиальная астма Контроль 1
Суммарная активность РГ по 10 хромосомам 18,57±0,14 19,43±0,24 3,30*
Активность РГ по Б-хромосомам 11,13±0,14 11,93±0,19 3,50*
Активность РГ по О-хромосомам 7,44±0,15 7,50±0,20 0,23
Число окрашенных хромосом 8,44±0,07 8,61±0,09 1,43
Число ассоциаций акроцентрических хромосом на 1 клетку 0,71±0,04 0,76±0,05 0,75
Число хромосом, вступивших в ассоциации в 1 клетке 1,53±0,09 1,64±0,12 0,77
* Различия статистически достоверны при р<0,05
Выполненный корреляционный анализ также выявил ряд различий между двумя группами детей. Так, в контрольной группе наиболее информативными цитогенетическими показателями были число ассоциаций и число хромосом, вступивших в ассоциации. При этом они проявляли связь с такими показателями, как характер соматической патологии матерей, обострение которых имело место во время беременности (г=0,31 и г=0,31 соответственно). Показатели ФАРГ хромосом группы Б проявили взаимосвязь с характером инфекционных заболеваний, перенесенных матерями во время беременности (г=0.31), в то время как показатели ФАРГ хромосом группы О демонстрировали обратную взаимосвязь только с фактом наличия этих заболеваний (г=-0,32).
У больных БА были выявлены обратные корреляционные связи между активностью РГ и психоэмоциональной обстановкой в школе (г=-0,24) и показателем количества лейкоцитов в крови (г=-0,26), прямая связь с показателем типа аллергических заболеваний в семье ребенка (г=0,25). Общая ФАРГ коррелировала с количественным содержанием лейкоцитов в крови (г=-0,24). Отдельно следует отметить проявление обратной корреляционной связи между показателем активности РГ по О-хромосомам и количественным содержанием иммуноглобулина Е (г=-0,24).
Выполненный кластерный анализ выявил наиболее приоритетные корреляционные взаимосвязи в рассматриваемых группах детей. Его результаты представлены на рисунке.
На заключительном этапе нами был проведен дискриминантный анализ, результаты которого приведены в таблице 2, в которую включены наиболее значимые
показатели социально-биологических, клинико-лабораторных и цитогенетических характеристик, играющих важную роль в постановке или подтверждении диагноза БА.
0.9 0.8 0.7 0.6 0.5 0.4 0.3 0.2 0.1 0 03 07 06 05 0* 05 0^ 01 0
Б А
Дендрограммы корреляционных взаимосвязей: А - контрольная группа детей (г5%=0,31); Б -группа детей, больных БА (г5%=0,22):
1 - место рождения родителей; 2 - период заболевания; 3 - характер соматических заболеваний у матери, обострение которых наблюдалось во время беременности; 4 - наличие инфекционных заболеваний, перенесенных матерью во время беременности; 5 - характер инфекционных заболеваний, перенесенных матерью во время беременности; 6 - течение родов; 7 - длительность грудного вскармливания ребенка; 8 - степень тяжести астмы; 9 - курение в квартире; 10 - психоэмоциональная обстановка в семье; 11 - психоэмоциональная обстановка в школе; 12 - лабильность нервной системы;
13 - частота ОРЗ; 14 - телосложение; 15 - наличие аллергических заболеваний у отца; 16 - степень тяжести аллергических заболеваний у отца; 17 - наличие аллергических заболеваний у матери; 18 -степень тяжести заболеваний матери; 19 - наличие аллергических заболеваний в семье; 20 - характер аллергических заболеваний в семье; 21 - патология беременности; 22 - количество эритроцитов, *1012/л;
23 - содержание гемоглобина, г/л; 24 - количество сегментоядерных нейтрофилов, %; 25 - количество лимфоцитов, %; 26 - количество эозинофилов, %; 27 - количество моноцитов, %; 28 - содержание общего иммуноглобулина Е, мЕ/мл; 29 - копийность РГ; 30 - ФАРГ по 10 хромосомам; 31 - ФАРГ по хромосомам группы Б; 32 - ФАРГ по хромосомам группы О; 33 - число окрашенных хромосом; 34 -число ассоциаций акроцентрических хромосом; 35 - число хромосом, вступивших в ассоциации
Таким образом, среди многообразия клинических и социально-биологических характеристик больных БА можно выделить 10 наиболее приоритетных. При этом возможно проведение сегрегации индивидов на больных и здоровых с вероятностью 99,19%.
Пример 1. У индивида А. следующие показатели гемограммы: содержание сегментоядерных нейтрофилов - 48%, содержание эритроцитов - 4,08*1012/л, количество гемоглобина - 151 г/л; частота ОРЗ составляет в среднем 3 раза в год; во время беременности у матери не наблюдалось обострений соматических заболеваний, но были перенесены инфекционные; наследственной отягощенности по атопическим заболеваниям у индивида не наблюдается; индивид относится к группе
среднекопийных индивидов со средним числом окрашенных хромосом 6,8. Подставив данные значения в уравнение ЛДФ, получим для больного А.:
уі = -311,86+48Х0,08+151Х2,09+4,08Х11,86+3Х13,80+0Х(-3,77)+2Х2,67+2Х
Х(-10,92)+1Х1,59+0Х11,06+6,8Х30,43 = 289,57;
у2 = -286,94+48Х0,54+151Х1,48+4,08Х23,88+3Х9,08+0Х0,10+2Х1,12+2Х
Х(-7,37)+1Х4,42+0Х6,54+6,8Х28,17 = 269,86.
Так как у1>у2, то индивида А. относим к группе больных БА с вероятностью 99,19%.
Таблица 2
Наиболее значимые социально-биологические, клинические и цитогенетические характеристики детей по результатам дискриминантного анализа при сегрегации детей
на больных БА и здоровых детей (F(12,11)=69,67, р<0,0001)
Признак Ценность признака Коэффициенты регрессии
Бронхиальная астма Контроль
Количество сегментоядерных клеток 93,11 0,08 0,54
Количество гемоглобина 99,4 2,09 1,48
Количество эритроцитов 36,48 11,86 23,88
Частота ОРЗ: менее 1 раза в год, 1-2 раза в год, 3-4 раза в год, более 5 раз в год 24,77 13,80 9,08
Характер соматических заболеваний матери, обострение которых наблюдалось во время беременности: пиелонефрит, хронический гастрит, тонзиллит 9,30 -3,77 0,10
Характер аллергических заболеваний в семье: БА, атопический дерматит, пищевая аллергия, экзема 5,99 2,67 1,12
Копийность РГ 5,33 -10,92 -7,37
Наличие инфекционных заболеваний у матери во время беременности 4,41 1,59 4,42
Степень тяжести аллергических заболеваний у матери 4,28 11,06 6,54
Число окрашенных хромосом 4,23 30,43 28,17
Constanta -311,86 -286,94
Пример 2. У индивида Б. следующие показатели гемограммы: содержание сегментоядерных нейтрофилов - 73%, содержание эритроцитов - 4,2х1012/л, количество гемоглобина - 110 г/л; частота ОРЗ составляет в среднем 2 раза в год; во время беременности у матери отмечено обострение пиелонефрита и наблюдались инфекционные заболевания; наследственной отягощенности по атопическим заболеваниям у индивида не наблюдается; индивид относится к группе высококопийных индивидов со средним числом окрашенных хромосом 9,2. Подставив данные значения в уравнение ЛДФ, получим для больного Б.:
у1 = -311,86+73х0,08+110х2,09+4,20х11,86+2х13,80+1х(-3,77)+0х2,67+3х х(-10,92)+1х1,59+0х11,06+9,2х30,43 = 246,23
у2 = -286,94+73х0,54+110х1,48+4,20х23,88+2х9,08+1х0,10+0х1,12+3х
х(-7,37)+1х4,42+0х6,54+9,2х28,17 = 274,80
Так как у1<у2, то индивида Б. относим к группе относительно здоровых детей с вероятностью 99,19%.
Таким образом, нами были получены данные, отражающие ФАРГ у детей, больных БА, и в контрольной группе. Активность РГ в экспериментальной группе была статистически достоверно ниже, чем в контрольной группе (1=3,30). Ниже была и активность РГ, локализованных в Б-хромосомах (1=3,50).
Анализ социально-биологических и клинических характеристик детей с БА и контрольной группы выявил ряд статистически значимых различий. При этом дети с БА характеризовались наличием наследственной отягощенности по аллергическим заболеваниям, повышением частоты заболеваемости ОРЗ, а также повышенным содержанием моноцитов (1=2,75), эозинофилов (1=11,37), лимфоцитов (1=12,42) и гемоглобина (1=11,52) в крови ребенка и снижением содержания эритроцитов (1=2,95) и сегментоядерных нейтрофилов (1=15,40).
Многомерный анализ детей с БА и контрольной группы выявил ряд корреляционных взаимосвязей ФАРГ и клинических и социально-биологических показателей. При этом в контрольной выборке корреляционные связи на статистически значимом уровне проявляли практически все показатели ФАРГ с различными показателями анкеты. В то же время в экспериментальной группе с тремя показателями ФАРГ (суммарная ФАРГ, активность хромосом группы Б и число окрашенных хромосом) коррелировал только показатель психоэмоциональной обстановки в школе. Также проявлялась статистически значимая связь между показателем активности РГ и характером аллергических заболеваний в семье. Среди клинико-лабораторных показателей основные корреляционные связи проявляли показатели суммарной ФАРГ с количественным содержанием лейкоцитов и показатели активности РГ по хромосомам группы О с количественным содержанием иммуноглобулина Е.
Дискриминантный анализ позволил выявить 10 наиболее ценных характеристик для сегрегации индивидов на больных и здоровых с вероятностью 99,19%, куда вошли также и показатели активности РГ.
Библиографический список
Вахитов В. А., Чемерис Н. В., Гималов Р. Ф. и др. Дифференциальная экспрессия генов рРНК у полиплоидных видов пшениц в связи с эффектом ядрышкового доминирования. Уфа, 2004. 77 с.
Детская аллергология: руководство для врачей / под ред. А. А. Баранова, И. И. Балаболкина. М., 2006. 688 с.: ил.
Иванов В. П., Трубникова Е. В., Бушуева О. Ю., Колчанова И. О. Особенности клинических проявлений мультифакториальных заболеваний (язвенной болезни, миомы матки, злокачественных лимфом) и модифицирующее действие рибосомных генов. Курск, 2008. 420 с.
Ляпунова Н. А., Еголина Н. А., Вейко Н. Н. и др. Ядрышкообразующие районы (ЯОР) хромосом человека: опыт количественного цитологического и молекулярного анализа // Биологические мембраны. 2001. Т. 18, №3. С. 189-199.
Мамаев Н. Н. Структурная организация и экспрессия рибосомных генов в физиологических и патологических условиях // Цитология. 1997. Т. 39. №1. С. 80.
Назаренко С. А., Васильева Е. О. Тест-система внешнего контроля качества цитогенетических исследований в учреждениях медико-генетической службы: пособие для врачей. Томск: Печатная мануфактура, 2003. 34 с.
Сабанеева Е. В. Специфичность окрашивания ядрышковых организаторов азотнокислым серебром // Цитология. 1989. Т. 31. №1. С. 5-14.
Esevery J. L., Cozzo M., Marin A. M., Botey J. Epidemiology and chronology of allergic diseases and their risk factors // Allergol. Immunopathol. 1998. Vol. 26. №3. P. 90-97.
Holgate S. T. Genetic and environmental interaction in allergy and asthma // J. Allergy - din. Immunology. 1999. V. 104. Р. 1139-1146.
Howell W. L., Denton T. E. An ammoniacal-silver stain technique specific for satellite III DNA regions on human chromosomes // Experientia. 1974. Vol. 30. P. 1364-1366.
Raska I., Koberna K., Malinskÿ J. et al. The nucleolus and transcription of ribosomal genes // Biology of the Cell. 2004. Vol. 96. P.579-594.
