CC BY
7УДК 631.575.222.72: 635.21
Е.В. Воронкова, В.И. Лукша, О.Н. Гукасян, Ю.В. Полюхович, В.М. жарич, А.П. Ермишин
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ МИТОТИЧЕСКОЙ ПОЛИПЛОИДИЗАЦИИ IN VITRO ДЛЯ СОЗДАНИЯ МУЛЬТИПЛЕКСНЫХ РОДИТЕЛЬСКИХ ЛИНИЙ
КАРТОФЕЛЯ
Институт генетики и цитологии НАН Беларуси 220072, Республика Беларусь, г. Минск, ул. Академическая, 27; e-mail: E.Voronkova@igc.by
В результате колхицинирования in vitro диплоидных клонов картофеля, отобранных по наличию комплекса генов устойчивости к болезням и вредителям, был получен ряд митотически удвоенных клонов. Несмотря на цитогенетическую нестабильность и пониженный уровень фертильности, удалось получить половое потомство некоторых из них в скрещиваниях с тетраплоидными сортами. Характер наследования ДНК-маркеров генов устойчивости к нематоде у гибридов удвоенного клона IGC 08/28.39-С14/6 с нуллиплексным по этим генам сортом Katahdin указывает на дуплексное состояние анализируемых генов. Это дает основание рассматривать данный клон в качестве мультиплексной родительской линии, перспективной для селекции сортов картофеля с комплексной устойчивостью к болезням и вредителям.
Ключевые слова: картофель, дигаплоиды, митотическая полиплоидизация, мультиплексные линии, гены устойчивости.
Введение
На борьбу с болезнями и вредителями картофеля агротехническими методами в мире ежегодно тратятся миллиарды долларов США. Однако эти методы не всегда оказываются достаточно эффективными, и, как правило, связаны с существенной нагрузкой на окружающую среду. Считается, что наиболее экономически эффективным методом борьбы с болезнями и вредителями картофеля является выращивание сортов, обладающих генетически детерминированной устойчивостью к комплексу патогенов [1, 2 и др.]. Однако сортов картофеля с комплексной устойчивостью к болезням и вредителям сравнительно немного, так как селекция этой культуры сопряжена со значительными трудностями. Новые сорта отбирают среди гибридов от скрещивания тетраплоидных гетерозигот. Поэтому для гибридных популяций характерны широкая вариация признаков и сложный характер расщепления. Это существенно затрудняет отбор генотипов с желаемой комбинацией генов хозяйственно-ценных признаков, делает необходимым получение и испытание больших популяций гибридных сеянцев для достижения положительного результата.
Многие признаки устойчивости к патогенам у картофеля определяются действием доминантных аллелей отдельных генов. Их эффект может проявляться в симплексном состоянии (Аааа). При скрещивании устойчивого симплекса с неустойчивой формой (нулли-плексом - аааа) в гибридном потомстве доля устойчивых генотипов составит 50% (расщепление 1:1). В случае использования в таких скрещиваниях дуплекса (ААаа) доля устойчивых форм будет составлять 5/6 (расщепление 5:1). В потомстве триплекса (Аааа) или квадруплекса (АААА) расщепление по устойчивости к патогену отсутствует. В связи с этим, в современной селекции картофеля перспективным считается создание специальных родительских линий с комплексом генов устойчивости к болезням и вредителям, у которых соответствующие гены представлены несколькими доминантными аллелями (мультиплексов) [3, 4]. Использование таких линий в скрещиваниях позволяет получать гибридные популяции, в которых генотипы, несущие гены устойчивости, встречаются с более высокой частотой, чем при скрещивании симплексных форм.
Создание мультиплексных родительских линий на тетраплоидном уровне, учитывая генетические особенности культурного кар-
тофеля, - весьма сложный процесс. Частота выщепления дуплексов в потомстве от скрещивания двух симплексных форм (каких большинство среди сортов картофеля) составляет лишь 25%, вероятность появления дуплексов по нескольким генам намного ниже [5]. В связи с этим, для целенаправленной селекции родительских линий, мультиплексных по комплексу генов устойчивости, большие перспективы имеет применение отбора на диплоидном уровне. На этом уровне благодаря более простому, чем на тетра-плоидном уровне, наследованию признаков проще создавать линии с комплексом генов устойчивости к патогенам. Митотическая полиплоидизация, связанная с дупликацией генетического материала растений, позволяет получать дуплексные по комплексу генов формы на основе гетерозиготных по этим генам дигаплоидов. Если гены устойчивости у дигаплоидов в гомозиготном состоянии, у их тетраплоидных производных доминантные аллели будут представлены в виде квадруплексов, которые отобрать с помощью селекции на тетраплоидном уровне практически невозможно. Ускорить и упростить процесс создания мультиплексных линий по нескольким генам устойчивости позволяет использование ДНК-маркеров.
Митотическая полиплоидизация используется в селекции картофеля с середины XX-го века. Впервые она была предложена L.A. Dionne [6-8] и выполнялась методом колхицинирова-ния побегов или клубневых проростков с последующей прививкой колхицинированных побегов на укорененные растения. В первых экспериментах по митотическому удвоению хромосом различных культур растений, в том числе картофеля, обработке полиплодизирую-щими агентами подвергали в основном почки растущих растений, прорастающие семена. В настоящее время большинство исследователей отдает предпочтение обработке меристем растений, выращиваемых in vitro. Наиболее часто используемым полиплоидизирующим агентом остается колхицин [9]. По-видимому, одной из причин такого предпочтения агента является его пригодность и технологичность для использования в культуре in vitro благодаря сохранению активности после стерилизации автоклавированием [10].
В настоящей статье представлены результаты исследований, имеющих целью создание мультиплексных родительских линий картофеля с помощью митотического удвоения хромосом у выращиваемых in vitro растений диплоидных клонов, отобранных по комплексу ДНК-маркеров генов устойчивости к болезням и вредителям.
Материалы и методы
В качестве исходного материала для митотического удвоения хромосом использовали выращенные в асептических условиях растения первичных дигаплоидов сортов Lyra (IGC 09/9.10, IGC 09/9.11), Saphir (IGC09/2.4, IGC 09/2.8), Ли-лея (IGC09/8.24) и вторичные дигаплоиды IGC 08/29.39, IGC 08/29.40, представляющие собой второе поколение беккросса (BC2) диплоидных межвидовых гибридов, полученных при опылении высокофертильными дигаплоидами Solanum tuberosum аллотетраплоидного дикого вида картофеля S. stoloniferum. Эти образцы были отобраны на основании оценки продуктивности, признаков культурного картофеля и наличия комплекса ДНК-маркеров генов устойчивости к болезням и вредителям. У каждого из отобранных генотипов было представлено не менее трех маркеров, наибольшее количество (6) выявлено у первичных дигаплоидов IGC 09/9.10, IGC09/8.24 и вторичных дигаплоидов IGC 08/29.39 и IGC 08/29.40. Вторичные дига-плоиды также имели, по данным многолетних испытаний, высокую полевую устойчивость к фитофторозу (8-9 баллов), которая, как показали данные ПЦР-теста, по-видимому, определяется наличием генов-гомологов Rpi-blb1, Rpi-blb2 и Rpi-blb3 [11].
Для митотического удвоения хромосом использовали пробирочные растения картофеля, выращиваемые на стандартной агаризованной среде Мурасиге-Скуга (МС) с добавлением 1 мг/л индолил-масляной кислоты (ИМК) и 70 мг/л ретарданта роста растений хлорхолин-хлорида [12], что способствовало формированию растений с укороченными междоузлиями и мощной корневой системой. Это позволило, с одной стороны, повысить жизнеспособность растений при неоднократном длительном воздействии колхицина и, с другой стороны, существенно сэкономить рабочий раствор поли-плоидизирующего агента. Обработку растений проводили, заливая стерильный 0,025%-ный
водный раствор колхицина в пробирки до полного покрытия экспериментальных растений. Экспозиция составляла 72 ч при трехкратной замене рабочего раствора. Перед обработкой колхицином для стимуляции и синхронизации деления клеток пазушных почек применяли прижигание верхушек пробирочных растений горячим инструментом (снятие апикального доминирования) и трехкратное попеременное выдерживание растений (по 12 ч) на свету при комнатной температуре и в темноте при 4 °C. Обрабатывали от 20 до 72 пробирочных растений диплоидных линий. Обработанные колхицином растения отмывали от полиплои-дизирующего агента несколькими сменами дистиллированной автоклавированной воды, затем черенковали по количеству живых пазушных почек (3-4 на растение). После 1-2 циклов размножения in vitro растения высаживали в грунт. Укоренившиеся жизнеспособные клоны высаживали в горшочки с торфогрунтом «Двина» (1 л) и выращивали с применением обычной агротехники [12]. Предварительную оценку их плоидности осуществляли методом подсчета числа хлоропластов в паре замыкающих клеток устьиц нижнего эпидермиса листьев. Эпидермис со свежесобранных листьев из среднего яруса куста фиксировали в ледяной уксусной кислоте, затем окрашивали 5%-ным спиртовым раствором йода [13]. Учитывали от 30 (при выравненной плоидности клеток) до 50 (при наличии клеток разного уровня плоидности) пар клеток. Тетраплоидными считали клетки с числом хлоропластов (в паре) более 20. Растения картофеля, в паре замыкающих клеток устьиц которых содержится 12-14 хлоропластов, считаются диплоидными, а с числом хлоропластов 18 и более - три- и тетраплоидными [14, 15].
Для отбора полиплоидных форм также применяли оценку скрещиваемости с тетрапло-идными тестерами. В качестве материнских форм использовали растения клубневого поколения отобранных по числу хлоропластов клонов. Для опыления полиплоидных производных вторичных дигаплоидов IGC 08/29.39 и IGC 08/29.40 использовали пыльцу сортов Katahdin и Чарауник. В скрещиваниях с производными первичных дигаплоидов использовали пыльцу сортов Katahdin, Carlita, Gala и Манифест и смеси пыльцы нескольких сортов картофеля (приведены в примечании к табл. 3).
Для подтверждения дупликации генов H1 и Gro1-4 у IGC 08/29.39 в результате удвоения хромосом изучали расщепление по наличию ДНК-маркеров соответствующих генов в потомстве от скрещивания этого клона с сортом-тестером Katahdin, который является нуллиплексом по этим генам [16]. ПЦР-анализ осуществляли согласно методическим рекомендациям [17], тест проводили в соответствии с методикой, предложенной [16, 18].
Результаты и обсуждение
Выживаемость клонов картофеля после обработки колхицином
Для получения удвоенных клонов рекомендуют различные концентрации раствора колхицина. Они варьируют от 0,01 до 0,5% в зависимости от обрабатываемого материала (сухие или прорастающие семена, вегетативные органы размножения, например, клубни или луковицы, черенки, растения, выращиваемые in vitro) и вида растений [6-10, 15, 19-21 и др.]. Мы использовали концентрацию колхицина и экспозицию, рекомендованные L.A. Dionne [6-8] для клубневых проростков картофеля. Из-за крайне угнетенного состояния корневой системы после обработки колхицином, автор метода предлагал прививать их на необработанные укорененные растения. Обработка колхицином пробирочных растений позволяет защитить корневую систему от неблагоприятного воздействия мутагена, так как она окружена плотной агаризованной средой. Тем не менее, в условиях проведенного эксперимента (72-часовая экспозиция с использованием 0,025%-ного раствора колхицина) длительное пребывание в растворе колхицина приводило к потере части растений in vitro. Они теряли тургор, обесцвечивались и погибали после окончания действия агента. Средняя выживаемость исходных растений составила около 56% и была примерно одинакова для разных исходных генотипов. После черенкования на свежую питательную среду подвергнутые обработке колхицином растения проявили разный уровень выживаемости в зависимости от исходного генотипа (табл. 1). Нам не удалось получить ни одного жизнеспособного укоренившегося растения у одного из дигаплоидов сорта Lyra (IGC 09/9.11) и дигаплоида сорта Лилея IGC 09/8.24. Тем не менее, после укоренения на питательной среде удалось вырастить до высадки в грунт более половины (54,1%) колхицинированных клонов.
Таблица 1
Эффективность митотического удвоения хромосом у диплоидных клонов картофеля
Диплоидные клоны Количество обработанных колхицином растений, шт. Количество растений, выживших до посадки в грунт Количество клонов, отобранных по наличию 4х-клеток (в т.ч. содержащих исключительно 4х-клетки)
Шт. % Шт. %
IGC 08/29.39 72 28 38,9 6 (0) 8,3 (0)
IGC 08/29.40 60 38 63,3 4 (0) 6,7 (0)
IGC0 9/9.10 58 48 82,5 36 (9) 62,1 (15,5)
IGC 09/9.11 22 0 0 - -
IGC 09/2.4 32 30 93,8 7 (2) 21,9 (6,3)
IGC 09/2.8 40 28 70,0 3 (0) 7,5 (0)
IGC 09/8.24 34 0 0 - -
Всего: 318 172 54,1 56 (11) 17,6 (3,5)
Более высокую, по сравнению с первичными дигаплоидами, жизнеспособность проявили клоны межвидовых гибридов (соответственно 49,3 и 51,1%). Однако незначительная выборка генотипов и присутствие среди оставшихся первичных дигаплоидов клонов с максимальным числом выживших растений не дают оснований для утверждения, что высокий уровень гетерозиготности, характерный для межвидовых гибридов, является более предпочтительным при отборе генотипов для обработки колхицином по сравнению с инбридирован-ными первичными дигаплоидами картофеля.
Плоидность вегетативного потомства клонов картофеля, подвергнутых обработке колхицином
Наиболее простым и эффективным экспресс-методом определения плоидности растений картофеля является подсчет количества хлоро-пластов в паре замыкающих клеток устьиц [14, 15]. Он не настолько точен, как прямой подсчет числа хромосом в клетках меристем или при изучении мейоза материнских клеток пыльцы, однако незаменим при анализе больших выборок образцов. Кроме того, он может быть применен на ранних стадиях развития растений, обеспечивает первичный отбор генотипов с преобладанием полиплоидных клеток среди химерных по плоидности растений [21] (мозаичная, иначе секториальная, химерность является цитогенетической особенностью растений, подвергнутых обработке колхицином [22]). В силу того, что основная цель удвоения числа
хромосом у диплоидных клонов - получение тетраплоидов, способных к гибридизации с тетраплоидными сортами или селекционными клонами, у отобранных по числу хлоропластов растений необходимо произвести подсчет числа хромосом и оценить их скрещиваемость с тетраплоидными образцами картофеля. Лучше это делать для клубневых поколений колхици-нированных клонов, так как для изначально химерных по плоидности растений характерна стабилизация уровня плоидности у вегетативного потомства [23, 24].
Основываясь на данной стратегии оценки плоидности, мы провели цитологическое изучение высаженных в грунт образцов и сделали первичный отбор растений с клетками тетраплоидного уровня (табл. 1). Данные о представленности клеток разного уровня плоидности у клонов, отобранных для гибридизации с тетраплоидными тестерами, представлены в табл. 2.
Как видно из табл. 1, среди высаженных в грунт растений колхицинированных клонов преобладают миксоплоидные (с клетками разного уровня плоидности 2х-4х). При этом для колхицинированных межвидовых гибридов характерна меньшая частота встречаемости клеток тетраплоидного уровня, чем для первичных дигаплоидов (табл. 2). Среди межвидовых гибридов нам не удалось выделить ни одного клона, у которого бы клетки тетра-плоидного уровня были преобладающими. Исключительно 4х-клетки или 4х и переходного 2х-4х уровня обнаружены у девяти кло-
Таблица 2
Представленность клеток разного уровня плоидности в колхицинированных клонах, отобранных для гибридизации с тетраплоидным тестером
Колхицинированные клоны Количество клеток определенного уровня плоидности, шт. Количество учтенных клеток, шт.
2х 2х-4х 4 х
IGC08/29.39-C14/6 39 11 0 50
IGC08/29.39- С14/25 29 7 7 43
IGC08/29.40-C14/35 29 9 7 45
IGC09/2.8-C15/6 3 11 34 48
IGC09/2.4-C15/7 0 8 40 48
IGC09/2.4-C15/11 0 0 37 37
IGC09/9.10-C15/2 3 12 31 46
IGC09/9.10-C15/6 0 7 33 40
IGC09/9.10-C15/14 2 5 38 45
IGC09/9.10-C15/15 0 2 44 46
IGC09/9.10-C15/25 2 6 50 58
IGC09/9.10-C15/30 1 4 41 46
IGC09/9.10-C15/35 0 5 42 47
IGC09/9.10-C15/40 0 0 29 29
нов, полученных на основе дигаплоида сорта Lyra IGC 09/9.10 (в табл. 2 приведен клон IGC09/9.10-С15/40), а также у двух клонов на основе дигаплоида сорта Saphir IGC09/2.4 (в табл. 2 - клон IGC09/2.4-C15/11). Пример клеток эпидермиса листа колхицинированных клонов различного уровня плоидности и мозаичной химеры представлен на рис. 1 (а-в).
Полученные нами результаты по выходу полиплоидизированных растений не вполне соответствуют данным, полученным другими авторами. Так, в работе [20] указывается, что частота удвоенных растений диких диплоидных видов выше, чем дигаплоидов S. tuberosum. В нашем случае максимальное число тетраплоидов получено у первичного дигаплоида сорта культурного картофеля Lyra, а среди межвидовых гибридов не выявлено ни одного с преобладанием клеток тетраплоидно-го уровня. В то же время частота появления тетраплоидных клонов среди оцененных нами по плоидности растений в целом согласуется с данными этих же авторов. В нашем случае она составила 6,4%, а в работе [20] она колебалась от 4,5 до 7,1 % в зависимости от генотипа. При этом частота появления миксоплоидов в нашем эксперименте оказалась гораздо выше.
Скрещиваемость колхицинированных клонов с тетраплоидными тестерами
Скрещивание колхицинированных клонов с тетраплоидными тестерами позволяет решить одновременно несколько задач. Во-первых, как указывалось выше, это один из способов определения плоидности генеративных тканей колхицинированных растений. Во-вторых, это способ отбора среди цитогенетически нестабильных генотипов фертильных образцов, перспективных для использования с целью передачи генетического материала диплоидов на тетраплоидный уровень. И, в-третьих, это, собственно, и есть способ переноса комплекса ценных генов, собранных на диплоидном уровне, к тетраплоидным гибридам. В 2015 году мы осуществили отбор клонов, перспективных в качестве удвоенных мультиплексных линий, среди клубневого потомства колхицинирован-ных клонов межвидовых диплоидных гибридов. В сезон 2016 года проводили поиск таких линий среди потомства колхицинированных клонов первичных дигаплоидов S. tuberosum.
В 2015 году испытания проводили для пяти клонов IGC 08/29.39 и четырех клонов IGC 08/29.40. У одного из цитогенетически нестабильных клонов, происходивших от
IGC 08/29.39 (08/29.39-C14/25), оценку скрещиваемости осуществляли на растениях, выросших из трех разных клубней, с целью выявления возможности стабилизации плоидности при вегетативном размножении колхицини-рованых растений. Уровень функциональной фертильности пыльцы миксоплоидных клонов межвидовых гибридов во всех случаях оказался недостаточным для использования их в скрещиваниях в качестве опылителей. У лучшего по этому показателю клона он не превышал 1,5%. С одной стороны, это может объясняться относительно невысоким уровнем фертильности исходных гибридов, имеющих цитоплазму дикого типа S. stoloniferum, наличие которой у межвидовых гибридов часто приводит к цитоплазматической мужской стерильности [26]. С другой стороны, известно, что обработка колхицином, как правило, приводит к анеуплоидии и другим хромосомным аберрациям, мутациям в отдельных генах, которые негативно сказываются на уровне фертильности [9, 19]. Судя по нашим данным, кардинальных хромосомных нарушений, которые вели бы к формированию преимущественно абортивной пыльцы у цветущих миксоплои-дов, по-видимому, нет. Несмотря на невысокий процент прорастающей in vitro пыльцы, доля в пыльце абортивных пыльцевых зерен также была незначительной (рис. 1г). Уровень функциональной фертильности отдельных колхи-цинированных клонов может быть сопоставим с фертильностью некоторых современных сортов картофеля, в частности с фертильностью одного из сортов, который мы пытались использовать в качестве опылителя (белорусский сорт Чарауник с фертильностью менее 3%).
В табл. 3 приведены результаты опыления миксоплоидных клонов межвидовых гибридов высокофертильным сортом Katahdin (ФФП более 30%). Опыление низкофертильным сортом Чарауник во всех случаях оказалось безрезультатным, несмотря на сопоставимый с первым опылителем объем скрещиваний. Нам удалось выделить три клона, которые могут быть использованы в скрещиваниях с те-траплоидными сортами: IGC08/29.39-C14/6, IGC08/29.39-C14/25-2 и IGC08/29.40-C14/35-1. Лучшую скрещиваемость с тетраплоидами показал клон 08/29.39-С14/6, который по фенотипу в наибольшей степени отличался от исходной
диплоидной формы и был похож на тетрапло-идное растение (рис. 1д). Интересно, что у этого клона не было выявлено клеток с числом хлоро-пластов тетраплоидного уровня (более 18). В то же время у него было много клеток устьиц с числом хлоропластов 16-18. По-видимому, при отборе колхицинированных растений не следует отбраковывать клоны с переходным числом хлоропластов при первоначальном цитологическом анализе, так как среди них могут оказаться образцы с увеличенным количеством полиплои-дизированных клеток в других эмбриональных слоях, к которым, в частности, относится эмбриональный слой генеративной сферы [22, 23]. Судя по данным скрещиваемости с тетраплоид-ным тестером клубневого потомства колхици-нированных растений, при получении полового потомства колхицинированных клонов желательно проводить гибридизацию с растениями, выросшими из разных клубней. По-видимому, в процессе вегетативного размножения происходит «расхимеривание» миксоплоидов и стабилизация плоидности отобранных клубневых клонов. Известно, что подобное происходит и с соматическими гибридами картофеля, для которых также характерна цитогенетическая нестабильность, что негативно сказывается на их фертильности. После нескольких циклов клубневого репродуцирования происходит стабилизация плоидности и появляется возможность успешного скрещивания соматических гибридов с тетраплоидным картофелем [24]. Мы наблюдали разный уровень скрещиваемости с тетраплоидным тестером растений одного и того же миксоплоидного клона (08/29.39-С14/25), выращенных из разных клубней. Так, при сопоставимом объеме скрещиваний у одного из трех клонов были получены семена (08/29.39-С14/25-2), а у двух (08/29.39-С14/25-2 и 08/29.39-С14/25-1) наблюдали только образование ягод с абортивными семенами.
В 2016 году скрещивания выделившихся по женской плодовитости митотически удвоенных клонов на основе межвидовых гибридов были повторены с использованием нескольких фертильных тетраплоидных сортов. Также осуществлено опыление сортами-тестерами отобранных по плоидности митотически удвоенных клонов на основе первичных дигапло-идов S. tuberosum. Результаты гибридизации приведены в табл. 3.
* з ,
Ici
5 Jfw ЯЛ Mr щ^-. i R
at i -
-1 .Д - L
H ^ LIsuh
gjki*''. À
ИВТ* .
^ ■- 4 TÔT
^ _ï. .
■
»,6-. ■■ jm V
Ж Si"- " LI
^ ■ -.- w ^ ■ -
Рис. 1. Цитогенетические и морфологические особенности колхицинированных клонов картофеля. А-в - количество хлоропластов в паре замыкающих устьичных клеток эпидермиса листа колхицинированных клонов: а - клон IGC09/2.8-C15/3 с 2х-клетками (увеличение х1000); б - клон IGC09/9.10-C15/35 с 4х-клетками (увеличение х4000); в - химерный по плоидности клон IGC 08/29.39-С14/19 с клетками уровня плоидности 2х, 4х и переходного 2х-4х (увеличение х1000); показаны клетки разного уровня плоидности: 1 - клетки с числом хлоропластов 9-14 (справа) и с числом хлоропластов 16-18 (в центре); 2 - клетки с числом хлоропластов более
18 (20-23);
г - прорастание in vitro пыльцы митотически удвоенного клона IGC 08/29.39-С14/6: 3 - пример абортивной пыльцы (мелкая, лишенная цитоплазмы, неправильной формы); 4 - функционально фертильное пыльцевое зерно (прорастающее in vitro); 5 - пыльцевое зерно с характерными для тетраплоидного картофеля размерами и
наличием четырех пыльцевых пор; д - листовые пластинки: 6 - митотически удвоенного, скрещивающегося с тетраплоидным тестером клона IGC
08/29.39-С14/6; 7 - исходного диплоидного межвидового гибрида IGC 08/29.39 (2); е - колхицинированные клоны первичного дигаплоида IGC IGC09/9.10 (сорт Lyra) в горшечной культуре: 8 -клон IGC09/9.10-17 с клетками исключительно диплоидного уровня (8-14 хлоропластов), т.е. не подвергшийся митотическому удвоению; 9 - клон IGC09/9.10-C15/40 с клетками исключительно тетраплоидного уровня (18 и более хлоропластов); 10 - химерный по плоидности клон IGC09/9.10-C15/2 с преобладанием клеток тетраплоидного (18 и более хлоропластов) и переходного уровня (16-18 хлоропластов). Клубневое поколение клона IGC09/9.10-C15/2 оказалось удовлетворительно цветущим и фертильным в качестве материнской формы
в скрещиваниях с тетраплоидным тестером
Таблица 3
Результаты гибридизации между митотически удвоенными клонами и мужски фертильными
сортами картофеля (Минск, 2015-2016 гг.)
Материнская форма Опылитель Опылений, шт. Ягод, шт. Семян, шт. Семян на опыление, шт.
08/29.39-C14/6 * Katahdin 39 3 l29 3,3
08/29.39-C14/6 Carlita 6 l 0 0
08/29.39-C14/6 Манифест l9 0 0 0
08/29.39-C14/6 Mixl** l4 0 0 0
08/29.39-C14/6 Mix2 l2 0 0 0
08/29.39-C14/6 Mix3 4 0 0 0
08/29.39-C14/25-2* Katahdin 63 l0 2 0,03
08/29.39-C14/25-2 Gala 7 0 0 0
08/29.39-C14/25-2 Carlita l9 l 0 0
08/29.39-C14/25-2 Манифест 36 0 0 0
08/29.39-C14/25-2 Mixl 32 0 0 0
08/29.40-C14/35-1* Katahdin 2l 2 l7 0,8
08/29.40-C14/35-1 Carlita l5 0 0 0
08/29.40-C14/35-1 Манифест 27 0 0 0
08/29.40-C14/35-1 Mix2 l4 0 0 0
08/29.40-C14/35-1 Mixl 20 0 0 0
08/29.40-C14/35-1 Mix3 37 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/2 Манифест l3 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/2 Mixl l4 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/2 Mix2 l2 6 l54 l2,8
IGC-09/9.10-C15/2 Mix3 27 ll 80 3,0
IGC-09/9.10-C15/6 Mixl 6 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/14 0 - - -
IGC-09/9.10-C15/16 Манифест l7 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/16 Katahdin 6 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/16 Carlita 6 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/16 Mixl 3 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/16 Mix2 l 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/25 0 - - -
IGC-09/9.10-C15/28 Carlita 7 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/30 Gala 6 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/35 Carlita 9 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/35 Манифест l0 0 0 0
IGC-09/9.10-C15/40 Манифест 4 0 0 0
IGC-09/2.4-C15/7 0 - - -
IGC-09/2.4-C15/11 Манифест 4 0 0 0
Продолжение табл. 3
Материнская форма Опылитель Опылений, шт. Ягод, шт. Семян, шт. Семян на опыление, шт.
IGC-09/2.4-C15/11 Mix1 7 0 0 0
IGC-09/2.4-C15/11 Mix2 7 0 0 0
IGC-09/2.8-C15/6 0 - - -
* - результаты опыления 2015 года сортом Katahdin; ** - в качестве опылителя использованы смеси пыльцы мужски фер-тильных сортов: Mixl (Katahdin, Чародей, Манифест); Mix2 (Чародей, Quarta, Дина); Mix3 (Katahdin, Чародей, Gala, Quarta)
Как видно из табл. 3, нам не удалось осуществить опыление митотически удвоенных клонов IGC-09/9.10-C15/14, IGC-09/9.10-C15/25, IGC-09/2.4-C15/7 и IGC-09/2.8-C15/6. При нормальном клубнеобразовании и относительно мощном габитусе растений цветение у них отсутствовало. Следует отметить, что уровень цветения и других клонов на основе первичных дигаплоидов картофеля был достаточно низким. Он существенно уступал уровню цветения удвоенных клонов межвидовых гибридов. Как правило, это были единичные цветки или кисти с тремя-четырьмя цветками и не более двух ярусов цветения, что не позволило реализовать большой объем скрещиваний. Исключением был клон IGC-09/9.10-C15/2 дигаплоида сорта Lyra, уровень цветения которого соответствовал 3 баллам (достаточно продолжительное, в несколько ярусов цветение). Это позволило провести его опыление в разных комбинациях, в двух из которых было получено достаточно большое количество семян. В обеих удачных комбинациях использована смесь пыльцы фертильных сортов картофеля.
Известно, что обработка меристематиче-ских тканей растений колхицином ведет к множественным нарушениям, в том числе к появлению хромосомных аберраций. Это сказывается на формировании генеративных клеток митотически удвоенных клонов, вызывая стерильность растений, отклонения в росте и развитии растений [19]. То есть, митотическое удвоение хромосом методом колхицинирования может быть причиной как низкой мужской фертильности, так и женской плодовитости. Причиной пониженной фертильности также может быть сохранение определенного уровня цитологической хи-мерности различных эмбриональных слоев
клубневых поколений колхицинированных клонов: мериклинальной (мозаичности) или секториальной химерности, или различие плоидности между эмбриональными слоями (периклинальной химерности) [22].
Цитологический анализ плоидности кол-хицинированных клонов мы проводили на уровне слоя L1 (замыкающие клетки устьиц эпидермиса листа). Однако для успешной гибридизации имеет значение плоидность эмбрионального слоя L2 (генеративные клетки) [22]. Следовательно, тестерные скрещивания с тетраплоидным родителем позволяют отбирать цитогенетически стабильные или относительно стабильные тетраплоидные ми-тотически удвоенные клоны и одновременно получать гибриды с их участием. Очевидно, к таковым относится клон ЮС-09/9.10-С15/2, так как с его участием получено большое количество семян. Возможно, в дальнейшем по мере клубневого репродуцирования колхи-цинированных клонов удастся отобрать еще какое-то количество таких клонов.
Возникает вопрос, почему в скрещиваниях 2016 г. с участием колхицинированных клонов на основе межвидовых гибридов нам не удалось повторить успех, достигнутый в предыдущем году. В 2015 г. в качестве тетраплоидного тестера использовали сорт Katahdin. Этот сорт известен своей высокой функциональной мужской фертильностью, поэтому широко используется в качестве опылителя в селекционных программах. Его можно обнаружить в родословных многих современных сортов картофеля [27]. Однако скрещиваемость генотипов определяется не только фертильностью включенных в гибридизацию генотипов, но и их совместимостью [28, 29]. Последняя определяется составом аллелей S-гена материнской формы и опы-
лителя, разнообразие которых у культурного картофеля, как правило, невелико [29, 30]. Для успешных скрещиваний в пыльце должен присутствовать хотя бы один S-аллель, который отсутствует у материнской формы. В результате митотического удвоения хромосом происходит дупликация S-аллелей, присущих исходному диплоидному генотипу, что сужает разнообразие S-аллелей у полученных тетраплоидных клонов (максимальное их количество - два) по сравнению с тетраплоидными сортами (максимальное количество - 4). В литературе нет сведений о S-аллельном составе сорта Katahdin. Однако, судя по активному использованию его в селекции, можно предположить, что такое разнообразие у него достаточно широко, что и определяет его хорошую совместимость со многими сортами и гибридами картофеля. По-видимому, именно эта генетическая особенность сорта-тестера позволила нам осуществить успешную гибридизацию с ми-тотически удвоенными клонами в 2015 году. В 2016 году в качестве опылителей были использованы другие сорта картофеля (Carlita, Gala, Манифест), отобранные не только в соответствии с их достаточно высокой мужской фертильностью, но и на основании присущего им комплекса хозяйственно-ценных признаков. В частности у них имеются важные гены устойчивости к патогенам, отсутствующие у сорта Katahdin [16, 18]. Очевидно, сорта, отобранные в качестве опылителей в 2016 году, не обладают достаточным S-аллельным разнообразием для
обеспечения совместимости с удвоенными дигаплоидами. Решению проблемы может способствовать использование в качестве опылителя смеси пыльцы нескольких сортов. Так, при гибридизации клона ЮС-09/9.10-С15/2 с сортом Манифест завязывания семян не произошло, в то время как использование двух из трех вариантов смеси пыльцы оказалось результативным (табл. 3).
Подтверждение дупликации генов устойчивости к болезням и вредителям у митотиче-скиудвоенных клонов диплоидного картофеля
Количество семян гибридной популяции ЮС 15/71.П, полученной при опылении мито-тически удвоенного клона ЮС08/28.39-С14/6 тетраплоидным сортом-тестером Katahdin, позволило осуществить анализ наследования доминантных аллелей генов устойчивости к нематоде, присутствующих у исходного диплоидного гибрида и отсутствующих у сорта-тестера. Экспериментальная гибридная популяция включала более 30 сеянцев, что, по мнению [5], достаточно для получения достоверных различий между симплексами, дуплексами и триплексами при анализе расщепления по изучаемым генам у тетраплоидов. Данные расщепления по ДНК-маркерам СР113 (к гену Н1) и Gro1-4 (к гену Gro1-4) в гибридном потомстве ми-тотически удвоенного клона представлены в табл. 4. На рис. 2 показаны примеры результатов ПЦР-анализа родительских образцов и гибридов расщепляющейся популяции по обоим маркерам.
ПЦР-маркер Фактическое расщепление А:а Теоретическое расщепление А:а Значение X2 Уровень значимости Р Ген и его аллельное состояние
СР113 34:6 32,5:6,5 (5:1) 0,11 0,75 H1 дуплекс
Gro1-4 16:6 18,33:3,67 (5:1) 1,78 0,2 Gro1-4 дуплекс
17,29:4,71* (3,67:1) 0,44 0,5
* - с учетом хроматидного расщепления
Таблица 4
Характер расщепления по наличию ПЦР-маркеров к генам устойчивости к нематоде в гибридной популяции ЮС 15/71.П от скрещивания митотически удвоенного клона ЮС08/28.39-С14/6 с нуллиплексным по данным генам сортом Katahdin
М D Т 1 2 3 4 5 6 7 8 9 10 11 12 13 14
+ + + + + + +
MDT1 2345 6789 10
+ + + + —
+ + + +
М 15 16 17 18 19 20 21 22 23 24 25 26 27 28 29 30 + + + + + + + + + + + + + —+ +
М 11 12 13 14 15 16 17 18 19 20 21 22
31 32 33 34 35 36 37 38 39 40 М
+ + + + +
+ + + +
+ + +
+ + + +
СР113-760
Gro 1-4 -602
Рис. 2. Расщепление по наличию ПЦР-маркеров двух генов устойчивости к цистообразующей золотистой нематоде у исходных родительских форм: митотически удвоенного клона IGC08/28.39-C14/6 и сорта-тестера Katahdin и гибридов, полученных при их скрещивании: а - по маркеру CP113760 гена H1; б - по маркеру Gro1-4602
гена Gro1-4.
M - маркер молекулярного веса 100-1000 п.н. D - митотически удвоенный (doubled) клон гибрида IGC08/28.39-C14/6, Т - сорт-тестер Katahdin; 1-40 - гибриды D х TIGC 15/71.П.; наличие ПЦР-маркера обозначено знаком «+», отсутствие маркера - знаком «-»
a
Как видно из данных табл. 4, расщепление по гену Н1 оказалось близким к 5:1, характерному для анализирующего скрещивания тетраплоидного дуплекса с нуллиплексом (ААаа х аааа). Это подтверждает факт дупликации генов при митотическом удвоении хромосом гибрида ЮС08/28.39, у которого, очевидно, данный ген представлен в гетерозиготном состоянии. В случае с геном Gro1-4 наблюдали избыток рецессивных гомозигот, не позволяющий рассматривать полученное расщепление как 5:1. Однако оно также не соответствует 1:1, которое имело бы место при скрещивании симплекса с нуллиплексом (Аааа х аааа) (х2 = 4,54 при р < 0,05). Известно, что расщепление, обусловленное рекомбинацией хромосом, является лишь одной из форм наследования у тетраплоидов. Теоретически ожидаемое отношение 5 : 1 характерно для генов, расположенных близко к центромере. Оно может нарушаться в случае так называемого хроматидного расщепления. Хроматидное расщепление характерно для генов, локализованных достаточно далеко от центромеры, чтобы имел место регулярный кроссинговер. При этом обычно возникает избыток рецессивных
форм, например, 0,86А:1а, в анализирующих скрещиваниях симплексов. У дуплексов оно выглядит как 3,67:1 вместо ожидаемого 5:1
[31]. Экспериментально полученное нами расщепление близко к тому, что имеет место при хроматидном расщеплении. Таким образом, проанализированный нами колхицинирован-ный клон является дуплексом по гену Gro1-4.
Кроме представленных выше маркеров к генам устойчивости к G. rostochiensis, у гибридов IGC08/28.39 и IGC08/28.40 также присутствуют маркеры генов устойчивости к L- и Y-вирусам картофеля, раку и фитофторозу. Устойчивость к фитофторозу у этих гибридов, полученных с участием мексиканского алло-тетраплоидного вида S. stoloniferum, определяется гомологами генов Rpi-blb1, Rpi-blb2 и Rpi-blb3, которые обеспечивают высокую долговременную устойчивость к патогену [2, 11, 32]. Подобная комбинация генов до настоящего времени была интрогрессирована лишь в несколько экспериментальных генотипов картофеля с помощью генно-инженерных методов
[32]. Высокую селекционную ценность имеет также первичный дигаплоид сорта Lyra IGC 09/9.10, митотически удвоенный клон которо-
го нам удалось скрестить с тетраплоидными сортами. По данным генотипирования, у него выявлены семь маркеров к генам устойчивости к болезням и вредителям (гены H1 и Gro1-4 устойчивости к золотистой цистообразую-щей нематоде, Ryadg устойчивости к Y-вирусу картофеля, Rxadg устойчивости к X-вирусу картофеля, два QTL, PLRV1 и PLRV4, устойчивости к вирусу скручивания листьев, гены устойчивости к раку Senl и фитофторозу R1). Таким образом, тетраплоидные родительские линии с дупликацией генов, представленных у этих форм, и способные скрещиваться с тетра-плоидными сортами картофеля, представляют значительный интерес для селекции, так как передают значительной части потомства комплекс имеющихся у них генов устойчивости к важнейшим патогенам картофеля.
Заключение
В результате колхицинирования in vitro диплоидных клонов картофеля разного происхождения (беккроссы диплоидных межвидовых гибридов на основе мексиканского дикого алло-тетраплоидного вида S. stoloniferum и первичные дигаплоиды нескольких сортов S. tubero-sum), отобранных по наличию у них комплекса ДНК-маркеров генов устойчивости к болезням и вредителям, был получен ряд митотически удвоенных клонов. Цитологический анализ плоидности позволил выделить среди них образцы с тетраплоидными клетками. Несмотря на то, что значительная часть отобранных клонов имела скудное цветение и пониженный уровень мужской и женской фертильности, нам удалось скрестить в качестве материнских форм некоторые из удвоенных клонов с тетраплоидными сортами. Среди них - митотически удвоенный клон IGC 08/28.39-С14/6 на основе межвидового гибрида и клон IGC-09/9.10-C15/2 от первичного дигаплоида сорта Lyra. Анализ расщепления по наличию ДНК-маркеров к генам устойчивости к нематоде у гибридов от скрещивания клона IGC 08/28.39-С14/6 с нуллиплексным по этим генам сортом Katahdin показал дуплексное состояние генов H1 и Gro1-4. Это дает основание рассматривать его в качестве мультиплексной родительской линии, способной передавать значительной части потомства комплекс генов устойчивости к болезням и вредителям. Результаты исследо-
вания подтвердили возможность использования метода митотического удвоения хромосом у диплоидных линий картофеля, созданных в результате отбора на диплоидном уровне, для получения тетраплоидных мультиплексных родительских линий, перспективных для традиционной селекции картофеля.
Авторы статьи выражают благодарность за помощь в проведении экспериментов, результаты которых легли в основу данной статьи, Ольге Владимировне Свиточ.
Список использованных источников
1. Marker-assisted combination of major genes for pathogen resistance in potato / C. Gebhardt [et al.] // Theor. Appl. Genet. - 2006. -Vol. 112. - P. 1458-1464.
2. Applied biotechnology to combat late blight in potato caused by Phytophthora in-festans / A. Haverkort [et al.] // Potato Res. -2009. - Vol. 52. - P. 249-264.
3. Potato breeding with haploids and 2n gametes / S.J. Peloquin [et al.] // Genome. - 1989. -Vol. 31. - P. 1000-1004.
4. Свежиньский, К. Создание исходного материала для селекции картофеля в Польше / K. Свежиньский // Картофель: селекция, семеноводство и технология возделывания. -Минск : Ураджай, 1988. - С. 135-150.
5. Bradshaw, J.E. Breeding strategies for clonally propagated potatoes / J.E. Bradshaw, G.R. Mackay // Potato genetics; J.E. Bradshaw, G.R .Mackay (eds). - Wallingford (UK): CABI, 1994. - P. 109-132.
6. Dionne, L.A. A survey of methods for overcoming cross-incompatibility between certain series of the genus Solanum / L.A. Dionne // Amer. Potato Journal. - 1958. - Vol. 35. -P. 422-423.
7. Dionne, L.A. Studies on the use of Sola-num acaule as a bridge between Solanum tu-berosum and species in series Bulbocostana, Cardiophyla and Pinnatisecta / L.A. Dionne // Euphytica. - 1963. - Vol. 12. - P. 263-269.
8. Ross, R.W. Doubling the chromosome number of selected Solanum genotypes. / R.W. Ross, A.L. Dionne, R. Hougas // Europ. Potato J. - 1967. - Vol. 10. - P. 37-52.
9. Mitotic chromosome doubling of plant tissue in vitro/ E. Dhooghe [et al.] // Plant Cell Tiss. Organ Cult. - 2011. - Vol. 104. - P. 359-373.
10. Zhang, J. Obtaining autotetraploids in vitro at a high frequency in Citrus sinensis / J. Zhang, M. Zhang, X. Deng // Plant Cell Tiss. Organ Cult. - 2007. - Vol. 89. - P. 211-216.
11. Wang M. Diversity and evolution of resistance genes in tuber-bearing Solanum species. PhD-thesis / M. Wang; Wageningen Universit-eit. - Netherlands, 2007. - 108 pp.
12. Воронкова, Е.В. Получение гаметокло-нов из нередуцированной пыльцы в культуре in vitro пыльников сортов картофеля и их первичная оценка по урожайности и другим селекционно-ценным признакам / Е.В. Воронкова [и др.] / под ред. А.П. Ермишина. -Минск: Право и экономика, 2013. - 62 с.
13. Цитологическая и цитоэмбриологичес-кая техника (для исследования культурных растений): методические указания / Л.И. Абрамова [и др.]; под ред. Л.И. Орел / Ленинград: ВИР им НИ. Вавилова, 1982. -77 с. (Электронная копия [Электронный ресурс] - Режим доступа: http://cam.psn. ru в Электронной библиотеке ЦАМ) - Дата доступа: 18.02.2016.
14. Kostrica, P. Possibilities of indirect determination of the ploidy in potato regenerants in vitro / P. Kostrica, J. Domkarova // Rostlinna Viroba UZPI. - 1993. - Vol. 39, N 2. - P. 139148.
15. De Maine, M.J. Potato haploid technologies. Ch.2.35. / M.J. de Maine // Doubled hap-loids production in crop plants. A Manual. / Kluwer Academic Publishers; M. Maluszynsky, K.J. Kasha, B.P.Forster, I. Szarejka eds. - USA, 2003. - P. 241-247.
16. Определение состава и аллельного состояния генов устойчивости к болезням и вредителям у родительских линий картофеля с помощью ДНК-маркеров/ А.П. Ермишин [и др.] // Генетика. - 2016. - Т. 52, № 5. -С. 1-10.
17. Оценка исходного материала картофеля для селекции на устойчивость к болезням и вредителям с помощью специфических ПЦР-маркеров: методические рекомендации / А.П. Ермишин [и др.]; под ред. А.П. Ермишина. - Минск: Право и экономика, 2010. - 60 с.
18. Оценка исходного материала картофеля по составу и аллельному состоянию генов устойчивости к болезням и вредителям с
целью оптимизации подбора родительских форм для гибридизации: методические рекомендации/ А.П. Ермишин [и др.]; под ред. А.П. Ермишина. - Минск: Право и экономика, 2016 - 56 с.
19. Jones, J.R. A novel method for inducing polyploidy in Rhododendron seedlings / J.R. Jones, T.G. Ranney, T.A. Eaker // J. Am. Rhododendron Soc. - 2008. - Vol. 31. - P. 130135.
20. Greplova, M. Intra- and inter-specific crosses of Solanum materials after mitotic poly-ploidization in vitro / M. Greplova, H. Polz-erova, J. Domkarova // Plant Breed. - 2009. -Vol. 128. - P. 651-657.
21. De Maine, M.J. The results of colchicine treatment of dihaploids and their implications regarding efficiency of chromosome doubling and potato histogeny / M.J. De Maine, J. A. Fantes // Potato Research. - 1983. - Vol. 26. -P. 289-294.
22. Frandsen, N.O. Die Plastidenzahl als Merkmal bei der Kartoffel / N.O. Frandsen // Theor. Appl. Genet. - 1968. - Vol. 38. - P. 153167.
23. Воронкова, Е.В. Пути повышения ан-дрогенетической способности картофеля и генетические особенности андрорегене-рантов: aвтореф. дисс. ... канд. биол. наук: 03.00.15 (генетика) / Е.В. Воронкова; Институт генетики и цитологии НАН БССР -Минск, 1999. - 20 с.
24. Яковлева, Г. А. Соматическая гибридизация и клеточная селекция картофеля (Solanum tuberosum L.). / Г.А. Яковлева // Генетические основы селекции растений. В 4 т. Т. 3: Биотехнология в селекции растений. Клеточная инженерия / науч. ред. А.В. Киль-чевский, Л.В. Хотылева. - Минск: Белорус. наука, 2012. - Гл. 4. - С. 217-250.
25. Pallais, N. Research on the physiology of potato sexual seed production / N. Pallais, N. Fong, D. Berrios // Proc. int. conf. "Innovative methods for propagating potatoes". CIP Rep. 28th Planning Conf. - Lima: CIP, 1984. -P. 149-168.
26. Sanetomo, R. Cytoplasmic genome types of European potatoes and their effects on complex agronomic traits / R. Sanetomo, C. Gebhardt // BMC Plant Biology. - 2015. - Vol. 15. -P. 162-178.
27. Potato Pedigree Database [Электронный ресурс] / Wageningen UR Plant Breeding. -Режим доступа http://www.plantbreed-ing.wur.nl/potatopedigree. - Дата доступа 29.11.16.
28. Ермишин, А.П. Отбор на диплоидном уровне и манипуляции с плоидностью в селекции картофеля/ А.П. Ермишин // Молекулярная и прикладная генетика: сб. науч. тр. - 2007. - Т 7. - С. 21-43.
29. Ермишин, А.П. Несовместимость при межвидовой и внутривидовой гибридизации диплоидного картофеля и пути ее преодоления / А.П. Ермишин // Вести НАН Беларуси. Сер. биол. наук. - 2001. - № 3. -С. 105-118.
30. Ермишин, А.П. Влияние общей и специфической скрещиваемости родительских форм на эффективность гибридизации дигаплоидов картофеля / А.П. Ермишин, А.В. Савчук, Н.В. Калашникова // Весщ АН Беларусь Сер. бiял. навук. - 1997. - № 3. -C. 37-40.
31. Росс, Х. Селекция картофеля. Проблемы и перспективы (Пер. с англ.) / Х. Росс / М.: Агропромиздат, 1989. - 183 с.
32. Haverkort, A.J. Durable late blight resistance in potato through dynamic varieties obtained by cisgenesis: scientific and societal advances in the DuRPh Project / A.J. Haverkort [et al.] // Potato Research. - 2016. - Vol. 40, N 1. - P. 1-32. -DOI 10.1007/s11540-015-9312-6.
E.V. Voronkova, V.I. Luksha, O.N. Gukasian, Yu.V. Polyukhovich, М.У Zharych, A.P. Yermishin
USE OF MITOTIC POLYPLOIDIZATION IN VITRO FOR PRODUCTION OF POTATO MULTIPLEX PARENTAL LINES
Institute of Genetics and Cytology, NAS of Belarus Minsk BY-220072, the Republic of Belarus
In vitro colchicine treatment of diploid potato clones with a complex of resistance genes resulted in the production of a set of mitotically doubled clones. In spite of cytogenetic instability and reduced male and female fertility of the selected clones, we were able to produce the generative progeny in crosses between some of them and tetra-ploid varieties. The mode of inheritance of DNA-markers of PCN resistance genes in hybrids between doubled clone IGC 08/28.39-С14/6 and Katahdin variety that is the nulliplex for these genes indicates the duplex state of the genes. It makes it possible to consider this clone as the multiplex parental line that is prospective for breeding potato varieties with combined resistance to pests and diseases.
Key words: potato, dihaploids, mitotic polyploidization, multiplex lines, resistance genes
Дата поступления статьи 5 января 2017 г.
