CC BY
5В.И. Лукша, Е.В. Воронкова, О.Н. Гукасян, А.П. Ермишин
ОЦЕНКА ПЕРВИЧНЫХ ДИГАПЛОИДОВ S. TUBEROSUM НА НАЛИЧИЕ ГЕНОВ УСТОЙЧИВОСТИ К БОЛЕЗНЯМ И ВРЕДИТЕЛЯМ МЕТОДОМ ПЦР-АНАЛИЗА
ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» Республика Беларусь, 220072, г. Минск, ул. Академическая, 27
Введение
Потери урожая картофеля, вызванные вирусными, бактериальными и грибными заболеваниями, могут достигать 40 и более процентов в процессе вегетации и 20-30% при хранении клубней [1]. Это связано, с одной стороны, с высокой адаптивной способностью многих возбудителей болезней и вредителей и, с другой стороны, недостаточной устойчивостью к ним существующих сортов картофеля.
Селекция сортов картофеля с комплексной устойчивостью к болезням и вредителям сильно затруднена из-за специфических биологических особенностей культуры. Новые сорта выводят путем гибридизации тетраплоидных гетерозигот. Как и у других полиплоидов, при гибридизации сортов картофеля имеет место сложный характер расщепления, что существенно затрудняет отбор желаемых комбинаций генов. Поэтому в настоящее время многие исследователи считают перспективным перевод части селекционного процесса на диплоидный уровень. Основное преимущество отбора на диплоидном уровне по сравнению с традиционной селекцией картофеля - более простое дисомное наследование признаков. Требуется меньший объем гибридных популяций для выделения сложных рекомбинантов, отвечающих запросам селекции, аккумуляция желаемых и элиминация нежелательных генов происходит на диплоидном уровне быстрее, чем на тетраплоидном. Особенно возрастает значимость и результативность отбора на диплоидном уровне при использовании современных методов маркер-сопутствующей селекции, которые основаны на выявлении молекулярных ДНК-маркеров, в частности, маркеров к главным ^)-генам устойчивости к болезням и вредителям [2, 3].
Важнейшее преимущество использования молекулярных маркеров состоит в том, что оно позволяет проводить оценку селекционного материала по генотипу. При необходимости идентификации в организме того или иного гена такая оценка является более точной, чем оценка по фенотипу. Во многих случаях она менее трудоемка и оказывается более дешевой, ее можно применять на ранних этапах селекционного процесса и в любое время года. В настоящее время создан ряд ДНК-маркеров, сцепленных с селекционно-ценными генами картофеля, прежде всего, с генами устойчивости к болезням и вредителям, применение которых позволяет с высокой точностью идентифицировать генотипы-носители соответствующих генов.
Маркер-сопутствующая селекция картофеля на диплоидном уровне в Беларуси ранее не проводилась. В связи с этим стоит задача создания исходного материала для такой селекции. Необходимо, прежде всего, выбрать сорта картофеля различного происхождения, которые являются носителями нескольких генов устойчивости к болезням и вредителям, получить на их основе большое количество дигаплоидов и выделить среди них генотипы с максимально большим количеством генов, имеющихся у исходных сортов. В лаборатории генетики картофеля в 2008-2009 гг. было получено более восьмидесяти первичных ди-гаплоидов сортов картофеля, отобранных по комплексу селекционно-ценных признаков [4].
Целью настоящей работы была оценка первичных дигаплоидов и исходных сортов на наличие ДНК-маркеров основных генов устойчивости к болезням и вредителям картофеля и отбор среди них перспективных форм для маркер-сопутствующей селекции на диплоидном уровне.
Материалы и методы
В качестве исходного материала использовали сорта картофеля Блакит, Дубрава, Лилея, Ула-дар, Lyra, Assia, Carlita, Heidrun, Pirola, Saphir, межвидовые гибриды картофеля (l/4 Koll Podg) и дигаплоиды, полученные на их основе. Клубни сортов картофеля были получены из РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству». Межвидовые гибриды были любезно предоставлены профессором А.А. Подгаецким (г. Сумы, Украина). Первичные дигаплоиды (ПД) на основе этих сортов были получены в 2008-2009 гг. в лаборатории генетики картофеля ГНУ «Институт генетики и цитологии НАН Беларуси» с помощью гаплопродюсера S. phureja IvP 35 [4].
Сорта картофеля для исследований были выбраны на основании анализа данных, представленных в каталогах [5], и по результатам оценки по девяти маркерам к доминантным аллелям генов устойчивости к цистообразующей нематоде Globodera rostochiensis, вирусам картофеля PVY, PVX, PLRV, раку картофеля и фитофторо-зу [6]. Доминантный аллель гена H1 устойчивости к Globodera rostochiensis, происходящий от S. andigenum, выявляли с помощью косегрегант-ного к нему SCAR-маркера CPll3-5',2/CPll3-3'2 [7]. Для идентификации второго гена устойчивости к цистообразующей нематоде Gro 1-4, предположительно интрогрессированного от S. spegazzinii, использовали маркер Gro1-4 [8]. Для идентификации гена устойчивости к Y вирусу картофеля Ryag, интрогрессированному в культурный картофель от S. andigenum, использовали SCAR-маркер RYSC3 [9]. Для выявления гена иммунности к PVY, происходящего от S. stoloniferum, Ry-fsto использовали CAPS-маркер GPl22 [l0, ll]. Детекцию гена устойчивости к X вирусу картофеля Rx1dg, интрогрессированному в культурный картофель от S. andigenum, производили с помощью CAPS маркера CP60 [8, l2]. Для выявления
QTL генов устойчивости к вирусу скручивания листьев PLRV1 и PLRV4 использованы SCAR-маркер NL27 и псевдо-SCAR-MapKep UBS864R [13]. Доминантный аллель гена Sen1 устойчивости к раку картофеля диагностировали с помощью SCAR-маркера NL25 [8]. Для выявления гена вертикальной устойчивости к фитофторозу R1dms, от S. demissum использовали SCAR-маркер R1dm, [14].
Анализ сортов картофеля и первичных дигаплоидов на наличие у них ДНК-маркеров к генам устойчивости к болезням и вредителям проводили в соответствии с методическими рекомендациями [6]. Выделение и очистку ДНК исследуемых образцов проводили с помощью наборов для выделения и очистки ДНК, разработанных фирмой Fermentas (Литва) «DNA purification Kit» в соответствии с рекомендациями производителя и рядом модификаций, разработанных нами специально для выделения ДНК из растительных тканей картофеля [10]. Концентрацию и степень очистки ДНК проверяли на спектрофотометре и нанесением на агарозный гель. Для того, чтобы исключить случаи отсутствия амплификации из-за низкого качества препаратов, проводили предварительный анализ ДНК отдельных образцов на способность амплифицироваться с ISSR-праймером UBC-857 [10]. ПЦР осуществляли на автоматическом программируемом термоци-клере GenAmp System 2700 фирмы «PE Applied Biosystems» (США). Длину амплифицирован-ных фрагментов ДНК определяли визуально при помощи стандартного маркера длин фрагментов ДНК 100 bp + 1.5 Kb + 3 Kb (М27) («DIALAT Ltd»). Для горизонтального электрофореза в 2%-ном агарозном геле с добавлением бромистого этидия брали 7-8 мкл реакционной смеси и 2 мкл 10х бромфенолового-синего. Электрофорез продуктов амплификации проводили в 1* ТАЕ-буфере в течение 1,5-2 ч при напряжении в 80 V и силе тока 6 mA.
Результаты и обсуждение
Как видно из табл. 1, выбранные для полу- Lyra и Saphir) несут сразу два гена устой-
чения дигаплоидов сорта картофеля являются чивости к этому опасному вредителю (HI
носителями комплекса ценных генов устой- и Gro 1-4). Сорта обладают устойчивостью
чивости к болезням и вредителям. Все они к раку (исключение - сорт Lyra) и к вирусу
резистентны к цистообразующей нематоде скручивания листьев, а также имеют отдель-
благодаря наличию гена H1 от S. andigenum, ные маркеры генов устойчивости к PVY, PVX
а некоторые из сортов (Лилея, Assia, Heidrun, и фитофторозу.
Таблица 1
Наличие ПЦР-маркеров генов устойчивости к болезням и вредителям у первичных дигаплоидов и исходных сортов картофеля*
Исходный сорт и дигаплоиды H1 adg Gro 1-4 spg Ry adg Ry sto Rx adg PLRV 1 PLRV 4 Sen1 R1 dms
на его основе CP113 Gro 1-4 ADG2 GP122 CP60 NL27 UBS 864R Nl 25 R1 dms
Блакит + 0 0 0 0 + + + 0
IGC 08/6.1 + 0 0 0 0 + + + 0
IGC 08/6.2 + 0 0 0 0 + + + 0
IGC 08/6.4 + 0 0 0 0 0 + + 0
Дубрава + 0 + 0 + + + + -
IGC 07/9.1 + 0 + 0 0 + + + 0
IGC 07/9.2 + 0 0 0 0 + 0 + 0
IGC 07/9.22 + 0 + 0 0 + + 0 +
IGC 07/9.33 0 0 0 0 0 + 0 0 0
IGC 08/5.11 + 0 + 0 0 + + 0 0
IGC 09/6.15 + 0 0 0 0 0 + 0 0
IGC 09/6.19 0 0 0 0 0 0 + 0 0
Лилея + + - - + + + + +
IGC 09/8.1 + 0 0 0 0 + + 0 +
IGC 09/8.3 + + 0 0 0 + + + 0
IGC 09/8.24 + + 0 0 + + + 0 +
Уладар + - - - - + + + +
IGC 09/10.2 + 0 0 0 0 + + 0 +
Assia + + 0 0 + + + + 0
IGC 08/7.1 + 0 0 0 + + + 0 0
IGC 08/7.6 0 + 0 0 + 0 + 0 0
IGC 08/7.7 + + 0 0 0 + + + 0
IGC 08/7.8 + 0 0 0 + + + 0 0
IGC 08/7.12 0 + 0 0 0 + + + 0
IGC 08/7.25 + 0 0 0 0 + + + 0
IGC 08/7.31 + + 0 0 0 + + 0 0
IGC 08/7.37 + 0 0 0 + 0 + 0 0
Carlita + 0 + 0 + + + + +
IGC 07/7.1 + 0 + 0 0 + + 0 0
IGC 08/2.4 0 0 0 0 0 0 + 0 0
IGC 08/2.5 + 0 0 0 0 0 + 0 0
IGC 08/2.7 0 0 0 0 0 0 0 0 +
IGC 09/1.5 + 0 + 0 0 + + 0 +
Heidrun + + 0 + 0 + + + +
IGC 08/3.8 0 0 0 0 0 0 0 0 0
IGC 08/3.9 + 0 0 0 0 0 + 0 0
IGC 08/3.10 0 0 0 0 0 0 0 + 0
IGC 08/3.13 + 0 0 0 0 0 0 0 0
IGC 08/3.14 0 0 0 0 0 0 0 0 0
IGC 08/3.15 + 0 0 0 0 0 + 0 +
IGC 08/3.16 + 0 0 0 0 + + 0 0
IGC 08/3.17 + 0 0 0 0 0 + 0 0
IGC 08/3.22 0 0 0 0 0 0 0 0 0
IGC 08/3.23 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Lyra + + + - + + + 0 +
IGC 09/9.3 + 0 0 0 0 + + 0 +
IGC 09/9.4 + + 0 0 0 + + 0 +
IGC 09/9.5 + + 0 0 0 + + 0 +
IGC 09/9.6 + + 0 0 + + + 0 +
IGC 09/9.10 + + + 0 + + + 0 +
IGC 09/9.11 + + + 0 + + + 0 +
IGC 09/9.12 + 0 0 0 0 + + 0 +
Продолжеиие табл. 1
Исходный сорт и дигаплоиды H1 adg Gro 1-4 sPg Ry adg Ry sto Rx adg PLRV 1 PLRV 4 Senl R1 dms
на его основе CP113 Gro 1-4 ADG2 GP122 CP60 NL27 UBS 864R Nl 25 R1 dms
Piróla + 0 + 0 0 + + + 0
IGC 07/6.1 0 0 + 0 0 0 + 0 0
IGC 08/4.1 + 0 0 0 0 0 + 0 0
IGC 08/4.2 0 0 + 0 0 0 + + 0
IGC 08/4.4 0 0 0 0 0 0 0 0 0
Saphir + + + + - + + + +
IGC 09/2.1 + 0 0 0 0 + + + +
IGC 09/2.4 + 0 0 0 0 + + + +
IGC 09/2.7 + + + + 0 + + 0 +
IGC 09/2 8 0 0 0 0 0 + + 0 +
1/4 Koll Podg + + + + + + +
IGC 09/7.3 + 0 0 + + + + + +
IGC 09/7.8 + 0 0 0 0 0 + 0 0
IGC 09/7.11 + 0 0 0 0 0 + 0 0
* - «+» - маркер выявлен, «0» - маркер отсутствует, «-» - анализ не проводился.
При переходе на диплоидный уровень в результате расщепления, имеющего место при получении дигаплоидов, часть ПЦР-маркеров теряется. Некоторые маркеры, например, Gro 1-4 в потомстве сорта Heidrun или NL 25 в потомстве сорта Carlita, CP60 в потомстве сорта Carlita у соответствующих дигаплои-дов не представлены. Очевидно, это связано с тем, что в исходных сортах названные гены находятся в симплексном состоянии. Тем не менее, нам удалось получить дигаплоиды, несущие маркеры к таким генам. В частности, маркер к ценному гену устойчивости к цисто-образующей нематоде Gro 1-4 выявлен у дигаплоидов сортов Лилея, Assia, Lyra и Saphir. Дигаплоиды с маркером CP60 к гену устойчивости к PVX были получены у сортов Лилея, Assia, Lyra, а маркер GP122 гена устойчивости к PVY был выявлен у дигаплоидов сорта Heidrun и межвидовых гибридов. Носители маркера NL 25 устойчивости к раку картофеля встречались среди дигаплоидов всех сортов, кроме Carlita и Lyra. Согласно данным каталога Европейских сортов картофеля [15], сорт немецкого происхождения Lyra обладает высокой полевой устойчивостью к раку картофеля, которую определяли как в полевых тестах, так и лабораторными методами. Можно сделать предположение, что устойчивость к расе 1 рака картофеля этого сорта определяется другими генами.
В то же время большое количество первичных дигаплоидов получили от родительских сортов QTL устойчивости к PLRV (PLRV1 и PLRV4) и ген Н1 устойчивости к цистообразу-ющей нематоде, что позволяет говорить о том, что эти гены находятся в исходных сортах в мультиплексном состоянии (дуплекс и выше). Это же, по-видимому, относится к гену устойчивости к раку у сорта Блакит: маркер N1 25 был выявлен у всех изученных дигаплоидов данного сорта.
Из табл. 1 видно, что клоны первичных дигаплоидов имеют два и более ДНК-маркера к селекционно-ценным генам. Особенно насыщены маркерами популяции первичных ди-гаплоидов, полученных на основе немецких сортов Assia, Lyra, Saphir и белорусского сорта Дубрава. В частности, клоны IGC 09/9.10 и IGC 09/9.11 сорта Lyra и клон IGC 09/2.7 сорта Saphir несут семь таких генов. Клоны IGC 09/9.4, IGC 09/9.5, IGC 09/9.6 сорта Lyra и IGC 09/2.1 и IGC 09/2.4 сорта Saphir несут 5-6 генов устойчивости. Среди дигаплоидов других сортов также встречались генотипы с большим количеством маркеров. По семь генов устойчивости удалось обнаружить у дигаплоида IGC 09/7.3 (1/4 Koll Podg), по 5-6 генов устойчивости было у дигаплои-дов IGC 07/9.1, IGC 07/9.22 (сорт Дубрава ), IGC 09/1.5 (сорт Carlita), IGC 09/8.3, IGC 09/8.24 (сорт Лилея).
Интересны дигаплоиды, несущие по два гена устойчивости к нематоде, происходящие от разных источников, а также два основных QTL устойчивости к PLRV. Это делает их перспективными при одновременной селекции на устойчивость к нематоде и L-вирусу картофеля. Это клоны IGC 08/7.7, IGC 08/7.31 (сорт Assia), IGC 09/2.7 (сорт Saphir), IGC 09/8.3, IGC 09/8.24 (сорт Лилея), IGC 09/9.10, IGC 09/9.11, IGC 09/9.4, IGC 09/9.5, IGC 09/9.6 (сорт Lyra). Дигаплоид сорта Saphir 09/2.7, а также клон 09/7.3 (1/4 Koll Podg) имеют особую ценность, поскольку из всех изученных дигаплоидов только у них обнаружен маркер GP122 гена устойчивости к PVY от S. stoloniferum. У последнего клона также одновременно присутствует маркер другого гена устойчивости к этому вирусу, происходящий от S. andigenum.
Отдельный интерес представляют клоны ПД, несущие гены устойчивости к раку картофеля. В частности, устойчивыми являются все сорта белорусской селекции, что не удивительно, так как устойчивость к карантинному заболеванию раком картофеля является одним из обязательных условий при создании современных сортов в нашей стране. ПЦР-маркер NL25 является показателем наличия доминантного аллеля гена Senl. К сожалению, наличие этого аллеля у исходных сортов не гарантирует его присутствие у первичных дигаплоидов, получаемых на основе этих сортов. Например, ни один из
полученных нами первичных дигаплоидов сорта Carlita не унаследовал доминантный аллель гена устойчивости. Судя по низкой частоте появления в диплоидном потомстве тетраплоид-ных сортов доминантного аллеля гена Sen1, в самих сортах он, по-видимому, чаще присутствует в симплексном состоянии.
В целом среди 55 первичных дигаплои-дов, полученных в 2008 и 2009 гг. и прошедших ПЦР-анализ в 2010 и 2011 гг., удалось выделить 51 генотип, несущий те или иные маркеры генов устойчивости к болезням, в том числе 30 клонов, несущих 4 и более гена устойчивости. Все 9 ПЦР маркеров, выявленные в исходных сортах, были обнаружены и у их дигаплоидов. Это означает, что селекцию на диплоидном уровне можно проводить по всем проанализированным генам. Этот результат достигнут во многом благодаря тому, что перед получением дигаплоидов картофеля была проведена предварительная работа по изучению характеристик сортов в каталогах, а также их генотипическая оценка на наличие нескольких генов устойчивости к болезням и вредителям. Если среди первичных дигаплоидов, полученных нами ранее, в 1997-1998 гг., только отдельные образцы несли более 2 маркеров к генам устойчивости, а у многих такие маркеры отсутствовали вовсе, то среди дига-плоидов, полученных в 2008 и 2009 гг., доля генотипов, несущих несколько ДНК маркеров, оказалась гораздо выше.
Заключение
Оценка первичных дигаплоидов по ДНК-маркерам к 9 генам устойчивости к основным болезням и вредителям картофеля позволила выделить образцы, несущие одновременно до 7 генов устойчивости. Предварительный ПЦР-анализ исходных сортов на наличие маркеров позволяет существенно повысить насы-
щенность соответствующих первичных дига-плоидов доминантными аллелями R-генов. Отобран ряд дигаплоидов, представляющих интерес для использования в качестве исходного материала для маркер-сопутствующей селекции на комплексную устойчивость к болезням и вредителям.
Список использов
1. Иванюк, В.Г. Защита картофеля от болезней, вредителей и сорняков / В.Г. Иванюк, С.А. Банадысев, Г.К. Журомский. - Минск: Белпринт, 2005. - 696 с.
2. Gebhardt, Ch. Organization of genes controlling disease resistance in the potato genome /
нных источников
Ch. Gebhardt, J.P.T. Valkonen // Annu. Rev. Phytopathol. - 2001. - Vol. 39. - P. 79-102.
3. Barone, A. Molecular marker-assisted selection for potato breeding / A. Barone // American J. Potato Res. - 2004. - Vol. 81, № 2. - P. 111-117.
4. Получение и отбор дигаплоидов S. tuberosum, перспективных для маркер-сопутствующей селекции на комплексную устойчивость к болезням и вредителям / Е.В. Воронкова [и др.] // Картофелеводство. -Минск, 2011. - Т. 19 (в печати).
5. Сорта картофеля: каталог / Н.Н. Гончарова [и др.] // РУП «Научно-практический центр НАН Беларуси по картофелеводству и плодоовощеводству». - Минск, 2007. - 96 с.
6. Ермишин, А.П. Оценка исходного материала картофеля для селекции на устойчивость к болезням и вредителям с помощью специфических ПЦР-маркеров: методические рекомендации / А.П. Ермишин [и др.]. ГНУ Институт генетики и цитологии НАН Беларуси. - Минск: Экономика и право, 2010. - 60 с.
7. Niewohner, J. Development of PCR assays diagnostic for RFLP marker to the root cyst nematode Globodera rostochiensis in potato / J. Niewohner, F. Salamini., C. Gebhardt // Molecular Breeding. - 1995. - Vol. 1. - P. 65-78.
8. Marker-assisted combination of major genes for pathogen resistance in potato / C. Gebhardt [et al.] // Theor. Appl. Genet. -2006. - Vol. 112. - P. 1458-1464.
9. Wenzel, G. Breeding for nematode and virus resistance in potato via anоther culture / G. Wenzel, H. Uhrig // Theor. Appl. Genet. -1981. - Vol. 59. - P. 333-340.
10. Ry-fsto gene from Solanum stoloniferum for extreme resistant to Potato virus Y maps to
potato chromosome XII and is diagnosed by PCR marker GP122718 in PVY resistant potato cultivars / B. Flis [et al.] // Molecular Breeding. -2005. - Vol. 15, №1. - P. 95-101.
11. Лисовская, В.М. Оценка интрогрессии генов аллотетраплоидных видов картофеля в геном Solanum tuberosum с помощью произвольных праймеров / В.М. Лисовская // Молодежь в науке-2006: Материалы международной конференции // Вести НАН Беларуси, сер. биол. наук. - 2006. - №5. - С. 119-123.
12. Bendahmane A. High-resolution genetical and physical mapping of the Rx gene for extreme resistance to potato virus X in tetraploid potato / A. Bendahmane, K. Kanyuka, D.C. Baulcombe // Theor. Appl. Genet. - 1997. - Vol. 95. - P. 153-162.
13. Two allelic or tightly linked genetic factors at the PLRV4 locus on potato chromosome XI control resistance to potato leafroll virus accumulation / W. Marczewski [et al.] // Theor. Appl. Genet. -2004. - Vol. 109, №8. - P. 1604-1609.
14. Tagging quantitative trait loci for maturity-corrected late blight resistance in tetraploid potato with PCR-based candidate gene markers / C.A. Bormann [et al.] // Mol. Plant Microbe Interaction (MPMI). - 2004. - Vol. 17, No.10 -P. 1126-1138.
15. Международная Европейская база данных по картофелю // Европейская ассоциаци-ация исследователей по картофелю (EAPR) [Электронный ресурс]. - 2011. - Режим доступа: http:// www.europotato.org. - Дата доступа: 10.11.2011.
Дата поступления статьи 25 ноября 2011 г.
