CC BY
36DOI 10.54500/2790-1203.S1.2022.129-141 МРНТИ 34.51.15+76.03.35 УДК 547. 962. 9-018: 577. 462
ОЦЕНКА КОЛЛАГЕНОВЫХ ВОЛОКНИСТЫХ СТРУКТУР СОЕДИНИТЕЛЬНОЙ ТКАНИ МЫШЕЙ C57BL/6J В УСЛОВИЯХ НЕВЕСОМОСТИ
Д.Б. Никитюк1'2, В.В. Шишкина3, С.В. Клочкова4'5, Н.Т. Алексеева3, Е.Е. Иванова3, Л.Н. Антакова3
1 Федеральное государственное бюджетное учреждение науки Федеральный исследовательский центр питания, биотехнологии и безопасности пищи, Российская Федерация, 109240, Москва, Устьинский пр. 2/14
2Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования Первый Московский государственный медицинский университет имени И.М. Сеченова Министерства здравоохранения Российской Федерации (Сеченовский Университет), Российская Федерация, 119991, Москва, Трубецкая 8, стр. 2
3Федеральное государственное бюджетное образовательное учреждение высшего образования «Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко» Министерства здравоохранения Российской Федерации, Российская Федерация, 394066, Воронеж, Студенческая 10
4Федеральное государственное автономное образовательное учреждение высшего образования «Российский университет дружбы народов», Российская Федерация, 117198 Москва, Миклухо-Маклая 6
Государственное автономное учреждение здравоохранения города Москвы «Московский научно-практический центр медицинской реабилитации, восстановительной и спортивной медицины Департамента здравоохранения города Москвы», Российская Федерация, 105120, Москва, Земляной вал 53
1'2Никитюк Дмитрий Борисович - член-корреспондент РАН, доктор медицинских наук, профессор, директор ФГБУН «ФИЦ питания и биотехнологии», профессор кафедры оперативной хирургии и топографической анатомии ФГАОУ ВО «Первый Московский государственный университет им. И.М. Сеченова» Минздрава России (Сеченовский университет), e-mail: nikitiuk@ ion.ru. ORCID 0000-0002-2259-1222
3Шишкина Виктория Викторовна - кандидат медицинских наук, доцент, доцент кафедры гистологии, директор Научно-исследовательского института экспериментальной биологии и медицины (НИИ ЭБМ) ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава России, e-mail: 4128069@gmail.com. ORCID 0000-0001-9185-4578
4'5Клочкова Светлана Валериевна - доктор медицинских наук, профессор кафедры анатомии человека Медицинского института ФГАОУ ВО РУДН, старший научный сотрудник отдела спортивной медицины и клинической фармакологии ГАУЗ «Московский научно-практический центр медицинской реабилитации, восстановительной и спортивной медицины ДЗМ», e-mail: swetlana.chava@yandex.ru. ORCID 0000-0003-2041-7607
3Алексеева Наталия Тимофеевна - доктор медицинских наук, профессор, заведующий кафедрой нормальной анатомии человека ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава РФ, e-mail: alexeevant@Jist.ru. ORCID 0000-0003-1510-8543
3Иванова Елена Евгеньевна - кандидат медицинских наук, старший научный сотрудник НИИ ЭБМ, ассистент кафедры гистологии ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава РФ, e-mail: 89155888871@mail.ru. ORCID 0000-0001-8920-8059
3Антакова Любовь Николаевна - кандидат биологических наук, старший научный сотрудник, заведующая лабораторией постгеномных исследований НИИ ЭБМ ФГБОУ ВО ВГМУ им. Н.Н. Бурденко Минздрава РФ, e-mail: tsvn@bk.ru. ORCID 0000-0001-5212-1005
Изучение физиологических механизмов перестройки волокнистого компонента и межклеточного матрикса соединительной ткани позволяет открыть новые пути эффективной реализации функциональных способностей ткани, в том числе регенерационных процессов в условиях невесомости.
Цель: оценить коллагеновые волокнистые структуры соединительной ткани мышей C57BL/6J в условиях невесомости.
Материал и методы: проведен морфологический анализ дермы кожи мышей линии C57BL/6J эксперимента Rodent Research-4 групп орбитального полета и контроля с применением окрашивания
пикросириус красный и комбинации импрегнация серебром и толуидиновым синим для визуализации фибриллогенеза коллагена I и III типов.
Результаты. Дерма мышей всех контрольных групп имела хорошо выраженный коллагеново-эластический волоконно-фибриллярный волокнистый каркас с преобладанием коллагена I типа. Поверхность волокон имела ярко выраженный продольный рельеф с хорошо развитой системой поперечных фибрилл. Волокнистый компонент соединительной ткани дермы кожи животных группы космического полета отреагировал изменением соотношения I и III типов коллагенов в сторону увеличения незрелого коллагена III типа (80,8% vs 19,2%) по сравнению с группами контроля (89% vs 12%). Обращала на себя внимание и разобщенность эластических волокон с коллагенами, что может свидетельствовать о процессах ремоделирования волокнистого компонента в измененных условиях воздействия гравитации.
Заключение: получены данные, свидетельствующие о сенситивности волокнистых и клеточных компонентов соединительной ткани к условиям невесомости.
Ключевые слова: невесомость, волокнистый компонент дермы, фибробласт, тучные клетки, коллаген.
EVALUATION OF COLLAGEN FIBROUS STRUCTURES OF CONNECTIVE TISSUE OF C57BL/6J MICE IN ZERO GRAVITY
D. Nikityuk1'2, V. Shishkina3, S. Klochkova4'5, N. Alekseeva3, E. Ivanova3, L. Antakova3
1Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Russian Federation 109240 Moscow, Ustinsky ave . 2/14
2I.M. Sechenov First Moscow State Medical University (Sechenov University), Russian Federation 119991 Moscow, Trubetskaya 8, p.2
3N.N. Burdenko Voronezh State Medical University, Russian Federation 394066 Voronezh, Studentskaya 10
4Peoples' Friendship University of Russia (RUDN University), Russian Federation 117198 Moscow, Miklukho-Maklaya 6
5Moscow Centre for Research and Practice in Medical Rehabilitation, Restorative and Sports Medicine of Moscow Healthcare Department, Russian Federation 105120 Moscow, Earthen rampart 53
7,2Dmitriy B. Nikityuk - Corresponding Member of the Russian Academy of Sciences, Doctor of Medical Sciences, Professor, Director of the Federal Research Centre of Nutrition, Biotechnology and Food Safety, Professor of the Department of Operative Surgery and Topographic Anatomy of the I.M. Sechenov First Moscow State Medical University of Ministry of Healthcare of the Russian Federation (Sechenov University), e-mail: nikitjuk@ion.ru , ORCID 0000-00022259-1222
3Victoria V. Shishkina - Candidate of Medical Sciences, Associate Professor, Associate Professor of the Department of Histology, Director of the Research Institute of Experimental Biology and Medicine of the N.N. Burdenko Voronezh State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, e-mail: 4128069@gmail.com, ORCID 0000-0001-9185-4578
^Svetlana V. Klochkova - Doctor of Medical Sciences, Professor of the Department of Human Anatomy of the Medical Institute Peoples' Friendship University of Russia, Senior Researcher of the Department of Sports Medicine and Clinical Pharmacology of the Moscow Center for Research and Practical in Medical Rehabilitation, Restorative and Sports Medicine of Moscow Healthcare Department, e-mail: swetlana.chava@yandex.ru, ORCID 0000-0003-2041-7607
^Natalia T. Alekseeva - Doctor of Medical Sciences, Professor, Head of the Department of Normal Human Anatomy of N.N. Burdenko Voronezh State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, e-mail: alexeevant@list.ru, ORCID 0000-0003-1510-8543
3Elena E. Ivanova - Candidate of Medical Sciences, Senior Researcher Research Institute of Experimental Biology and Medicine, Assistant at the Department of Histology of the N.N. Burdenko Voronezh State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, e-mail: 89155888871@mail.ru , ORCID 00000001-8920-8059
3Lyubov N. Antakova - Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Head of the Laboratory of Postgenomic Research of the Research Institute of Experimental Biology and Medicine of N.N. Burdenko Voronezh State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, e-mail: tsvn@bk.ru , ORCID 00000001-5212-1005
The study of the physiological mechanisms of the restructuring of the fibrous component and the intercellular matrix of connective tissue allows us to discover new ways to effectively implement the functional abilities of the tissue, including regenerative processes in zero gravity.
Objective: to evaluate the collagen fibrous structure of the connective tissue of C57BL/6j mice in zero gravity.
Material and methods: C57BL/6j line for visualization of collagen fibrillogenesis types I and III morphological analysis of mouse dermis Rodent Research experiment-group 4 orbital flight and observation of picrosiria was carried out using a combination of red paint and impregnation of silver and toluidine blue.
Results: in the dermis of mice of all control groups, collagen prevailed-an elastic fibrousfibrillar fibrous framework with a predominance of type I collagen. There was a longitudinal relief on the surface of the fibers with a well-developed system of transverse fibrils. The fibrous component of the connective tissue of the dermis of the skin of the animals of the spaceflight group changed the ratio of collagen types I and III compared to the control groups (89% vs 12%) with the growth of imperfect type III collagen (80.8% vs 19.2%). I drew attention to the splitting of elastic fibers by collagens, which may indicate the processes of restoration of the fibrous component when gravity changes.
Conclusion: data reflecting the sensitivity of fibrous and cellular components of connective tissue to the conditions of weightlessness have been obtained.
Keywords: weightlessness, fibrous component of the dermis, fibroblast, mast cells, collagen.
САЛМАЦСЫЗДЫЩ ЖАГДАЙЫНДА C57BL/6J ТЫШЦАНДАРЫНЫЦ ДЭНЕКЕР Т1НШЩ КОЛЛАГЕН ТАЛШЫЩТЫ Ц¥РЫЛЫМЫН БАГАЛАУ
Д.Б. Никитюк1'2, В.В. Шишкина3, С.В. Клочкова4'5, Н.Т. Алексеева3, Е.Е. Иванова3, Л.Н. Антакова3
^амактану, Биотехнология жэне тамак ешмдершщ каушаздш федералды зерттеу орталыгы, Ресей Федерациясы 109240 Мэскеу, Устинский дацгылы, 2/14 YЙ
2Бiрiншi Мэскеу мемлекетпк медицина университета И. М. Сеченова (Сеченов университет!), Ресей Федерациясы 119991 Мэскеу, Трубецкая, 8^й, 2-бет
3Воронеж мемлекетпк медицина университета Н. Н. Бурденко, Ресей Федерациясы 394066 Воронеж, Студенческая, 10
4Ресей халыктар достыгы университет (РУДН), Ресей Федерациясы 117198 Мэскеу, Миклухо-Маклая, 6
5Мэскеу каласыныц Денсаулык сактау департаментшщ медициналык оцалту, калпына келтiру жэне спорттык медицина Мэскеу гылыми-практикалык орталыгы, Ресей Федерациясы 105120 Мэскеу, Земляной вал, 53
-^Никитюк Дмитрий Борисович - Ресей Fылым академиясыныц корреспонденг-мYшесi, медицина гылымдарыныц докторы, профессор, тамактану, Биотехнология жэне тамак ешмдершщ каушаздт федералды зерттеу орталыгыныц директоры, алгашкъ Мэскеу мемлекетпк медицина университетшщ жедел хирургия жэне топографиялык анатомия кафедрасыныц профессоры. И. М. Сеченова Ресей Федерациясы Денсаулык сактау министрлтнщ (Сеченов университет), e-mail: niMtjuk@ion.ru , ORCID 0000-0002-2259-1222
■Шишкина Виктория Викторовна - медицина гылымдарыныц кандидаты, доцент, гистология кафедрасыныц доценп, ВГМУ эксперименттк биология жэне медицина гылыми-зерттеу институтыныц директорах, Н. Н. Бурденко Ресей Денсаулык сактау министрлт, e-mail: 4128069@gmail.com, ORCID 0000-0001-9185-4578
4,5Клочкова Светлана Валериевна - медицина гылымдарыныц докторы, Ресей халыктар доступы университет! медицина институтыныц Адам анатомиясы кафедрасыныц профессоры, Мэскеу каласы Денсаулык сактау департаментшщ медициналык оцалту, калпына келтру жэне спорттык медицина Мэскеу гылыми-практикалык орталыгыныц спорттык медицина жэне клиникалык фармакология бел!мшщ ага гылыми кызметкер!, e-mail: swetlana.chava@yandex.ru, ORCID 0000-0003-2041-7607
3Алексеева Наталия Тимофеевна - медицина гылымдарыныц докторы, профессор, Воронеж мемлекетпк медицина университетшщ адамныц калыпты анатомиясы кафедрасыныц мецгерушта. Н. Н. Бурденко Ресей Федерациясы Денсаулык сактау мижстрлш, e-mail: alexeevant@list.ru, ORCID 0000-0003-1510-8543
^Иванова Елена Евгеньевна - медицина гылымдарыныц кандидаты, Экспериментпк биология жэне медицина FЗИ ага гылыми кызметкер! Воронеж мемлекетпк медицина университетшщ гистология кафедрасыныц ассистент!. Н. Н. Бурденко Ресей Федерациясы Денсаулык сактау министрлт, e-mail: 89155888871@mail.ru , ORCID 0000-0001-89208059
3Антакова Любовь Николаевна - биология гылымдарыныц кандидаты, ага гылыми кызметкер, Воронеж мемлекетпк медицина университетшщ Эксперименттк биология жэне медицина FЗИ постгеномдык зерттеулер зертханасыныц мецгерушта. Н. Н. Бурденко Ресей Федерациясы Денсаулык сактау министрлт, e-mail: tsvn@bk.ru , ORCID 0000-0001-5212-1005
Талшыкты компонент пен дэнекер тшшщ жасушааралык матрицасын кайта к^рудыц физиологиялык механизмдерш зерттеу ¥лпаныц функционалды кабшеттерш, оныц !ш!нде салмаксыздык жагдайында калпына келпру процестерш тшмд! жYзеге асырудыц жаца жолдарын ашуга мYмкiндiк бередг
Максаты: салмаксыздык жагдайында c57bl/6j тышкандарыныц дэнекер тшшщ коллаген талшыкты кдоылымын багалау.
Материал жэне эдктерк I жэне III типтi коллаген фибриллогенезiн визуализациялау Yшiн c57bl/6j желiсi тышкандар дерма Tepi морфологиялык талдау rodent Research эксперимент-4 тобы орбиталык ^шу жэне бакылау пикросириус кызыл бояу жэне KYMic жэне толуидин кек импрегнация комбинациясы аркылы жYpгiзiлдi.
Нэтижелер: барлык бакылау топтарыныц тышкандарыныц Дepмиciндe I типп коллагeннiц басым коллагeндi-cepпiмдi талшыкты-фибриллярлы талшыкты жактау болды. Талшыктардыц бeтiндe жаксы дамыган келденец фибриллалар жYЙeci бар бойлык рельеф болды. Fаpыштык ¥шу тобыныц жануарлар тepiciнiц дepмиciнiц дэнекер тшшщ талшыкты компонeнтi I жэне III коллаген тYpлepiнiц аракатынасын бакылау топтарымен (89% vs 12%) салыстырганда жeтiлмeгeн III типтi коллагeннiц (80,8% vs 19,2%) еcуiнe карай езгертт! Мен cepпiмдi талшыктардыц коллагендермен белшуше назар аудардым, б^л ауырлык кушшщ езгерген жагдайында талшыкты компонeнттi калпына кeлтipу пpоцecтepiн кеpceтуi мYмкiн.
^орытынды: дэнекер тiнiнiц талшыкты жэне жасушалык компонeнттepiнiц салмаксыздык жагдайларына ceзiмталдыFын керсететш мэлiмeттep алынды.
ТYЙiндi сездер: салмаксыздык, дермистщ талшыкты компонeнтi, фибробласт, мастикалык жасушалар, коллаген.
Corresponding author: Lyubov N. Antakova - Candidate of Biological Sciences, Senior Researcher, Head of the Laboratory of Postgenomic Research Research Institute of Experimental Biology and Medicine of N.N. Burdenko Voronezh State Medical University of the Ministry of Healthcare of the Russian Federation, Russian Federation 394066 Voronezh, Studentskaya 10; e-mail: tsvn@bk.ru, ORCID 0000-0001-5212-1005
Resteved 14.06.2022
Accepted 20.06.2022
Bibliographic reference: Оценка коллагеновых волокнистых структур соединительной ткани мышей C57bl/6j в условиях невесомости/Никитюк Д.Б., Шишкина В.В., Клочкова С.В. и др. //Астана медициналык журналы. - 2022. - Спецальный выпуск. - № 1. - С. 129-141.
Актуальность
Волокнистые структуры всех типов соединительной ткани представляют собой основные конструкционные элементы, позволяющие реализовывать биомеханическую функцию, определяющую возможности того или иного органа. Гистохимические методы светооптической микроскопии, которые впервые стали использоваться с конца XIX века и актуальны в настоящее время, позволяют выявлять главный компонент фибриллярных волокон - коллаген I типа. Однако, обнаружение коллагена III типа, присутствующего вместе с коллагеном I и входящим в состав ретикулярных волокон представлялось невозможным для совместной визуализации и оценки. В 1964 году Ф. Свитом и Х. Пухтлером был предложен новый краситель для окрашивания гистологических микропрепаратов - пикросириус красный. Впервые способ обнаружения и последующего анализа коллагеновых волокон, окрашенных с использованием комбинации окрашивания пикросириус красный и поляризационной микроскопии был описан Ь. С. 1ип§ие1га [1]. В настоящее время, с развитием технологий анализа изображений, этот метод продолжает использоваться для идентификации и анализа анизотропии волокон и их ориентации на препаратах, полученных из образцов тканей. Коллаген является одним из важнейших компонентов внеклеточного матрикса ткани. Он обеспечивает прочность, эластичность и гистоархитектонику ткани, позволяя ей выдерживать износ от внешних факторов, таких как физический стресс, а также от внутренних стрессовых факторов, таких как воспаление или другие патологические состояния [2]. Функциональные особенности секретома тучных клеток (ТК) позволяют им выступать в качестве индукторов и регуляторов важнейших физиологических и патологических процессов, среди которых координация гомеостаза тканевого микроокружения, реализация врожденного и адаптивного иммунитета, инициация и последующее развитие воспалительных и аллергических реакций, ангиогенез, клеточная пролиферация и др. [3]. Вместе с этим ряд компонентов секретома, включая протеогликаны, специфические протеазы, TGF-P и др. принимают как прямое, так и опосредованное участие в изменении структуры стромы внутренних органов, наделяя тучные клетки особыми потенциями в аспекте ремоделирования межклеточного матрикса
[3]. Частая ассоциация показателей численности ТК с интенсивностью фиброзных изменений соответствующих органов позволила предположить их активную вовлеченность в индукцию биогенеза коллагеновых белков и внеклеточных этапов фибриллогенеза [3]. Этим определяется важность разработки и внедрения в морфологическую практику методических приемов, способствующих конкретизации точек приложения селективных эффектов ТК в процессе образования коллагеновых волокон, а также более объективной оценке их вклада в развитие патологических процессов с прогрессирующим фиброзированием тканей.
Космические полеты, имеющие тенденцию к увеличению продолжительности времени пребывания в условиях с измененной гравитацией ставят перед научным сообществом задачи, связанные с разработкой мер по снижению неблагоприятных физиологических факторов. Регулирующая роль соединительной ткани определяет формирование адекватных условий функционирования организма и поддержания гомеостаза в условиях невесомости. В результате изменения условий функционирования меняются межклеточные и клеточно-матриксные взаимодействия, в частности иммунофенотип резидентных и мигрирующих клеток соединительной ткани. Медиаторы воспаления, воздействуя в условиях невесомости активизируют различные виды клеток, в том числе, тучные клетки, принимающие участие в перестройке как волокнистых элементов, так и аморфного вещества соединительной ткани.
Цель
Изучить особенности ремоделирования коллагеновых волокнистых структур соединительной ткани мышей линии C57BL/6N после 24-суточного космического полета с использованием методики окрашивания пикросириус красный.
Материалы и методы
Эксперимент «Rodent Research-4» выполнен в 2017 году на мышах Mus musculus линии C57BL/6J, в возрасте 9-12 недель на начало эксперимента, доставленных из лаборатории Джексона (Jackson Laboratory, Bar Harbor, ME). Объектом морфологического исследования явилась соединительная ткань кожи латеральной поверхности бедра мышей группы-космического полета (n=10) и трех групп контроля: наземного (n=10), базального (n=10), виварийного (n=10). Животные группы космического полета 4 дня находились в транспортном контейнере с 18 февраля 2017 года в капсуле Dragon SV на стартовой площадке. Космический корабль SpaceX-10 был запущен 23 февраля, и 25 февраля лабораторные мыши были доставлены на МКС и пребывали в космосе 21 -24 суток. Уникальная особенность биоматериала полетной группы заключалась в проведении эвтаназии непосредственно в условиях невесомости на борту МКС. Грызуны в группе виварийного контроля получали питьевую воду и питание ad libitum. Мыши группы базального контроля подвергались эвтаназии сразу после старта космического корабля SpaceX10. В группе наземного контроля животные находились в наземной экспериментальной камере по имитации условий содержания животных на МКС (Космический центр им. Джона Кеннеди, США), время пребывания повторяло полетный эксперимент. Образцы замораживали и далее содержали в пакетах со льдом. Временной интервал между эвтаназией и криофиксацией биоматериала составлял 2 мин. Дальнейшее хранение биоматериала (до приземления) происходило в морозильной камере. Протокол работы с животными контрольных групп соответствовал графику работы с полетной группой. Полученные пробы были доставлены в Россию на сухом льду без разморозки в соответствии с протоколом НАСА-Роскосмос "Utilization Sharing Plan on-board ISS" (подписан 18 июля 2013 года). Все проводимые процедуры на животных были одобрены Институциональным комитетом по уходу за животными и их использованию г. Эймса (США).
Морфологические исследования проводились в НИИ экспериментальной биологии и медицины ФГБОУ ВО «Воронежский государственный медицинский университет имени Н.Н. Бурденко» Минздрава России.
Взятые образцы дермы кожи фиксировали в 10% забуференном формальдегиде в течение 12 часов при температуре 4 °C [2]. Далее осуществляли гистологическую проводку по стандартному протоколу с использованием ряда спиртов, ксилола и парафина в гистопроцессоре карусельного типа MTP-120 (SLEE Médical, Германия) с последующим изготовлением парафиновых блоков на станции Tissue-Tek TEC 5 (Sakura Seiki Co.Ltd. Япония). Гистологические срезы толщиной 2 мкм изготавливали на ротационном микротоме Accu-Cut SRM 200 (Sakura Finetek Europe B.V, Нидерланды) с последующим окрашиванием различными методиками: раствором Гимза, пикросириус красный, а также комбинированной методикой импрегнации серебром и раствором Гимза (таблица 1). Количественный и качественный состав коллагеновых волокнистых структур соединительной ткани изучался в поляризованном свете на микроскопе ZEISS Axio Imager.A2 (Carl Zeiss, Германия). Определение соотношения коллагенов I и III типов основывалась на цветовых спектрах в поляризованном свете для I типа коллагена - желто-оранжевое (красное) двулучепреломление, III типа - зеленое [4]. Установление соотношения I и III типов коллагена проводилось на основе программного обеспечения ImageJ методом анализа цветовой гистограммы каждого поля зрения. Абсолютные показатели красного и зеленого цветов спектра переводились в относительные величины и выражались в процентном соотношении относительно друг друга с учетом стандартного отклонения [5].
Статистический анализ проводили с помощью пакета программного обеспечения SPSS (V. 13.0). Результаты представлены в виде среднего значения (M) ± m (стандартная ошибка среднего). Для оценки достоверности различий между двумя группами использовали t-критерий Стьюдента или U-критерий Манна-Уитни в случае непараметрического распределения.
Наименование Поставщик Разведение Производитель
Раствор Гимза, Артикуль: 20-043/L Biovitrum Ready to-use ООО «ЭргоПродакшн», Россия
Пикросириус красный ab150681 - Picro Sirius Red Stain Kit (Connective Tissue Stain) Abcam Ready to-use Abcam, Cambridge, UK
Импрегнация серебром Артикуль: 21-026 Biovitrum Ready to-use ООО «ЭргоПродакшн», Россия
Результаты
При морфометрическом анализе дермы кожи, окрашенной раствором Гимза произведен количественный подсчет метахроматичных тучных клеток, не выявивший достоверных изменений в популяции клеток в условиях невесомости и групп контроля (таблица 2, 3, рисунок 1, 2). Однако, функциональное распределение тучных клеток было различным с увеличением пула дегранулирующих клеток в условиях космического полета по сравнению с группами контроля. Достаточно характерной особенностью полетной группы являлось обнаружение секреторных гранул на некотором расстоянии от
цитоплазмы, часто образующих метахроматичные локусы в дерме кожи. В целом интенсивность выведения компонентов секретома тучных клеток в специфическом тканевом микроокружении возрастала.
Таблица 2 - Содержание и гистотопографические особенности распределения тучных клеток в дерме кожи мышей (методика: окрашивание раствором Гимза).
Группа эксперимента Количество тучных клеток (на 1 мм2 ) Частота прилежания ТК друг к другу (в % от общего количества)
Виварийный контроль 34,4±3,1 4,59±0,29да
Базальный контроль 39,1±4,6 5,24±0,41да*
Наземный контроль 32,6±3,2 3,75±0,27+
Космический полет 36,6± 3,2 3,51±0,18+п
Условные обозначения: Достоверные отличия (р<0,05) по сравнению с группой наземного контроля (*), базального контроля (+), виварийного контроля (п) и космического полета (да).
Таблица 3 - Оценка секреторной активности и локализации тучных клеток дермы кожи мышей, в % (методика: окрашивание раствором Гимза).
Группа эксперимента ТК без признаков секреции ТК с признаками секреции Безъядерные фрагменты ТК
Виварийный контроль 26,2±2,7да 45,7±3,7 ® + 28,1±1,9
Базальный контроль 21,8±2,4да 54,8±2,1пда 23,4±2,5
Наземный контроль 25,3±2,1да 47,1±4,1да 27,6±2,1
Космический полет 11,5±0,8 * + п 61,5±3,3 * + п 27,0±1,8
Условные обозначения: см. табл.2.
Рисунок 1 - Дерма кожи мышей C57BL/6J группы виварийного контроля. Обозначения: А. Окрашивание раствором Гимза. Визуализируются тучные клетки, наполненные гранулами, наблюдается низкая интенсивность экзоцитоза. Шкала 20 мкм; Б. Окрашивание комбинированной методикой импрегнации серебром и раствором Гимза. Визуализируются метахроматично окрашенные тучные клетки, расположенные на фибриллярных волокнах (ретикулярные волокна окрашены черным цветом) периваскулярной локализации. Шкала 10 мкм; В, Г. Окрашивание пикросириус красным. Визуализация коллагеновых волокон в поляризованном свете: коллаген I (толстые волокна) - оранжево-желтое свечение, коллаген III (тонкие волокна)- зеленое. Шкала: рис. В 10 мкм; рис. Г 20 мкм.
Рисунок 2. Дерма кожи мышей C57BL/6J группы космического полета. Обозначения: А. Окрашивание раствором Гимза. Наблюдается дегрануляция тучных клеток и расположение секреторных гранул во внеклеточном матриксе соединительной ткани дермы кожи, включая гранулы крупных размеров. Шкала 20 мкм; Б, В. Окрашивание комбинированной методикой импрегнации серебром и раствором Гимза. Снижается количество импрегнированных ретикулярных волокон дермы. Шкала 10 мкм; Г. Окрашивание пикросириус красным. Визуализация коллагеновых волокон в поляризованном свете: коллаген I (толстые волокна) -оранжево-желтое свечение, коллаген III (тонкие волокна)- зеленое. Шкала 20 мкм.
Другим характерным морфологическим признаком группы космического полета стало разобщение морфофункционального кластера «тучная клетка - фибробласт» (рисунок 2). Дегранулирующие тучные клетки являются известными резервуарами различных медиаторов, таких как фактор роста фибробластов, гистамин, триптаза, химаза, интерлейкины и TGF-ß, играющих важную роль в процессе ремоделирования соединительной ткани. Адгезия тучных клеток к клеткам фибробластического дифферона свидетельствует об активном фибриллогенезе [6]. Как показало комбинированное окрашивание импрегнации серебром и толуидиновым синим, ретикулярные волокна выявлялись в дерме контрольных групп достаточно редко, однако в области прилежания тучных клеток к фибробластам/фиброцитам - с большей частотой по сравнению с другими локусами кожи. В то же время, следует отметить существование в коже определенного пула коопераций из нескольких клеток, в состав которых входят тучные клетки, принимающие активное участие в фибриллогенезе и этапах образовании ретикулярных волокон. Основной локализацией тучных клеток было межпучковое пространство, в котором осуществлялся контакт с коллагеновыми волокнами (рисунок 1). В ситуации прилежания тучной клетки к фиброциту/фибробласту в полетной группе, несмотря на имеющиеся индивидуальные различия, можно отметить более редкое выявление ретикулярных волокон по сравнению с результатами исследования биоматериала контрольных групп (рисунок 2).
Важным морфологическим свидетельством ослабления активности участия ТК в фибриллогенезе под влиянием невесомости являлось уменьшение количества преколлагеновых волокон, прилежащих к ТК или отходящих от них в различных направлениях внеклеточного матрикса (рисунок 2). Возможно, следствием этого являлось и интегральное снижение числа импрегнированных волокон в дерме кожи у мышей полетной группы по сравнению с животными контрольных групп, свидетельствуя о торможении фибриллогенеза в условиях невесомости. Обращал на себя внимание факт более частой солокализации ТК с коллагеновыми волокнами, что может свидетельствовать об изменении их миграционной активности в пределах специфического тканевого микроокружения кожи.
Изучение микропрепаратов кожи с использованием поляризационной микроскопии при окрашивании красителем пикросириус красный выявило ряд морфологических свидетельств грависенситивности фибриллогенеза. Дерма мышей всех контрольных групп имела хорошо выраженный коллагеново-эластический волоконно-фибриллярный волокнистый каркас с преобладанием коллагена I типа (рисунок 1). Поверхность волокон имела ярко выраженный продольный рельеф с хорошо развитой системой поперечных фибрилл. Эластические волокна, визуально более тонкие и извитые, располагались неориентированно и непосредственно контактировали с коллагеном I (рисунок 1). Наличие данных зон имеют важное функциональное значение в сохранении структурной целостности каркаса и поддержании его трехмерной конфигурации. Волокнистый компонент соединительной ткани дермы кожи животных группы космического полета отреагировал изменением соотношения I и III типов коллагенов в сторону увеличения незрелого коллагена III типа (80,8% vs 19,2%) по сравнению с группами контроля (89% vs 12%) (рисунок 2). Визуально отмечалась «рыхлость» сетчатого слоя дермы, сосочковый слой содержал короткие и мало извитые волокна, образуя ячеистую структуру (рисунок 2). Обращала на себя внимание и разобщенность эластических волокон с коллагенами, что может свидетельствовать о процессах ремоделирования волокнистого компонента в измененных условиях воздействия гравитации.
Обсуждение полученных результатов
Коллаген является основным полимером во всех типах соединительных тканей, начиная от волокнистых и заканчивая скелетными тканями. Коллагеновые сети обеспечивают орган прочностью и резистентностью при приложении механической силы, тем самым предотвращая чрезмерную деформацию ткани [7]. Существует 16 типов коллагена, из которых типы I, II и III почти составляют 80% коллагена в организме [6]. Переплетаясь, коллагеновые волокна формируют длинные тонкие фибриллы. Коллаген IV типа образует двумерную сеть [6]. Коллаген других типов связывается с коллагеном фибриллообразного типа. Различные типы коллагена, вместе с другими компонентами внеклеточного матрикса, подвергаются постоянному ремоделированию для реализации необходимой прочности и эластичности при биомеханической нагрузке. Физическое, механическое или химическое повреждение ткани или органа приведет к нарушению накопления и организации коллагена. Следовательно, оценка закономерностей распределения коллагена дает нам представление о резистентности тканей и органов к растяжению [6].
Окрашивание пикросириус красный (также называемое Picrosirius red (PSR) или окрашиванием Sirius red) является селективным гистохимическим методом, подходящим как для морфологического, так и для полуколичественного обнаружения в парафиновых срезах коллагеновых волокон. В срезах, которые анализируются с помощью поляризационной световой микроскопии (ПСМ), одновременно представлена сложная смесь различных цветов, маркирующих различные типы коллагена, что позволяет идентифицировать и проанализировать дифференциальные паттерны распределения структурно различных типов коллагена в тканях. Кроме того, ПСМ можно проводить с помощью светового микроскопа путем добавления двух фильтров, поляризатора и анализатора, что является мощным и надежным инструментом для оценки свойств волокон в тканях, содержащих коллагеновые волокна [8].
Пикросириус красный специфически окрашивает коллаген типов I и III, что позволяет применять этот метод окрашивания для выделения и количественной оценки фиброза печени [9] и сердца [10], выявления коллагеновых волокон в парафиновых срезах толстой кишки [11,12] и органов ротовой полости [13,14] в норме и при воспалении, при исследовании суставных хрящей [15] и коллагена в стенке легочной артерии [16], при гломерулопатиях [17,18], при атеросклерозе [19], какехсии рака [20], сердечной недостаточности [21], адиаспиромикоза [22]. Сульфокислотная группа пикросириуса красного реагирует с основными аминогруппами лизина, гидроксилизина и гуанидиновой группой аргинина, которая присутствует в молекуле коллагена [22]. Являясь анионным красителем, пикросириус красный прикрепляется ко всем различным изоформам коллагена. В световом поле коллаген визуализируется в виде пучков розовых или красных волокон, архитектоника которых изменяется при патологических состояниях [22]. При поляризационной микроскопии более крупные коллагеновые волокна кажутся ярко-желтыми или оранжевыми, а более тонкие, включая ретикулярные волокна, выглядят зелеными. Двулучепреломления (двойное преломление), при котором падающий свет расщепляется поляризацией на два различных пути, очень специфично для коллагена. Количество поляризованного света, поглощенного красителем пикросириус красный, строго зависит от ориентации коллагеновых пучков, позволяющих дифференцировать различные типы коллагена [22]. Предложенные нами варианты гистохимических протоколов комбинированного окрашивания, в частности пикросириус красный применяемый в комплексном гистологическом анализе с импрегнацией серебром и раствором Гимза могут быть использованы для интерпретации участия тучных клеток в ремоделировании межклеточного матрикса тканевого микроокружения при развитии адаптивных и патологических процессов. Важной осью фибриллогенеза является и анализ морфофункционального кластера «тучная клетка-фибробласт» [24]. В последние годы было отмечено, что кроме секретома тучных клеток, который состоит из веществ, активирующих фибробласты [3], прямая адгезия между этими двумя типами клеток также является необходимым условием для активации фибробластов [3]. Важность изучения
взаимодействия тучных клеток с фибробластами обусловлена еще и активным участием последних в прогрессировании рака. Таким образом, прилежание ТК к фибробластам может свидетельствовать о наличии определенных потенций в изменении равновесного состояния, в частности, в инициации процесса фибриллогенеза. Локализация ТК около волокон может свидетельствовать об участии секретируемых ими протеогликанов в утолщении фибрилл [3, 24]. Дегрануляция ТК может сопровождаться достижением необходимой концентрации сигнальных и структурных молекул в пределах строго ограниченного микролокуса. Кроме того, гранулы ТК могут выступать в роли «нуклеаторов» - точками (молекулярными локусами) инициации старта полимеризации молекул коллагена и началом фибриллогенеза [3,24].
Полученные морфологические свидетельства позволяют предполагать грависенситивность волокнистых компонентов дермы кожи, а также «ключевых» клеточных инициаторов фибриллогенеза. Условия орбитального полета приводили к разобщению тучных клеток с представителями фибробластического дифферона, что свидетельствует об изменении равновесного состояния фибриллогенеза. Вместе с изменением гравитационного сигнала меняются и гемодинамические условия - рН, играющий важную роль в процессе фибриллогенеза, содержание белков, что приводит к перестройке специфического тканевого микроокружения. Условия невесомости и длительность космического полета формируют адаптивные настройки органов, содержащих соединительную ткань в своем составе. Механизмы физиологической регенерации волокнистого компонента соединительной ткани не могут быть воплощены в полном объеме, что следует учитывать в условиях профессиональной деятельности космонавтов на борту МКС.
Список литературы
1. Junqueira LC, Bignolas G, Brentani RR. Picrosirius staining plus polarization microscopy, a specific method for collagen detection in tissue sections // Histochem J. 1979. - Vol. 11. - P. 447-455.
2. Histochemical Staining of Collagen and Identification of Its Subtypes by Picrosirius Red Dye in Mouse Reproductive Tissues/ S. Bhutda, M. V. Surve, A. Anil et. al. //Bio-protocol. 2017. - Vol. 7(21). 2592 https://doi.org/10.21769/BioProtoc. 2592.
3. Шишкина В. В., Атякшин Д.А. Тучные клетки и фибриллогенез коллагена в условиях невесомости// Журнал анатомии и гистопатологии. - 2019. - T. 8 (3). - C. 79-88. https://doi. org/10.18499/2225- 735 7-2019-83-79-88 [Shishkina V. V., Atjakshin D.A. Tuchnye kletki i fibrillogenez kollagena v uslovijah nevesomosti//Zhurnal anatomii i gistopatologii. - 2019. - Vol. 8 (3). - P. 79-88. https://doi.org/10.18499/2225-7357-2019-8-3-79-88].
4. A comparison of the immunofluorescent localization of collagen types I, III, and V with the distribution of reticular fibers on the same liver sections of the snow monkey (Macaca fuscata) / E. Adachi, T. Hayashi, P. H. Hashimoto // Cell and tissue research. - 1991. - Vol. 264, N1. - P. 1-8.
5. Соотношение коллагена I и III типов в легких и коже у пациентов с буллезной эмфиземой легких, осложненной спонтанным пневмотораксом /Иванов, И. С., Темирбулатов В.И., Клеткин М.Е. и др.// Новости хирургии. 2018. - № 3. - С. 293-300 [Sootnoshenie kollagena I i III tipov v legkih i kozhe u pacientov s bulleznoj jemfizemoj legkih, oslozhnennoj spontannym pnevmotoraksom /Ivanov, I. S., Temirbulatov V.I., Kletkin M.E. i dr.// Novosti hirurgii. 2018. - № 3. - S. 293-300].
6. PAI1 mediates fibroblast-mast cell interactions in skin fibrosis/ Pincha N., Hajam E.Y., Badarinath K. et.al.//J Clin Invest. - 2018. - Vol.128 (5) .-P. 1807-1819. https://doi.org/10.1172/JCI99088.
7. Histochemical Staining of Collagen and Identification of Its Subtypes by Picrosirius Red Dye in Mouse Reproductive /Bhutda S., Surve M.V., Anil A. et al//. Tissues. Bio Protoc. 2017. - Vol. 7(21). - P.e2592. https://doi.org/10.21769/BioProtoc. 2592.
8. A polarized light microscopy method for accurate and reliable grading of collagen organization in cartilage repair /Changoor A., Tran-Khanh N., Methot S. et al.// Osteoarthr Cartil. - 2011. - Vol. 19. - P. 126-135.
9. Gadd V.L. Combining immunodetection with histochemical techniques: the effect of heat-induced antigen retrieval on picro-Sirius red staining // J Histochem Cytochem. - 2014. - Vol. 62 (12). - P. 902-906. https://doi.org/10.1369/0022155414553667.
10. Membrane Vesicles of Group B Streptococcus Disrupt Feto-Maternal Barrier Leading to Preterm Birth / Surve M.V., Anil A., Kamath K.G. et al.// PLoS Pathog. 2016. - Vol. 12 (9). - P.e1005816. https://doi.org/10.13 71/journal.ppat.1005816.
11. Histochemical Detection of Collagen Fibers by Sirius Red/Fast Green Is More Sensitive than van Gieson or Sirius Red Alone in Normal and Inflamed Rat Colon /Segnani C., Ippolito C., Antonioli L. et. al.//PLoS One. - 2015. - Vol. 10 (12). - P. e0144630. https://doi.org/10.1371/journal.pone.0144630.
12. Численный анализ изображений кросс-поляризационной оптической когерентной томографии в дифференциальной диагностике заболеваний кишечника по состоянию мягких тканей полости рта/Киселева Е.Б., Робакидзе Н.С., Гладкова Н.Д. и др.//Современные технологии в медицине. 2011.- № 4.— С. 32-39 [Chislennyj analiz izobrazhenij kross-poljarizacionnoj opticheskoj kogerentnoj tomografii v differencial'noj diagnostike zabolevanij kishechnika po sostojaniju mjagkih tkanej polosti rta/Kiseleva E.B., Robakidze N.S., Gladkova N.D. i dr. //Sovremennye tehnologii v medicine. 2011.— № 4.— S. 32-39].
13. Analysis of collagen fibers in human gingival tissues using picrosirius red stain under polarized microscope./ Chandran A., Bhandary R., Shenoy N., Shetty UA. // J Indian Soc Periodontol. - 2021. — Vol. 25 (2). — P. 106-111. https://doi.org/10.4103/jisp.jisp_152_20.
14. Дифференциально-диагностические критерии болезни крона и язвенного колита по состоянию слизистой оболочки рта /Робакидзе Н.С., Барановский А.Ю., Щукина О.Б. и др.//Институт стоматологии. 2014. —№ 3 (64).— С. 58-59 [Differencial'no-diagnosticheskie kriterii bolezni krona i jazvennogo kolita po sostojaniju slizistoj obolochki rta /Robakidze N.S., Baranovskij A.Ju., Shhukina O.B. i dr. //Institut stomatologii. 2014. —№ 3 (64).— S. 58-59].
15. Histochemical quantification of collagen content in articular cartilage/ Rieppo L., Janssen L., Rahunen K. et al. //PLoS One. 2019. — Vol. 14 (11). — P. e0224839. https://doi.org/ 10.1371/journal.pone.0224839.
16. Expression of pulmonary artery connective tissue growth factor and pulmonary artery remodeling in smokers and patients with chronic obstructive pulmonary disease/Tian F., Xu Y.J., Zhang Z.X., Hu J. // Zhonghua Nei Ke Za Zhi. 2007. — Vol. 46 (4). — P. 298-301. https://pubmed.ncbi.nlm.nih.gov/17637269/.
17. Rittie L. Method for Picrosirius red-polarization detection of collagen fibers in tissue sections/Methods Mol Biol. - 2017. — Vol. 1627. —P. 395-407.
18. Особенности морфометрической оценки интерстициального фиброза почки крысы в фармакологических исследованиях / Носейкина Е.М., Спивак И.А., Курская О.В., и др. // Морфологические ведомости. 2011. —№ 1. — С. 36-45 [Osobennosti morfometricheskoj ocenki intersticial'nogo fibroza pochki krysy v farmakologicheskih issledovanijah /Nosejkina E.M., Spivak I.A., Kurskaja O. V., i dr. //Morfologicheskie vedomosti. 2011. —№ 1. — S. 36-45].
19. Robust quantitative assessment of collagen fibers with picrosirius red stain and linearly polarized light as demonstrated on atherosclerotic plaque samples / Greiner C., Grainger S., Farrow S. et. al.//PLoS One. 2021. — Vol. 16 (3). — P.e0248068. https://doi.org/ 10.1371/journal.pone.0248068.
20. Systemic study of selected histone deacetylase inhibitors in cardiac complications associated with cancer cachexia /Vivek Bora, Dhwani Patel, Kaid Johar, et. al. //Canadian Journal of Physiology and Pharmacology. - 2021. — Vol. 100 (3). — P. 240-251. https://doi.org/10.1139/cjpp-2021-0012.
21. Reverse remodeling of the myocardial extracellular matrix after prolonged left ventricular assist device support follows a biphasic pattern /Annette H. Bruggink 1., Matthijs F. M. van Oosterhout, Nicolaas de Jonge, et al.// J Heart Lung Transplant. -. 2006. — Vol. 25 (9). — P.1091-8. . https://doi.org/10.1016/j.healun. 2006.05.011.
22. Picrosirius-Polarization Methodfor Collagen Fiber Detection in Tendons: A Mini-Review. /Liu J., Xu M.Y., Wu J. et al./Orthop Surg. - 2021. — Vol. 13(3). P. 701-707. https://doi.org/10.1111/os. 12627.
23. Picrosirius red staining: a useful tool to appraise collagen networks in normal and pathological tissues/Lattouf R., Younes R., Lutomski D. et al.// J Histochem Cytochem. - 2014. — Vol. 62 (10). — P. 751-758. https://doi.org 10.1369/0022155414545787.
24. Соединительная ткань: (гистофизиология и биохимия): [монография] /Н. П. Омельяненко, Л. И. Слуцкий /Под ред. С. П. Миронова ; Федеральное гос. учреждение "Центральный ин-т травматологии и ортопедии им. Н. Н. Приорова Росмедтехнологий". - Москва : Известия, 2009. - 27 с. [Soedinitel'naja tkan': (gistofiziologija i biohimija): [monografija] /N. P. Omeljanenko, L. I. Sluckij; pod red. S. P. Mironova; Federal'noe gos. uchrezhdenie "Central'nyj in-t travmatologii i ortopedii im. N. N. Priorova Rosmedtehnologij". - Moskva : Izvestija, 2009. - 27 s].
