CC BY-ND
13
МАЙ HOC (290)
ЗНиСО
49
УДК 579.61:616-078(470.620)
ОЦЕНКА ПИТАТЕЛЬНЫХ СРЕД ДЛЯ ВЫДЕЛЕНИЯ И КУЛЬТИВИРОВАНИЯ ЛЕГИОНЕЛЛ С ИСПОЛЬЗОВАНИЕМ ШТАММОВ, ВЫДЕЛЕННЫХ ВО ВРЕМЯ ПРОВЕДЕНИЯ ОЛИМПИЙСКИХ ИГР 2014 ГОДА В Г. СОЧИ
Н.В. Жаринова, Е.Б. Жилченко, Л.С. Катунина, О.А. Коняева, Н.С. Сердюк, О.Н. Гаврилова
ФКУЗ «Ставропольский противочумный институт» Роспотребнадзора, Ставрополь, Россия
Представлены результаты экспериментальной оценки эффективности разработанных нами новых питательных сред для выделения и культивирования легионелл на штаммах, выделенных из объектов окружающей среды в городе-курорте Сочи в период подготовки и проведения XXII Олимпийских игр. Плотные питательные среды, изготовленные на основе ферментативного гидролизата желтка куриного яйца и ферментативного гидролизата легкого свиньи с дополнительными стимуляторами, позволили обеспечить возможность учета количества колоний в более ранние сроки исследования и хранения выделенных штаммов более длительное время по сравнению с отечественной коммерческой питательной средой. Ключевые слова: легионеллы, питательные среды.
N.V. Zharinova, E.B. Zhilchenko, L.S.Katunina, O.A. Konyaeva, N.S. Serdyuk, O.N. Gavrilova □ EVALUATION OF CULTURE SUBSTRATE FOR THE ISOLATION AND CULTIVATION OF LEGIONELLA WITH THE USE OF THE STRAINS ISOLATED DURING THE XXII OLYMPIC GAMES-2014 IN SOCHI □ Stavropol Plague Control Research Institute of the Rospotrebnadzor, Stavropol, Russia.
The article presents the results of experimental evaluation of the effectiveness of new culture substrate developed for the isolation and cultivation of Legionella, the strains isolated from environmental objects in the resort city of Sochi before and during XXII Olympic games. Dense nutrient substrate prepared on the basis of enzymatic hydrolysate of chicken egg yolk and enzymatic hydrolysate of the lung of the pig with additional stimulants allowed saving number of colonies in the earlier stages of the study and storage of the isolated strains during long period of time compared with domestic commercial nutrient substrate. Key words: Legionella, nourishing environment.
Спорадические случаи и эпидемические вспышки легионеллеза, ежегодно выявляемые в различных странах мира, обусловлены активным использованием в промышленности и быту систем водоснабжения и охлаждения [5]. В последние годы особое значение приобретает проблема заболевания легионеллезом во время путешествий. Более 30 % спорадических случаев и многочисленные эпидемические вспышки заболеваний происходят в гостиницах, что становится особенно актуально в период проведения массовых мероприятий, связанных с большим притоком людей [1]. Основой профилактики легионеллезной инфекции является проведение исследований уровня контаминации легионеллами потенциально опасных водных объектов (горячее водоснабжение, централизованные системы кондиционирования, бассейнов и т. д.). За 20 дней до открытия XXII Олимпийских игр в Сочи и во время их проведения поводился анализ воды из систем горячего водоснабжения на наличие легионелл. За этот период методом ПЦР возбудитель легионеллеза выявлен в 103 образцах, и только 33 из них подтверждены бактериологическим методом с выделением штаммов Legionella pneumophila.
Важным условием успешного проведения микробиологических исследований являются питательные среды. Легионеллы не растут на обычных питательных средах, что связано с потребностью возбудителя в L-цистеине и растворимом пирофосфате железа. Для выделения и культивирования легионелл используют различные модификации буферного угольно-дрожжевого агара, содержащего L-цистеин и растворимый пирофосфат железа.
В настоящее время за рубежом разработано значительное количество питательных сред для
выделения и культивирования легионелл, но импортные питательные среды и их добавки малодоступны для широкого круга потребителей (бактериологических лабораторий) ввиду дороговизны.
В России производят 2 наименования питательной среды для легионелл: легионеллбакагар и СЭЛ. Рост колоний на этих средах наблюдается не ранее чем через 3—5 суток, максимальное количество видимых колоний вырастает на 8—10 сутки. Сохранность штаммов Legionella pneuno-phila составляет не более двух месяцев.
Несмотря на то, что к настоящему времени разработано значительное количество питательных сред, возбудитель легионеллеза продолжает оставаться трудно культивируемым микроорганизмом, поэтому улучшение качества питательных сред является актуальной проблемой.
Цель исследования - оценка эффективности разработанных нами плотных питательных сред для выделения и культивирования легио-нелл по параметрам возможности учета количества колоний в более ранние сроки исследования и хранения выделенных штаммов более длительное время.
Материалы и методы. В работе были использованы типичные по культурально-морфо-логическим свойствам тест-штаммы L. pneumophila ATCC 33155 Bloomington 2 и L. Pneumophila ATCC 33152 Philadelphia 1 и 33 штамма возбудителя легионеллеза, выделенных из объектов окружающей среды до открытия и во время проведения XXII Олимпийских игр в Сочи (29.01.2014-13.03.2014).
Эффективность двух разработанных нами плотных питательных сред для выращивания ле-гионелл была проверена бактериологическим методом. Контролем служила среда СЭЛ (рН 7,1).
50
ЗНиСО
МАЙ НИЕ (290)
В состав питательных сред входили калий фосфорнокислый 1-замещенный, калий фосфорнокислый 2-замещенный - 3-водный, L-цистеи-на гидрохлорид, активированный уголь, агар микробиологический, дистиллированная вода. В качестве питательной основы первая среда содержала ферментативный гидролизат желтка куриного яйца (ФГЖКЯ) [2], а вторая - ферментативный гидролизат легкого свиньи (ФГЛС) с содержанием аминного азота. В качестве дополнительного стимулятора во вторую среду входил эмбриональный стимулятор роста [3], рН сред находился в диапазон 6,9 ± 0,05.
Культуры штаммов, восстановленные после хранения в лиофилизированном виде, пересевали на чашки Петри со средой СЭЛ и инкубировали при температуре 37 °С в течение 4872 ч [4]. Выросшую культуру бактериологической петлей переносили в пробирку со стерильным 0,01М калий-фосфатным буфером (рН 7,1) и доводили концентрацию микробной взвеси до 10 единиц по стандартному образцу мутности ОСО 42-28-59-85 П, что соответствует 1 • 10 м.к./мл. Полученную суспензию путем десятикратных разведений доводили2до конечного разведения 10- (около 1 • 10 м.к./мл). Взвесь каждого штамма легионелл из конечного разведения засевали по 0,1 мл на три чашки Петри с двумя экспериментальными питательными средами и контрольной СЭЛ, распределяя посевной материал по поверхности среды методом покачивания чашек. Учет результатов проводили визуально через 48-120 ч инкубации посевов при температуре 37 °С.
Для определения длительности хранения штаммов легионелл на твердых питательных средах все штаммы засевали в пробирки со скошенным агаром на экспериментальные среды и на среду СЭЛ (по 12 пробирок каждой среды). Пробирки с посевами перекрывали резиновыми пробками и хранили при температуре +4 °С в течение 12 месяцев. Проверку ростовых качеств питательных сред для хранения на них штаммов L. pneumophila проводили ежемесячно.
Результаты исследования. Использованные в нашей работе штаммы возбудителя ле-гионеллеза, выделенные из объектов окружающей среды до открытия и во время проведения XXII Олимпийских игр в Сочи, по своим культурально-морфологическим и биохимическим свойствам были типичны для вида L. Pneumophila. В мазках они представляли собой гра-мотрицательные палочки, спор и капсулу не образовали. Все штаммы были каталазополо-жительными, оксидазоотрицательными, вызывали гидролиз гиппурата натрия и желатины, не восстанавливали нитраты и не разлагали мочевину. Из 33 штаммов 7 относились к 1-й се-рогруппе, 26 штаммов - 2-14-й серогруппам.
Успех выделения и культивирования штаммов легионелл из клинического материала и из объектов окружающей среды во многом зависит от рН питательных сред, оптимальным для них является рН 6,95 [5]. У разработанных нами сред, независимо от питательной основы и стимуляторов, рН был 6,9 ± 0,05.
В результате изучения ростовых качеств экспериментальных плотных питательных сред на ФГЛС, ФГЖКЯ и контрольной СЭЛ установлено, что после инкубации при 37 °С на
всех засеянных чашках Петри вырастали круг- ^^ лые плоско-выпуклые синевато-серые блестящие колонии диаметром не менее 1,0 мм. При сэ косом освещении колонии приобретали зеленовато-серую окраску и волокнистую структуру. Бактериологическое исследование показало наличие подвижных, мелких грамотрицатель-ных палочек. Следовательно, разработанные среды на ФГЛС, ФГЖКЯ не уступают среде СЭЛ по ростовым качествам и соответствуют требованиям к контролю питательных сред для культивирования и выделения возбудителя ле-гионеллеза по биологическим показателям [4].
Однако на среде СЭЛ формирование колоний наблюдалось через (72 ± 2) ч инкубации, что соответствует требованиям к показателю скорости роста легионеллезного микроба [4], а на экспериментальных средах рост наблюдался через 48 ч, что на 24 ч превысило показатель скорости роста на контрольной среде СЭЛ.
При изучении возможности длительного хранения на разработанных нами на разных ферментативных основах (ФГЛС), (ФГЖКЯ) плотных питательных средах тест-штаммов и штаммов L. pneumophila, выделенных из объектов окружающей среды в городе-курорте Сочи, установлено, что обе экспериментальные среды обеспечивали типичный рост и подвижность всех взятых в опыт штаммов в течение 12 месяцев. На среде СЭЛ легионеллы теряли жизнеспособность через полтора - два месяца.
Таким образом, разработанные нами питательные среды по показателям чувствительности и эффективности соответствовали требованиям МУ [4] и не уступали среде СЭЛ. Проявление культуральных и сохранения морфологических свойств, а также выраженной подвижности свидетельствует о полноценности разработанных нами питательных сред для выделения и культивирования легионелл, выделенных из объектов окружающей среды.
ЛИТЕРАТУРА
1. Ежлова Е.Б. и др. Организация обследования и выявление возбудителя легионеллеза в объектах окружающей среды в период подготовки и проведения XXlI Олимпийских и XI Паралимпийских зимних игр в Сочи / Е.Б. Ежлова, Ю.В. Демина, А.Н. Куличенко [и др.] // Проблемы особо опасных инфекций. 2015. Вып. 2. С. 50-53.
2. Катунина Л.С. и др. Питательная среда плотная для выращивания легионелл / Л.С. Катунина, Н.Д. Темежникова, А.Н. Куличенко [и др.] / Пат. 2460768 RU, МПК С 12N 1/00 d2R 1/00; заявл. 04.07.2011; опубл. 10.09.2012, Бюл. № 25. 9 с.
3. Катунина Л.С. и др. Питательная среда для выращивания легионелл / Л.С. Катунина, Л.Д. Тимченко, Н.Д. Темежни-кова [и др.] / Пат. 2412240 RU, МПК С 12N 1/20 d2R 1/00; заявл. 01.12.2009; опубл. 20.02.2011, Бюл. № 5. 9 с.
4. Контроль диагностических питательных сред по биологическим показателям для возбудителей чумы, холеры, сибирской язвы, туляремии, бруцеллеза, легионеллеза: МУ 3.3.2.2124-06 (утв. Главным государственным санитарным врачом Российской Федерации 17.08.2006). М.: Федеральный центр гигиены и эпидемиологии Роспотребнадзора, 2007. 16с.
5. Тартаковский И.С. и др. Легионеллез: проблемы и перспективы лабораторной диагностики / И.С. Тартаковский, Н.Д. Темежникова, Т.И. Карпова // Проблемы особо опасных инфекций. 2005. Вып. 2. С. 17-23.
Контактная информация:
Жаринова Нина Вадимовна, тел.: +7 (8652) 26-48-19, e-mail: [email protected] Contact information: Zharinova Nina, phone: +7 (8652) 26-48-19,
e-mail: [email protected] ► ♦ -
♦
