CC BY
20УДК 636.2.055:612.015.3:577.16
ОЦЕНКА ОБЕСПЕЧЕННОСТИ ТИАМИНОМ И ФОЛАЦИНОМ И НАПРАВЛЕННОСТИ ОБМЕНА ПИРОВИНОГРАДНОЙ КИСЛОТЫ У КОРОВ В СВЯЗИ С УРОВНЕМ ПРОДУКТИВНОСТИ
Галочкина В.П., Агафонова А.В., Дудин В.И.
ВНИИ физиологии, биохимии и питания животных, Боровск Калужской обл., Российская Федерация
Опыт проведен в период раздоя на трёх группах коров черно-пестрой породы по 3 головы в группе со среднесуточным удоем 44,3±1,5; 35,0±0,6 и 26,3±3,2 кг (M±SD) в 1, 2 и 3 группах соответственно. Удержание тиамина, фолацина, пирувата и ацетальдегида определяли в молоке, плазме крови и в моче; в плазме крови - активность пируваткарбоксилазы (ПК) и лактатдегидрогеназы (ЛДГ) в присутствие НАД. У высокопродуктивных животных было повышено тотальное выделение тиамина и фолацина с молоком и, несмотря на компенсаторное уменьшение выделения их с мочой, создавался дефицит этих витаминов. Низкое отношение ПК/ЛДГ в группах (0,037-0,127) свидетельствовало о преимущественном использовании пирувата не на синтез глюкозы, а на метаболизацию через оксалоацетат в цикле Кребса. Наблюдался дефицит тиамина и фолацина во всех группах, особенно у высокопродуктивных коров. Недостаточность тиамина и, возможно, ФАД привела к снижению активности пируватдегидрогеназы и к повышенному выделению ацетальдегида с мочой. Вследствие низкой активности ПК и ЛДГ происходило накопление пирувата и повышенное выделение его с мочой. Полученные результаты позволяют предположить, что в условиях опыта по мере увеличения молочной продуктивности происходил сдвиг потока утилизации пировиноград-ной кислоты в направлении реакций аминирования и переаминирования. Данная направленность метаболизма пирувата способствовала повышенному синтезу белка, в том числе в печени и в молочной железе.
Ключевые слова: молочные коровы, витамины, тиамин, фолацин, метаболизм, пируват, аце-тальдегид
Проблемы биологии продуктивных животных, 2016, 1: 65-75
Введение
В период раздоя коров большой проблемой является поддержание на достаточно высоком уровне поступление в организм сухого вещества для обеспечения биосинтеза компонентов молока субстратами и энергией. При недостаточном поступлении глюкозы из кишечника удовлетворение потребности организма в глюкозепроисходит за счет глюконеогенеза из пропионата, пирувата, лактата (через пируват) и даже по невыгодному для организма метаболического пути - из аминокислот, необходимых для синтеза белков тела и продукции.С повышением молочной продуктивности возрастают требования к балансированию рационов не только по питательным, но и по биологически активным веществам, в том числе по витаминам. Тиамин (витамин В1), наряду с Ко-А, липоевой кислотой, ФАД и НАД, является кофактором мультиэнзимного пируватдегидрогеназного комплекса, включающего в себя два регу-ляторных и три каталитических фермента, от активности которых зависит работа цикла Креб-са (Depeint et al., 2006; Hershkowitz, Markel, 2015). Пируватдегидрогеназа (ПДГ) и пируват-карбоксилаза (ПК) ответственны за катализ двух альтернативных путей метаболизации пиро-виноградной кислоты (с образованием ацетил-КоА и оксалоацетата). При высоких величинах
отношений АТФ/АДФ, НАДН/НАД и ацетил-КоА/КоА ингибируется ПДГ и, наоборот, активируется ПК, так как ацетил-КоА является ее аллостерическим активатором.
В ряде исследований показано, что тиамин имеет прямое отношение к регуляции энергетики клеточных процессов (Tylicki, Siemieniuk, 2011). От обеспеченности тиамином зависит синтез не только АТФ, но и гуанозинтрифосфата (ГТФ), образующегося при активации сукцината в результате действия альфа-кетоглютарат дегидрогеназы. Этот фермент, как и пируватдегидрогеназа, также содержит в активном центре тиамин. ГТФ используется в процессе биосинтеза белка, для передачи гормональных сигналов в клетку через рецепторы, содержащие ГТФ-связывающие белки. Активированный сукцинат (сукцинил-КоА) необходим как источник энергии в периферических тканях для образования ацетил-КоА из ацетоацетата (Галочкина и др., 2000). От обеспеченности тиамином (за счёт поддержания активности ПДГ) зависит синтез глюкозы и направленность метаболизма ацетил-КоА, необходимого для синтеза жирных кислот, холестерина и молочного жира.
Для синтеза белка необходимы не только сбалансированный набор аминокислот, но и достаточная обеспеченность фолацином (фолиевая кислота, витамин В9). Важнейшая функция веществ группы фолиевой кислоты заключается в их участии в процессахпереноса одно-углеродных групп, например, метильных и формильных, от одних органических соединений к другим. Активные формы фолиевой кислоты (ди- и тетрагидрофолиевая кислоты) образуются в печени путем гидрирования фолиевой кислоты с участием аскорбиновой кислоты. Од-ноуглеродные соединения используются при синтезе аминокислот и пиримидиновых оснований.
При синтезе белков на N-конце полипептидной цепи имеется одна и та же последовательность аминокислот (формильная группа и остатки аминокислот метионина, аланина и серина), которые позднее удаляются. Форминилирование происходит на уровне специфической метионил^-РНК в результате переноса формильной группы от N10-формилтетрагидрофолиевой кислоты. Таким образом, инициирование трансляции зависит от наличия ацилированной S-РНК, т.е., в конечном счете, от обмена одноуглеродных соединений. Таким образом, функции фолиевой кислоты тесно связаны с биосинтезом белка, в том числе и молочного.
Известно, что синтез различных водорастворимых витаминов в содержимом рубца коров происходит с неодинаковой скоростью и зависит от условий кормления (Долгова, 2001), от микробного состава содержимого рубца и толстого кишечника (Santschi et al., 2005, Tafaj et al., 2006, Castagnino et al., 2016); ряд водорастворимых витаминов должен поступать в организм высокопродуктивных лактирующих коров не только в составе кормов, но и дополнительно в виде добавок к рациону (Shaver, Bal, 2000; Girard, Matte, 2006). Помимо этого, практикуются комплексные добавки в рацион лактирующих коров жирорастворимых, водорастворимых витаминов и минеральных веществ (Strusinska et al., 2006).
Цель данной работы состояла в изучении особенностей метаболизма пировиноград-ной кислоты у коров в связи с обеспеченностью тиамином и фолацином в период раздоя в зависимости от уровня продуктивности.
Материал и методы
Опыт был проведен в условиях совхоза Архангельский Наро-Фоминского района Московской области методом групп в первые три месяца лактации на коровах со средней живой массой 600 кг и удоем за предыдущую лактацию 8,5; 6,5 и 4,5 тыс. кг молока. В соответствии с продуктивностью коровы были распределены в три группы по 3 головы в каждой: 1-я группа - высокопродуктивные, 2-я - среднепродуктивные и 3-я - низкопродуктивные, со среднесуточным удоем 44,3±1,5, 35,0±0,6, и 26,3±3,2 кг (M±SD) соответственно. Содержание коров привязное с ежедневными прогулками в загоне. Кормление осуществляли с кормовых столов при двухразовой раздаче полнорационной кормосмеси. Поение животных - из автоматических поилок, доение двукратное. Подопытные группы коров с 15-го дня лактации получали
рацион, сбалансированный по обменной энергии и обменному протеину с учётом потребности в отдельных субстратах (Агафонов и др., 2001). Длительность опыта 3 месяца.
Определение тиамина, фолацина, пировиноградной кислоты проводили в молоке, плазме крови и моче по прописям (Петрунькина, 1961), по суточному удою молока рассчитывали выведение с молоком витаминов и пирувата. Определение уксусного альдегида в моче-проводили выделением его в виде 2,4-динитрофенилгидразонов методом двукратной хроматографии со свидетелем в тонком закрепленном слое силикагеля L (Lachema, Чешская Республика) с использованием бензола в качестве носителя. Экстракцию гидразона с силикагеля проводили метанолом. Концентрацию ацетальдегида измеоряли при 340 нм с помощью спектрального колориметра «Specol-11» (Carl Zeiss, Германия). Для оценки направленности метаболизма пировиноградной кислоты, в плазме крови определяли активность пируваткарбокси-лазы (ПК) по методу (Scrutton et al., 1973) в модификации (Галочкина, 1997) и лактатдегидро-геназы (ЛДГ) - с набором фирмы Лахема при введении НАД в состав реакционной среды.
С целью оценки взаимосвязей между концентрациями тиамина (витамина В1), фолие-вой кислоты (фолацин, витамин Вс) в биологических жидкостях (молоке, плазме крови, моче), а также ацетальдегида в моче и активностью ПК и ЛДГ в плазме крови у коров разного уровня продуктивности, был проведен корреляционный анализ по объединённым данным, полученным на 45-й день лактации (n=9). Для оценки достоверности межгрупповых различий использовался Н-критерий Краскела-Уоллиса (непараметрический аналог метода ANOVA) (Ха-лафян, 2010).
Результаты и обсуждение
В табл. 1 приведены объединённые данные по содержанию витаминов, пировиноград-ной кислоты и ацетальдегида в биологических жидкостях и активности ПК и ЛДГ в плазме крови по всем трём группам. В табл. 2 и 3 приведены значения средних и стандартных отклонений показателей у коров, сгруппированных в три группы по уровню продуктивности. Статистически значимые межгрупповые различия выявлены по концентрации тиамина в моче (P=0,03), активности ПК (Р=0,05) и ЛДГ (Р=0,03) в плазме крови (табл. 2 и 3).
Тотальное выделение с молоком витаминов у высокопродуктивных коров было выше, чем у низкопродуктивных (табл. 4). При этом концентрация тиамина у высокопродуктивных коров во всех биологических жидкостях была ниже, чем у низкопродуктивных, особенно в моче (Р=0,03) и в молоке (Р=0,06). Величины концентрации фолацина и тотального выделения пирувата с молоком варьировали по группам в пределах ошибки опыта (табл. 2).
В табл. 5 приведены значения коэффициентов парной корреляции показателей и уровни их значимости. С увеличением продуктивности наблюдалось увеличение активности пируваткарбоксилазы (r=0,74), выделения пирувата с мочой (r=0,74), содержание тиамина в моче, наоборот, уменьшалось (r=-0,71). Выведение тиамина с мочой у высокопрдуктивных коров положительно коррелировало с выведением тиамина с молоком (r=0,68), однако высокая величина отношения пирувата к тиамину свидетельствует о недостатке этого витамина у коров всех групп, особенно у высокопродуктивных. По данным (Рябых, Дудин, 2013) величины отношения пируват/тиамин в крови в пределах 15-40 свидетельствуют о дефиците тиамина. Поэтому состояние коров всех подопытных групп можно расценивать как погранично-дефицитное по тиамину (табл. 4).
Недостаток тиамина приводил к снижению окисления пирувата до ацетил-КоА. Накопление пирувата могло стимулировать активность пируваткарбоксилазы, судя по положительной корреляции между этими показателями (табл. 5). Однако очень низкая активность ПК (табл. 3) и малая величина отношения ПК/ЛДГ свидетельствуют о незначительном вкладе пирувата в энергетический обмен по пути оксалоацетата, а также о низком использовании пирувата в глюконеогенезе (Галочкина и др., 2012). В использованных условиях инкубации (добавление НАД в инкубационную среду) увеличение активности ЛДГ у высокопродуктив-
ных коров свидетельствует об усилении процессов анаэробного гликолиза в печени и мышечной ткани.
Таблица 1. Суточный удой молока, содержание пирувата и витаминов в биологических жидкостях, ацетальдегида в моче и активность ферментов в плазме крови коров
(объединённые данные)
44 0,172 3,79 4,48 0,106 4,36 54,71 1,33 19,0 0,371 10,7 5,30 2,54
46 0,242 2,84 3,52 0,214 3,29 54,71 1,78 18,4 0,328 9,69 4,22 2,75
43 0,226 2,28 4,65 0,178 10,5 64,15 4,59 35,4 0,310 9,33 5,48 1,89
35 0,308 1,96 3,48 0,193 6,34 60,38 1,12 14,0 0,500 8,40 4,35 2,23
35 0,304 3,51 3,74 0,204 3,83 54,71 1,33 11,9 0,443 10,0 4,61 2,25
36 0,328 1,76 4,00 0,175 3,30 58,49 1,78 9,60 0,452 9,73 4,87 2,09
31 0,226 3,06 4,15 0,225 3,00 52,83 0,92 16,3 0,424 8,84 4,96 2,33
30 0,189 4,62 4,35 0,206 8,11 58,49 0,74 16,1 0,424 7,34 5,13 2,09
25 0,230 1,85 4,08 0,193 3,12 58,49 0,37 17,5 0,443 6,32 6,61 2,89
Примечание: ПК - пируваткарбоксилаза (мкмоль НАД'Н/мин/л), ЛДГ лактатдегидрогеназа (мкмоль НАД/мин/л)
Таблица 2. Концентрация тиамина, пирувата и ацетальдегида в биологических жидкостях у коров трёх групп (Ы±8Б, п=3)
Группы коров Молоко Моча Плазма крови
Тиамин, мкг/мл
1 0,213 ±0,037 0,336 ±0,031 0,166 ±0,055
2 0,313 ±0,013 0,465 ±0,031 0,191 ±0,015
3 0,215 ±0,023 0,430 ±0,011 0,208 ±0,016
Р 0,06 0,03
Фолацин, нг/мл
1 4,22 ±0,61 5,00 ±0,68 57,9 ±3,9
2 3,74 ±0,26 4,61 ±0,26 57,9 ±1,6
3 4,19 ±0,14 5,57 ±0,91 56,6 ±2,9
Р 0,19
Пируват, мкг/мл
1 2,97 ±0,76 9,92 ±0,72 6,04 ±3,87
2 2,41 ±0,96 9,38±0,86 4,49 ±1,63
3 3,17 ±1,39 7,50±1,27 4,74 ±2,92
Р 0,11
Группировка животных по среднесуточному удою (кг/сут.): 1 - 44,3±1,5, 2 - 35,0±0,6, 3 - 26,3±3,2. Р - уровень значимости по Н-критерию Краскела-Уоллиса; при Р<0,1 принимается гипотеза о неравенстве средних в целом по трём группам.
На основании полученных данных можно предположить следующее распределение метаболических потоков пировиноградной кислоты. На фоне низкой активности карбоксили-рования и окисления пирувата в условиях опыта, он аминировался до аланина, который в реакции переаминирования передавал аминогруппу на альфа-кетоглутаровую кислоту с образованием глутаминовой кислоты — универсального донора аминогрупп для других кетокислот. Данная направленность потока пирувата способствовала повышенному синтезу белка, в том числе в печени и в молочной железе.
В пользу такой трактовки полученных данных могут свидетельствовать результаты опыта, проведенного в этом же хозяйстве на коровах, аналогичных по возрасту, продуктивности, периоду лактации и находившихся в рассматриваемом опыте при аналогичных условиях содержания, с использованием идентичного рациона, то есть животные были аналогами ко-
ровам в нашем эксперименте. У коров со среднесуточным удоем 30 л/сут. в крови, взятой из яремной вены утром через 2 ч после кормления, содержание свободных аминокислот, в том числе аспарагиновой и глутаминовой кислот, было ниже, чем у коров с более низким удоем, однако тотальное выведение белка с молоком у коров опытной группы было значительно больше (на 18,4%), а концентрация мочевины в крови меньше на 8,4%. Повышенным на 4,5% было и тотальное выведение с молоком жира (Сизова, 2009).
Таблица 3. Активность пируваткарбоксилазы и лактатдегидрогеназы в плазме крови, их соотношение и содержание ацетальдегида в моче (Ы±8Б, п=3)
Группы коров ПК ЛДГ ПК/ЛДГ Ацетальдегид, мкг/мл
1 2 3 Р 2,57±1,77 1,41±0,34 0,68±0,28 0,05 24,3±9,6 11,8±2,2 16,6±0,8 0,03 0,047±0,025 0,127±0,057 0,037±0,015 0,06 2,39±0,45 2,19±0,09 2,44±0,41
Таблица 4. Тотальное выделение тиамина, пирувата, фолацина с молоком и отношения их концентраций в молоке и в плазме крови (Ы±8Б, п=3)
Группы коров Тиамин Пируват Фолацин Пируват/ тиамин в молоке Пируват/ тиамин в плазме крови
1 9,47±1,79 2 11,1±0,6 3 6,10±0,75 Р 0,05 132±34 85±33 93±46 187±39 132±7 120±16 0,08 14,6±6,4 7,75±3,31 15,3±8,3 38,4±21,8 23,5±8,1 22,9±14,2
Таблица 5. Коэффициенты корреляции между показателями биологических жидкостей у коров, оцененные по объединённым данным (M±m, n=9)
Корреляции Коэффициент
корреляции, г Р
Продуктивность - тиамин в моче -0,709 П 0,033
Продуктивность - пируват в моче 0,745 0,022
Продуктивность - активность ПК в плазме крови 0,743 0,021
Тиамин в моче - концентрация тиамина в молоке 0,679 0,042
Тиамин в моче - концентрация фолацина в молоке 0,817 0,007
Тиамин в моче - активность ЛДГ в плазме крови -0,857 0,003
Пируват в моче - ПК в плазме крови 0,706 0,034
Пируват в моче - фолацин в моче -0,633П 0,025
Активность ПК в плазме крови - концентрация пирувата в плазме крови 0,513П 0,040
Активность ПК - ЛДГ в плазме крови 0,789 П 0,011
Концентрация тиамина в молоке - ПК/ЛДГ 0,764 0,017
Концентрация тиамина в молоке - концентрация пирувата в молоке -0,703 0,035
Концентрация фолацина в молоке - фолацин в моче 0,817 0,007
Концентрация пирувата в плазме крови - ацетальдегид в моче -0,719 0,029
Примечание: П - для расчета использовался коэффициент корреляции Пирсона (это подтверждает линейный характер связи между переменными), в остальных случаях - коэффициент Спирмана.
В другом опыте, проведенном в этом же хозяйстве в это же время на таком же рационе, в группе высокопродуктивных коров была выявлена более низкая концентрация в крови аспарагиновой и глутаминовой кислот, треонина, серина, глицина, в сравнении с группой низкопродуктиных животных. При этом с повышением удоя, также увеличилось и процентное содержание белка и жира в молоке. Суточное выделение с молоком белка было выше на 14%, жира - на 17% (Зеленина, 2011). Эти данные можно интерпретировать в том плане, что снижение концентрации свободных аминокислот в плазме крови было связано с повышенным
поглощением этих аминокислот молочной железой и их использованием на синтез белков молока.
Высокая концентрация ацетальдегида в моче свидетельствует о недостаточной активности окислительного декарбоксилирования пирувата, причем концентрация ацетальдегида в моче не связана с уровнем продуктивности (табл. 3). Но у высокопродуктивных коров более выражено неэффективное использование пирувата (его недоокисление пируватдегидрогена-зой вследствие дефицита ФАД) по сравнению с низкопродуктивными коровами, о чём может свидетельствовать наблюдаемая тенденция к увеличению концентрации пирувата в моче с увеличением удоя (табл. 2). Частичное декарбоксилирование пирувата может осуществляться без окислительной реакции первым ферментом пируватдегидрогеназного комплекса.
Концентрация в плазме крови пирувата отрицательно коррелировала с содержанием ацетальдегида в моче (табл. 5). Это наводит на мысль, что неэффективное использование пирувата было связано не только с недостатком тиамина. Рибофлавин, содержащийся в молоке, является кофактором дигидролипоилдегидрогеназы, входящей в пируватдегидрогеназный полиферментный комплекс. Поэтому можно предположить, что у коров с молоком выводилось большое количество рибофлавина, поскольку у высокоудойныхкоров в большей степени отмечалось снижение концентрации рибофлавина в плазме крови и, очевидно, было ниже его содержание в крови и тканях, чем у среднепродуктивных коров. При достаточном поступлении тиамина возможно усиление реакции декарбоксилирования пировиноградной кислоты; вследствие этого концентрация тиамина в плазме крови будет уменьшаться, но из-за недостатка флавина будет тормозиться процесс окисления пирувата с накоплением ацетальдегида.
Образование ацетальдегида в организме у жвачных возможно из ацетил-КоА за счет усиленного дрожжевого брожения в рубцовом содержимом в процессе ферментации, в частности лактобациллами Ь. Ъиекпеп (Вайсбах, 2012). Другие микроорганизмы при воздействии пируватдекарбоксилазы осуществляют неокислительное декарбоксилирование пирувата и других альфа-кетокислот (Островский, 1979). Образующийся при этом ацетальдегид успевает частично нейтрализоваться в печени под действием ферментов, утилизирующих ацетальде-гид, например, альдегидоксидазы, ксантиноксидазы, НАД-зависимой альдегиддегидрогеназы (Мицуля, 2010). Ранее было предположено, что накопление ацетальдегида в крови в первую очередь связано с интенсификацией рубцового брожения (Рябых, Дудин, 2013). Однако в этой работе не приведены данные по показателям рубцового пищеварения у исследуемых животных, а заключение авторы делают на основании отсутствия существенной корреляции между уровнем пирувата и ацетальдегида в крови. Авторы утверждают, что пируват не является эндогенным источником ацетальдегида, а наличие корреляции между тиамином и аце-тальдегидом как в молоке, так и в плазме крови склоняет авторов к заключению о рубцовом происхождении тиамина и ацетальдегида. В нашем эксперименте не было выявлено существенной корреляции между концентрацией ацетальдегида и тиамина в моче, но ацетальдегид коррелировал с концентрацией пирувата в крови (табл. 5).
На рис. 1 представлена схема корреляционных взаимосвязей между измеренными в опыте показателями, которая даёт определённые основания для интерпретации взаимосвязей между метаболизмом пировиноградной кислоты и уровнем витаминов в жидкостях тела у коров с разным уровнем продуктивности. Повышение молочной продуктивности сопровождается интенсификацией обменных процессов в организме коров, на что указывает увеличение активности ПК и ЛДГ в плазме крови. Для интенсификации синтеза белка и других компонентов молока требуетсяповышенное обеспечение энергией. Окисляясь на начальных этапах цикла Кребса, пируват может служить источником энергии для процессов синтеза, и он также может карбоксилироваться и в виде оксалоацетата поддерживать общий поток метаболитов в этомцикле. Однако в нашем опыте активность пируваткарбоксилазы была очень низкой. Следовательно, и окисление пирувата в цикле Кребса, катализируемое пируватдегидро-геназой, также было низкое. У высокопродуктивных животныхвозрастало тотальное выведение тиамина и фолацина с молоком в сравнении с низкопродуктиными коровами и, несмотря
на компенсаторное уменьшение выведения их с мочой, в организме создавался дефицит этих витаминов.
Рис. 1. Корреляционные связи между изучаемыми показателями. На схеме показано только направление связи, численные значения приведены в табл. 5.
Недостаток тиамина приводит к снижению активности ПДГ, так как тиамин является кофактором первого фермента в пируватдегидрогеназном комплексе. Поэтому увеличение концентрации пирувата в плазме крови, моче и молоке можно объяснить спадом активности пируватдегидрогеназного комплекса и ПК, при этом с мочой выделялось повышенное количество ацетальдегида - продукта недоокисления пирувата. Происходило декарбоксилирова-ние пировиноградной кислоты, но образующийся активный ацетальдегид не подвергался полному окислению последующими ферментами пируватдегидрогеназного ферментого комплекса, а это может свидетельствовать о недостаточной обеспеченности процессов не только тиамином, но и рибофлавином, который является кофактором третьего фермента пируватде-гидрогеназного комплекса - дигидролипоилдегидрогеназы, переносящей водород с активного ацетальдегида на НАД.
Несмотря на низкую активность пируваткарбоксилазы, сниженная величина отношения ПК/ЛДГ может свидетельствовать о преимущественной направленности потока пирувата по пути окисления в цикле Кребса. С другой стороны, этого не могло происходить из-за низкой активности ПДГ. Поэтому можно предположить, что пировиноградная кислота поддерживала реакции цикла Кребса, обеспечивая процессы синтеза энергиейпо метаболическому пути пируват - оксалоацетат - цитрат. Однако изоцитратдегидрогеназа, обладая низкой активностью, лимитирует пропускную способность цикла Кребса. В связи с этим, из-за недостатка энергии обмен веществ у высокоудойной коровы испытывал большое напряжение, и в данной метаболической ситуации, вероятно, происходил сдвиг потока утилизации пировино-градной кислоты в направлении реакций аминирования и переаминирования с интенсификацией использования аминокислот на синтез белка.
Таким образом, полученные данные показывают, что в данных условиях тиамин и фолацин тесно связаны с метаболизмом пировиноградной кислоты. Причастен к этому процессу и предполагаемо дефицитный, но не определявшийся в нашем эксперименте рибофлавин. В условиях опыта у высокопродуктивных животных повышалось выделение тиамина и
фолацина с молоком. При этом, несмотря на компенсаторное уменьшение выведения их с мочой, в организме коров создавался дефицит этих витаминов. Низкое отношение ПК/ЛДГ в группах (0,037-0,127) свидетельствует о преимущественном использовании пирувата не на синтез глюкозы, а на метаболизацию через оксалоацетат в цикле Кребса. Наблюдался дефицит тиамина и фолацина во всех группах, особенно у высокопродуктивных коров. Недостаточность тиамина и рибофлавина привела к снижению активности пируватдегидрогеназы и повышенному выделению ацетальдегида с мочой. Вследствие низкой активности ПК и ЛДГ происходило накопление пирувата в кровии повышенное выведение его с мочой. Полученные результаты позволяют предположить, что в условиях опыта по мере увеличения молочной продуктивности происходил сдвиг потока утилизации пировиноградной кислоты в направлении реакций аминирования и переаминирования. Данная направленность метаболизма пиру-вата способствовала повышенному синтезу белка, в том числе в печени и в молочной железе.
ЛИТЕРАТУРА
1. Агафонов В.И., Заболотнов Л.А., Кальницкий Б.Д., Кузнецов С.Г., Лысов А.В., Макар З.Н., Матери-кин А.М., Решетов В.Б., Харитонов Е.Л., Харитонов Л.В., Черепанов Г.Г. Физиологические потребности в питательных веществах и нормирование питания молочных коров. - Боровск, 2001. - 136 с.
2. Вайсбах Ф. Будущее консервирования кормов // Проблемы биологии продуктивных животных. -2012. - № 2. - С. 49-73.
3. Галочкина В.П. Определение активности пируваткарбоксилазы (способ 2). В сб.: Методы биохимического анализа (справочное пособие) (ред. Б.Д. Кальницкий). - Боровск: ВНИИФБиП, 1997. - С. 245-249.
4. Галочкина В.П., Матвеев В.А., Радченков В.П. Секреция гормонов и активность ферментов углеводного обмена в крови бычков при разном уровне кормления и в зависимости от интенсивности роста // Тезисы докладов: III межд. конф.: Актуальные проблемы биологии в животноводстве. - Боровск, 2000. - С. 277-278.
5. Галочкина В.П., Солодкова А.В., Обвинцева О.В., Сухих В.Ф. Индексы состояния метаболизма и резистентности у холмогорских бычков в период становления рубцового пищеварения при интенсивном выращивании с использованием комбикорма на основе горохе // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2012. - № 3. - С. 87-96.
6. Долгова С.И. Биосинтез и использование витаминов В3, В6и В12. у лактирующих коров при разных условиях питания: автореф. дисс... к.б.н. - Боровск, 2001. - 21 с.
7. Зеленина А.С. Влияние скармливания «защищенных» белковых кормов на биохимический профиль крови, молочную продуктивность и технологические свойства молока коров // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2011. - № 3. - С. 78-84.
8. Мицуля Т.П. Взаимосвязь показателей углеводного, липидного и азотистого обменов с уровнем эндогенных этанола и ацетальдегида в крови у крупного рогатого скота разного возраста и пола: автореф. дисс. к.б.н. - М., 2010. - 21 с.
9. Островский Ю.М. Тиамин. В сб.: Экспериментальная витаминология (ред. Ю.М. Островский). -Минск: Наука и техника, 1979. - С. 176-223.
10. Петрунькина А.И. Практическая биохимия. - Л.: Медгиз, 1961. - 225 с.
11. Рябых Т.Е., Дудин В.И. Обеспеченность молочных коров витамином В! и загрязненность молока аце-тальдегидом (мониторинговое исследование) // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2013.
- № 2. - С. 76-84.
12. Сизова Ю.В. Влияние аминокислотного состава обменного протеина на азотистый обмен и молочную продуктивность у высокопродуктивных коров // Проблемы биологии продуктивных животных. - 2009.
- № 4. - С. 53-58.
13. Степанова Е.Н., Григорьева М.П., Коновалова Л.В. Фолацин. В сб.: Тиамин. Экспериментальная витаминология (ред. Ю.М. Островский). - Минск: Наука и техника, 1979. - С. 345-384.
14. Халафян А. А. STATISTICA. Статистический анализ данных. - М: ООО «Бином-Пресс», 2010. - 528 с.
15. Castagnino D.S., Seck M., Beaudet V., Kammes K.L., Linton J.A., Allen M.S., Gervais R., Chouinard P.Y., Girard C.L. Effects of forage family on apparent ruminal synthesis of B vitamins in lactating dairy cows // J. Dairy Sci. - 2016. - Vol. 99.- No. 3. - P. 1884-1894.
16. Depeint F., Bruce W.R., Shangari N., Mehta R., O'Brien P.J. Mitochondrial function and toxicity: role of the B vitamin family on mitochondrial energy metabolism // Chem. Biol. Interact. - 2006. - Vol. 163. -No. 1-2. - P. 94-112.
17. Girard C.L., Matte J.J. Impact of B-vitamin supply on major metabolic pathways of lactating dairy cows // Can. J. Аnim. Sci. - 2006. - Vol. 86. - No. 2. - P. 213-220.
18. Hershkowitz E., Markel A. Thiamine -"the road experience" of the vitamin as a manifestation of deficiency in a world of abundance // Harefuah. - 2015. - Vol. 154. - No. 10. - P. 661-674.
19. Santschi D.E., Berthiaume R., Matte J.J., Mustafa A.F., Girard C.L. Fate of supplementary B-vitamins in the gastrointestinal tract of dairy cows // J. Dairy Sci. - 2005. - Vol. 88. - No. 6. - P. 2043-2054.
20. Scrutton M.C. Wnite D.M. Pyruvate carboxylase cpecific inactivation of acetyl-CoA-dependent oxaloace-tate synthesis during modification of the enzyme by trinitrobensene sulfonate // J. Biol. Chem. - 1973. - Vol. 248. - No. 15. - P. 541-544.
21. Shaver R.D., Bal M.A. Effect of dietary thiamin supplementation on milk production by dairy cows // J. Dairy Sci. - 2000. - Vol. 83. - No. 10. - P. 2335-2340.
22. Strusinska D., Kaliniewicz J., Skok A. Milk yield and composition, and the serum concentration of lipids in cows fed diets supplemented with minerals and vitamins // Med.Weter. - 2006. - Vol. 62. - No. 2. - P. 179-184.
23. Tafaj M., Schollenberger M., Feofilowa J., Zebeli Q., Steingass H., Drochner W. Relationship between-thiamine concentration and fermentation patterns in the rumen fluid of dairy cows fed with graded concentrate levels // J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berlin). - 2006. - Vol. 90. -No. 7-8. - P. 335-343.
24. Tylicki A., Siemieniuk M. Thiamine and its derivatives in the regulation of cell metabolism // Postepy Hig Med Dosw (Online). -2011. - Vol. 65. - P. 447-469.
REFERENCES
1. Agafonov V.I., Zabolotnov L.A., Kal'nitskii B.D., Kuznetsov S.G., Lysov A.V., Makar Z.N., Materikin A.M., Reshetov V.B., Kharitonov E.L., Kharitonov L.V., Cherepanov G.G. Fiziologicheskie potrebnosti v pitatel'nykh veshchestvakh i normirovanie pitaniya molochnykh korov (Physiological nutritional needs and food rationing for dairy cows). Borovsk, 2001, 136 p.
2. Castagnino D.S., Seck M., Beaudet V., Kammes K.L., Linton J.A., Allen M.S., Gervais R., Chouinard P.Y., Girard C.L. Effects of forage family on apparent ruminal synthesis of B vitamins in lactating dairy cows. J. Dairy Sci. 2016, 99(3): 1884-1894.
3. Depeint F., Bruce W.R., Shangari N., Mehta R., O'Brien P.J. Mitochondrial function and toxicity: role of the B vitamin family on mitochondrial energy metabolism. Chem. Biol. Interact. 2006, 163(1-2): 94-112.
4. Dolgova S.I. Biosintez i ispol'zovanie vitaminov B3, B6 i B12 u laktiruyushchikh korov pri raznykh uslo-viyakh pitaniya (Biosynthesis and utilization of vitamins B3, B6 and B12 in lactating cows under different nutritional conditions). Extended Abstract of Diss. Cand. Sci. Biol., Borovsk, 2001, 25 p.
5. Galochkina V.P. In: Metody biokhimicheskogo analiza (spravochnoe posobie). Borovsk: VNIIFBP Publ., 1997, P. 245-249.
6. Galochkina V.P., Matveev V.A., Radchenkov V.P. In: Tezisy dokladov: Ill mezhd. konf.: Aktual'nyeprob-lemy biologii v zhivotnovodstve (Proc. III Intern. Conf.: Actual problems of biology in animal husbandry). Borovsk, 2000, P. 277-278.
7. Galochkina V.P., Solodkova A.V., Obvinceva O.V., Suhih V.F. Problemy biologiiproduktivnyh zhivotnyh - Problems of Productive Animal Biology. 2012, 3: 87-96.
8. Girard C.L., Matte J.J. Impact of B-vitamin supply on major metabolic pathways of lactating dairy cows. Can. J. Anim. Sci. 2006, 86 (2): 213-220.
9. Hershkowitz E., Markel A. Thiamine - "the road experience" of the vitamin as a manifestation of deficiency in a world of abundance. Harefuah. 2015, 154(10): 661-674.
10. Khalafyan A.A. STATISTICA. Statisticheskii analiz dannykh (Statistical analysis). Moscow: OOO Binom-Press Publ., 2010, 528 p.
11. Mitsulya T.P. Vzaimosvyaz' pokazatelei uglevodnogo, lipidnogo i azotistogo obmenov s urovnem endo-gennykh etanola i atsetal 'degida v krovi u krupnogo rogatogo skota raznogo vozrasta i pola (Relationship of the carbohydrate, lipid and nitrogen metabolism with the endogenous levels of acetaldehyde and etha-nol in the blood of cattle of all ages and sex). Extended Absract of Diss. Cand. Sci. Biol., Moscow, 2010, 26 p.
12. Ostrovskii Yu.M. [Tiamin]. In: Eksperimental'naya vitaminologiya (red. Yu.M.Ostrovskii) (Experimental vitaminology, Ed. Ju.M. Ostrovsky). Minsk: Nauka i tekhnika Publ., 1979, P. 176-223.
13. Petrun'kina A.I. Prakticheskaya biokhimiya. Leningrad: Medgiz Publ., 1961, 225 p.
14. Ryabykh T.E., Dudin V.I. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2013, 2: 76-84.
15. Santschi D.E., Berthiaume R., Matte J.J., Mustafa A.F., Girard C.L. Fate of supplementary B-vitamins in the gastrointestinal tract of dairy cows. J. Dairy. Sci. 2005, 88(6): 2043-2054.
16. Scrutton M.C. Wnite D.M. Pyruvate carboxylase cpecific inactivation of acetyl-CoA-dependent oxaloace-tate synthesis during modification of the enzyme by trinitrobensene sulfonate. J. Biol. Chem. 1973, 248(15): 541-544.
17. Shaver R.D., Bal M.A. Effect of dietary thiamin supplementation on milk production by dairy cows. J. Dairy Sci. 2000, 83(10): 2335-2340.
18. Sizova Ju.V. Problemy biologii produktivnyh zhivotnyh - Problems of Productive Animal Biology. 2009, 4: 53-58.
19. Stepanova E.N., Grigor'eva M.P., Konovalova L.V. [Folacin]. In: Eksperimental'naya vitaminologiya (red. Yu.M.Ostrovskii) (Experimental vitaminology, Ed. Ju.M. Ostrovsky). Minsk: Nauka i tekhnika Publ., 1979, 345-384.
20. Strusinska D., Kaliniewicz J., Skok A. Milk yield and composition, and the serum concentration of lipids in cows fed diets supplemented with minerals and vitamins. Med.Weter. 2006, 62(2): 179-184.
21. Tafaj M., Schollenberger M., Feofilowa J., Zebeli Q., Steingass H., Drochner W. Relationship between thiamine concentration and fermentation patterns in the rumen fluid of dairy cows fed with graded concentrate levels. J. Anim. Physiol. Anim. Nutr. (Berlin). 2006, 90(7-8): 335-343.
22. Tylicki A., Siemieniuk M. Thiamine and its derivatives in the regulation of cell metabolism. Postepy Hig. Med. Dosw. (Online). 2011, 65: 447-469.
23. Vaisbakh F. [Future of feed conservation]. Будущее консервирования кормов. Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology. 2012, 2: 49-73.
24. Zelenina A.S. Problemy biologii produktivnyh zhivotnyh - Problems of Productive Animal Biology. 2011, 3: 78-84.
Assessment of thiamine and folacin availability and metabolism of pyruvic acid in cows in connection with milk production
Galochkina V.P., Agafonovа A.V., Dudin V.I.
Institute of Physiology, Biochemistry and Animal Nutrition, Borovsk Kaluga oblast, Russian Federation
ABSTRACT. The experiment was conducted on three groups of Black-and-White cows, 3 cows each, in the first third of lactation with daily milk yield 44.3±1.5; 35.0±0.6 and 26.3±3.2 kg (M±SD) in I, II and III groups respectively. Thiamine, folacin, pyruvate and acetaldehyde were determined in milk, blood plasma and urine, the activity of pyruvate carboxylase (PC) and lactate dehydrogenase (LDH) was determined in the presence of NAD. In high producing animals, the excretion of thiamine and folacin in milk was raised compared to low producing cows, and despite of compensatory decrease of urinary excretion, a deficiency of these vitamins was created in the organism. The low ratio of PC/LDH in groups (0.037-0.127) shows that the predominant use of pyruvate was in the synthesis of glucose and in the metabolization via oxaloacetate in the Krebs cycle. There was a lack of thiamine and folacin in all groups, especially in high producing cows. Thiamine deficiency reduced pyruvate dehydrogenase activity and increased output of acetaldehyde with urine. Due to the low activity of PC and LDH, there was an accumulation of pyruvate in blood serum and increased urinary excretion of pyruvate. These results suggest that in the experimental conditions with increasing milk production, the flux of pyruvate utilization shifted in the direction of transamination reactions. This shifts in pyruvate metabolism facilitated increased protein synthesis in the liver and mammary gland.
Keywords: dairy cows, vitamins, thiamine, folacin, metabolism, pyruvate, acetaldehyde Problemy biologii productivnykh zhivotnykh - Problems of Productive Animal Biology, 2016, 1: 65-75
Поступило в редакцию: 11.01.2016 Получено после доработки: 10.02.2016
Галочкина Валентина Петровна, д.б.н., с.н.с., т. 8(915)892-66-00
Агафонова Анастасия Викторовна, к.б.н., с.н.с., т. 8(953)319-87-60; [email protected]
Дудин Виталий Иванович, д.б.н., в.н.с., т. 8(905)643-10-83; [email protected]
