CC BY
60
DOI: https://doi.org/10.17650/1726-9784-2021-20-4-10-17
Cct0
Оценка клеточного звена иммунитета
при новой коронавирусной инфекции COVID-19
А.В. Лобов1, П.И. Иванова1, Е.А. Погодина1, В.И. Казей1, Е.Д. Максимова1, И.Ж. Шубина2
'ООО «Экзактэ Лабс»; Россия, 117246 Москва, Научный пр-д, 20, стр. 2;
2ФГБУ «Национальный медицинский исследовательский центр онкологии им. Н.Н. Блохина» Минздрава России; Россия, 115478 Москва, Каширское шоссе, 24
Контакты: Антон Викторович Лобов anton.lobov@exactelabs.com
В декабре 2019 г. человечество столкнулось с новой коронавирусной инфекцией, возбудитель которой был идентифицирован как SARS-CoV-2, а болезнь получила название COVID-19 (ковид). Для выявления инфицированных пациентов используют получившие широкое распространение тесты на основе полимеразной цепной реакции, способные обнаружить РНК SARS-CoV-2 в мазках из носа и ротоглотки. Однако не менее важным, а во многих случаях и единственным способом диагностики является оценка реакции на возбудитель различных звеньев иммунитета, таких как гуморальное и клеточное.
Цель предлагаемого обзора литературы - обобщить и проанализировать имеющиеся данные о формировании иммунного ответа и разрабатываемые подходы к комплексной характеристике иммунного ответа пациентов с подтвержденным контактом с возбудителем COVID-19 или в результате вакцинации.
В настоящее время эффективность антиковидной вакцинации и наличие иммунитета после перенесенного заболевания оценивают, определяя специфические антитела. Наблюдения показывают, что титры анти-S и ан-ти-RDB IgG значительно снижаются через 6-8 мес после постановки диагноза. Важным моментом является то, что даже при падении уровней антител в крови переболевших пациентов обнаруживаются клетки памяти. Обнаружить отдельные Т-, B-лимфоциты, отвечающие выбросом различных маркеров активации (цитокины, антитела) на представленные антигены, позволяет метод ELISPOT (Enzyme-linked immunospot), являющийся разновидностью ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).
Для более полного понимания формирования и эффективности иммунной памяти к SARS-CoV-2 требуется оценка содержания и функциональной активности различных ее компонентов, включая B-лимфоциты, CD8+-, CD4+-T-лимфоциты, поскольку они имеют относительно независимые друг от друга механизмы действия клеточной памяти. В связи с этим актуальны оценка иммунитета к SARS-CoV-2, когда уровень антител становится недостаточным для их определения зарегистрированными тестами, и внедрение в клинико-диагностическую практику тест-систем, позволяющих выявить маркеры долговременной клеточной памяти.
Ключевые слова: коронавирусная инфекция, иммунный ответ на SARS-CoV-2, В- и Т-клеточная память, лабораторная диагностика, ELISPOT
Для цитирования: Лобов А.В., Иванова П.И., Погодина Е.А. и др. Оценка клеточного звена иммунитета при новой коронавирусной инфекции COVID-19. Российский биотерапевтический журнал 2021;20(4):10-7. DOI: 10.17650/ 1726-9784-2021-20-4-10-17.
Assessment of the cellular immunity response to the new coronavirus infection COVID-19
Anton V. Lobov1, Polina I. Ivanova1, Ekaterina A. Pogodina1, Vasily I. Kazey1, Ekaterina D. Maksimova1, Irina Zh. Shubina2
Exacte Labs, LLC; Bld. 2, 20 Nauchny Proezd, Moscow 117246, Russia;
2N.N. Blokhin National Medical Research Center of Oncology, Ministry of Health of Russia; 24 Kashirskoe Shosse, Moscow 115478, Russia
Contacts: Anton Viktorovich Lobov anton.lobov@exactelabs.com
In December 2019 humanity faced a new coronavirus infection caused by SARS-CoV-2 virus and the disease referred to as COVID-19 has spread globally.
Specially adapted for the detection of SARS-CoV-2 RNA tests based on polymerase chain reaction are used to identify infected patients by processing nasal and oropharyngeal swabs. However, often it may not be sufficient to use
polymerase chain reaction only, but in many cases it is very important to assess the humoral and cellular immune reactions to the infection.
The present review aims to summarize and analyze the available literature data on the formation of the immune response and diagnostic methods used for characteristics of the immune reactions in patients who recovered from COVID-19 or received an anti-COVID-19 vaccine.
Currently, the effectiveness of anti-COVID-19 vaccination and the developing immunity after a previous illness are assessed by detecting specific antibodies. A number of observations show that anti-S and anti-RDB IgG titers significantly decline within 6-8 months after diagnosis. It is important to note that although the antibody levels in the blood of recovered patients decrease, the memory cells can be determined by the appropriate tests.
The ELISPOT (Enzyme-linked immunospot) method, which is a variation of the ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay), allows estimation the T- and B-cells that release activation factors such as cytokines and antibodies in response to the presented antigens.
The assessment of the generation and effective function of the immune memory to SARS-CoV-2 requires the evaluation of the content and functional activity of its various components, including B-lymphocytes, CD8+, CD4+ T-lym-phocytes, since they have rather independent mechanisms of action of cellular memory.
Therefore, it is crucially important to have tools for evaluating the immunity to SARS-CoV-2 when the level of antibodies is insufficient for determination by the available registered tests, and the introduction of test systems into clinical diagnostic practice, allowing to identify markers of long-term cellular memory, are relevant.
Key words: coronavirus infection, immune response to SARS-CoV-2, B- and T-cell memory, laboratory diagnostics, ELISPOT
For citation: Lobov A.V., Ivanova P.I., Pogodina E.A. et al. Assessment of the cellular immunity response to the new coronavirus infection COVID-19. Rossiyskiy bioterapevticheskiy zhurnal = Russian Journal of Biotherapy 2021; 20(4): 10-7. (In Russ.). DOI: 10.17650/1726-9784-2021-20-4-10-17.
Введение
В декабре 2019 г. человечество столкнулось с новой коронавирусной инфекцией, возбудитель которой был идентифицирован как SARS-CoV-2, а болезнь получила название COVID-19 (ковид). Проявления COVID-19 могут варьировать от легких и умеренных гриппоподобных симптомов до смертельного поражения легких с развитием тяжелого острого респираторного синдрома (Severe acute respiratory syndrome, SARS) [1].
SARS-CoV-2 является оболочечным РНК-содер-жащим вирусом. РНК вируса кодирует структурные белки: спайк-белок (S), белки оболочки (E), мембранные белки (M) и белки нуклеокапсида (N). Остальная часть генома кодирует неструктурные белки (NSP), такие как РНК-зависимая РНК-полиме-раза, протеаза, геликаза и другие вспомогательные белки [2].
Структура, ответственная за проникновение вируса в клетку, — поверхностный спайковый тримерный гликопротеин (S-белок). S-белок состоит из 2 субъединиц — S1 и S2, в свою очередь, S1 состоит из N-кон-цевого (NTD) и C-концевого (CTD1, CTD2 и CTD3) доменов [3]. При этом на CTD1 расположен рецеп-торсвязывающий домен (receptor-binding domain, RBD), обеспечивающий проникновение вируса в клетку путем взаимодействия с рецептором ангиотензинпре-вращающего фермента 2-го типа (angiotensin-con-verting enzyme 2, ACE2) на поверхности клеток хозяина с последующим его праймированием клеточной
трансмембранной сериновой протеазой 2 (TMPRSS2) [4]. Субъединица S2 имеет ключевую роль в слиянии мембран вируса и клетки.
Установлено, что антитела к S-белку, а именно к RBD, потенциально способны нейтрализовать вирус, поскольку рецепторсвязывающий участок открыт для взаимодействия с анти-RBD-антителами, в отличие от других структур вируса, таких как нуклео-протеин (№), который скрыт вирусной или клеточной мембранами от комплементарных антител [5].
АСЕ2 — нетканеспецифичный рецептор, широко представленный на поверхности клеток многих органов и тканей. Существует 2 формы белка АСЕ2 — клеточная (трансмембранная) и циркулирующая (растворимая); показано, что последняя способна блокировать взаимодействие S-белка SARS-CoV с его рецептором [6]. Наибольшую роль в патогенезе SARS-CoV-2 играет клеточная форма АСЕ2, доступная для взаимодействия с вирусом и представленная, в частности, на поверхности эпителия верхних дыхательных путей, альвеолярных клеток 2-го типа и на энтероцитах тонкого кишечника [7].
Для выявления инфицированных пациентов используют получившие широкое распространение тесты на основе полимеразной цепной реакции, способные обнаружить РНК SARS-CoV-2 в мазках из носа и ротоглотки. Однако не менее важным, а во многих случаях и единственным способом диагностики является оценка реакции на возбудитель различных звеньев иммунитета, таких как гуморальное и клеточное.
Признано, что одним из эффективных способов предотвращения распространения инфекционных заболеваний является вакцинация. Острая необходимость в вакцине против СОУТО-19 послужила причиной смещения фокуса в разработках научно-исследовательских институтов, фармацевтических и биотехнологических компаний по всему миру и привела к созданию вакцин с использованием различных подходов и платформ в кратчайшие сроки, что требует дальнейшего изучения их эффективности и безопасности. Наиболее полно охарактеризовать эффективность вакцинопрофилактики возможно, только применив комплексный подход, способный показать степень вовлеченности всех звеньев приобретенного специфического иммунитета.
Цель настоящего обзора литературы — обобщить и проанализировать имеющиеся на данный момент данные о формировании иммунного ответа и разрабатываемые подходы к комплексной характеристике иммунного ответа пациентов с подтвержденным контактом с возбудителем СОУТО-19 или в результате вакцинации.
В качестве источников литературы использовали статьи, размещенные в базе данных PubMed Национального центра биотехнологической информации ^СВ1) США, кроме того, использовался накопленный опыт при проведении описанных ниже клеточных и серологических исследований для диагностики инфекционных заболеваний.
Оценка иммунного ответа на основе определения специфических антител
В настоящее время эффективность антиковидной вакцинации и наличие иммунитета после перенесенного заболевания оценивают, определяя специфические антитела [8], особое внимание уделяя анти-RBD SARS-CoV-2 IgG, при этом крайне редко проводят определение клеточного иммунитета (лишь в рамках научного исследования [9—11]; ни одного зарегистрированного теста на момент написания настоящего обзора (сентябрь 2021 г.) в Российской Федерации не представлено), который позволяет выявить специфически сенсибилизированные Т-лимфоциты.
Наблюдения показывают, что титры анти^ и ан-ти-RDB IgG остаются относительно стабильными на протяжении периода до 6 мес после постановки диагноза, с последующим значительным снижением через 6—8 мес, что было продемонстрировано в исследовании, в то время как снижение уровней анти^ и анти-RDB ^М и IgA отмечалось уже между 1-м и 3-м месяцами после начала заболевания [12, 13].
N. Sherina и соавт. провели анализ динамики уровней антител методом иммуноферментного анализа (ИФА) у 88 пациентов, образцы крови которых были собраны в разные временные точки (через
7—240 дней после появления симптомов). Было показано, что после 28-го дня наблюдалось значительное снижение уровней анти-S и анти-RBD IgM и IgA, а значительное снижение анти-S и анти-RBD IgG наблюдалось только к 181-240-му дням (6—8 мес). В исследовании при оценке динамики антител показана относительная стабильность анти-S и анти-RBD IgG при сравнении титров антител в парных образцах от 27 человек. Сравнивались титры антител в пробах, взятых в среднем на 21-й день после появления симптомов и на 126-й день [12]. Авторы другого исследования показали в реакции истинной нейтрализующей способности достоверную корреляцию между титрами нейтрализации и связывания в ИФА, при этом отметили стабильные титры антител в течение не менее 3 мес и лишь незначительное снижение в 5-месячный период времени в 121 образце с известными титрами антител при диагностике ИФА-методом [13].
Важным наблюдением является то, что даже при падении уровней самих антител в крови переболевших пациентов обнаруживаются В-клетки памяти, которые способны продуцировать иммуноглобулины при стимуляции антигеном, что было показано N. Sherina и соавт. на 24 пациентах методом ELISPOT (Enzyme-linked immunospot), более подробно о котором будет сказано ниже. Примечательно, что RBD-спе-цифические IgG-продуцирующие В-клетки были обнаружены у 33 % пациентов через 2—4 нед, у 93 % — через 3—6 мес и у 100 % — через 6—8 мес после появления симптомов. Можно предположить, что падение уровня антител не указывает на ослабление иммунитета против SARS-CoV-2. Соответственно, использование только антител в качестве маркера наличия иммунитета после выздоровления или вакцинации является недостаточным [12].
В другом исследовании В-клетки памяти, специфичные к S-белку, RBD и N-белку, определяли с помощью флуоресцентного окрашивания на IgD- и/или CD27+ c дальнейшим подразделением поверхностных маркеров IgM, IgG или IgA. Тем самым было показано, что количество антигенспецифичных клеток нарастало до 120-го дня после начала заболевания с последующим выходом на плато. Важно то, что количество данных В-клеток памяти практически не обнаруживалось у людей, не перенесших заболевание COVID-19 [14].
Методы определения клеточного иммунитета
Обнаружить отдельные Т-, B-лимфоциты, отвечающие выбросом различных маркеров активации (цитокины, антитела) на представленные антигены, позволяет метод ELISPOT, являющийся разновидностью метода ELISA (Enzyme-linked immunosorbent assay).
В основе данного метода лежит обнаружение в суспензии мононуклеарных клеток периферической крови (МНПК) специфически активированных клеток путем захвата мембраной микропланшета с иммобилизованным сорбентом (моноклональные антитела или антиген) индуцируемых ими продуктов. Для обнаружения Т-лимфоцитов в указанном методе используют различные цитокины, характерные для активированных Т-лимфоцитов, таких как интерлей-кин 2, интерферон (ИФН) у, фактор некроза опухоли а, гранзим В и др. [15]. Для обнаружения В-клеток или плазмоцитов после стимуляции специфичным антигеном используют в качестве маркера антиген-специфические антитела [16]. После инкубации и последовательных реакций иммунодетекции на мембране образуются тени (споты) отдельных клеток, пригодных для подсчета при помощи средств фотовизуализации (рис. 1). Тест-системы на данной платформе разрабатываются и производятся многими компаниями: T-SPOTCOVID (Oxford Immunotec, Великобритания), SARS-COV-2 ELISPOT (AID GmbH, Германия), ELISpot Path (Mabtech, Швеция), Corona T-test (ФГБУ «НМИЦ гематологии» Минздрава России, Россия), ТиграТест SARS-CoV-2 (АО «ГЕНЕРИУМ», Россия).
На рис. 1 представлены фотографии, полученные в результате собственного исследования. Фотографии лунок культурального микропланшета получены после проведенного исследования методом ELISPOT ТиграТест SARS-CoV-2 (АО «ГЕНЕРИУМ», Россия). МНПК были выделены на градиенте фиколла с плотностью 1,077 г/мл от субъекта спустя 3 нед после 2-го компонента вакцины Гам-КОВИД-Вак (Спутник V). Суспензия клеток была внесена в лунки культураль-ного микропланшета. Затем клетки стимулировали пулом пептидов SARS-CoV-2 в течение 16 ч в усло-
виях 37°С и 5 % СО2. После чего продукцию ИФН-у оценивали с помощью ELISPOT. Фото лунок было сделано с помощью Elispot Reader System (AID, Германия).
Представленные 4 фотографии иллюстрируют результат исследования Т-клеточного иммунитета для 1 субъекта. Обнаружен выраженный индуцированный выброс ИФН-у в ответ на представленные пептиды S-белка, что свидетельствует об их вакци-ноиндуцированной сенсибилизированности. Ответ на структурные белки (N, M, ORF3a, ORF7a) не выявлен. Спонтанная продукция ИФН-у Т-лимфоци-тами не превышает допустимого уровня. Способность индуцированной выработки ИФН-у соответствует установленному критерию.
Описанный метод в модификации с использованием соответствующего протокола и культурального микропланшета способен выявить, помимо Т-кле-точного иммунного ответа, специфические В-лим-фоциты — плазматические клетки или клетки, секре-тирующие антитела (antibody secreting cells, ASC), в основе обнаружения которых лежит регистрация секретируемых ими антител.
Определение антигенспецифичных антител не позволяет в полной мере охарактеризовать гуморальное звено иммунного ответа, поскольку не отражает наличие и активность В-клеток памяти, которые могут приобретать фенотип клеток памяти CD19+/CD27+ и становиться ASC. Это было показано при исследовании В-клеток памяти (методом ELISPOT), специфичных к антигенам коклюша, столбняка, кори и гриппа. Авторы исследования В-клеток памяти [17] производили поликлональную стимуляцию человеческих МНПК, что приводило к пролиферации и дифференцировке В-клеток памяти с фенотипом CD19+/CD27+ в секретирующие
! «
/V.
«
Г -
** Л i - f a <4 I
В V.' v- Л1 г/
¿i :;v Л' * !v. -
'à ^
Рис. 1. Визуализация Т-клеточного ответа с помощью ELISPOT: а — после инкубации без добавления специфического антигенного индуктора с целью оценки спонтанной продукции интерферона у; б — после инкубации c добавлением специфического антигенного индуктора: пул пептидов S-белка; в — после инкубации c добавлением специфического антигенного индуктора: пул пептидов структурных белков (N, M, ORF3a, ORF7a); г — после инкубации c добавлением моноклонального антитела ОКТ-3, для неспецифической индукции интерферона у в целях оценки функциональной активности Т-лимфоцитов. х20
Fig. 1. Visualization of the T-cell response with ELISPOT: a — after incubation without any specific antigen inducer in order to evaluate the spontaneous production of interferon у; б — after incubation with the addition of a specific antigenic inducer, a pool of S-protein peptides; в — after incubation with the addition of a specific antigenic inducer, a pool of structural protein peptides (N, M, ORF3a, ORF7a); г — after incubation with the addition of monoclonal antibody OCT-3, for non-specific induction of interferon у in order to assess the functional activity of T-lymphocytes. *20
а
антитела клетки. Тем самым авторам удалось обнаружить антигенспецифические В-клетки памяти против компонентов бактериальных вакцин (Bordetella pertussis и столбняка), а также вирусных вакцин (против кори и гриппа) даже у людей с низкими титрами сывороточных антител [17].
Установлено, что В-клетки памяти могут существовать при отсутствии определяемых уровней антител в сыворотке [1S] и их быстрая дифференциров-ка и выработка антител могут иметь большое значение для формирования протективного гуморального ответа. Таким образом, комбинированное использование методов анализа В-клеток и уровней антител в сыворотке может дать более полное понимание индивидуального иммунного статуса, опосредованного В-клетками, и служить маркером наличия долгосрочного клеточного иммунитета.
Впервые применение метода ELISPOT для количественной оценки В-клеток, продуцирующих специфические антитела, было описано в 19S3 г. [19]. С тех пор регулярно предпринимаются попытки оптимизировать протокол исследования, в частности осуществляется поиск оптимальных неспецифических активаторов В-клеток, таких как агонист TLR RS4S совместно с интерлейкином 2, которые были выбраны в качестве наиболее эффективной комбинации [20]. В то время как активные плазмоциты, потенциально присутствующие в крови, можно исследовать непосредственно без активации in vitro в B-клеточном ELISPOT, для B-клеток памяти требуется предварительная длительная (не менее 72—98 ч) стимуляция антигеннезависимым активатором для их дифферен-цировки в определяемые ASC, что является существенным недостатком [21].
Альтернативным вариантом анализа IGRA (Interferon gamma release assay) является количественное определение уровня ИФН-у (без подсчета теней (спотов) отдельных клеток) в плазме после инкубации цельной крови со смесью антигенов (индукторов). Тест-система QuantiFERON®-TB Gold (QIAGEN, Нидерланды), разрешенная и зарегистрированная в России для диагностики туберкулезного инфицирования, в том числе латентного, основана на данном подходе, однако разработанный вариант для диагностики COVID-19 под названием QuantiFERON SARS-CoV-2 и аналог от немецкой компании — CoV-2 IGRA (EUROIMMUN, Германия) не зарегистрированы и не применяются на территории Российской Федерации (на момент написания обзора, сентябрь 2021 г.).
Оценка Т-клеточного звена иммунитета
Клеточный иммунный ответ является крайне важным фактором в сдерживании SARS-CoV-2, что подробно рассматривается в одном из обзоров литературы по иммунологическим механизмам, ле-
жащим в основе COVID-19 [22]. Также на важность клеточного иммунного ответа указывает связь умеренного и тяжелого течения COVID-19 с частой выраженной лимфопенией [23].
Помимо вышесказанного, возросший интерес к изучению клеточного иммунитета обусловлен распространением новых штаммов вируса SARS-CoV-2 и возможной неэффективностью ранее приобретенных антител по отношению к ним. В отличие от антител, паратопы которых после успешной вакцинации нацелены на RBD-фрагмент S-белка (для большинства полученных вакцин), Т-клетки нацелены как минимум на 15—20 различных фрагментов белков коронавируса [24]. Это может послужить дополнительным аргументом в пользу классических инактивированных цельновирусных вакцин, которые способны формировать Т-клеточный иммунитет и антитела к различным эпитопам большого числа белков возбудителя SARS-CoV-2. Антитела способны нейтрализовать вирус, тогда как Т-лимфоциты уничтожают инфицированные клетки (цитотоксические Т-клетки, цитотоксические лимфоциты CD8+) или инициируют иммунный ответ, стимулируя выработку антител и активность цитотоксических лимфоцитов путем создания оптимального цитокинового окружения для направления иммунного ответа (с помощью CD4+-Т-хелперов). Формирование сенсибилизации к большему количеству антигенных детерминант значительно усложняет ускользание возбудителя от иммунной системы в результате возникновения точечных мутаций.
Способность Т-клеток распознавать новые мутации вируса SARS-CoV-2, проявляя перекрестную реактивность, была показана при исследовании различных пулов МНПК, собранных до появления COVID-19, но специфичных к простудным корона-вирусам человека, таким как HCoV-OC43, HCoV-229E, HCoV-NL63 и HCoV-HKU1 [25], что можно использовать в качестве доказательной базы того, что последующие мутации SARS-CoV-2 не смогут в полной мере ускользать от уже сформированного специфического клеточного иммунитета. При этом указанные данные вносят свой вклад в понимание различий в восприимчивости к инфекции и клинических результатах лечения пациентов после контакта с новой коронавирусной инфекцией.
Интерес к оценке индивидуального клеточного иммунитета в научной среде вызывает исследование T. Sekine и соавт., где показано наличие Т-клеточно-го иммунитета у серонегативных членов семьи и выздоравливающих лиц с бессимптомным и легким течением COVID-19 в анамнезе, что может объясняться низкой, но эпизодической вирусной нагрузкой. В исследовании были обнаружены SARS-CoV-2-специ-фические CD4+- и CD8+-Т-клетки у серонегативных
лиц с частотой 41 %. Причем подобная ситуация наблюдалась у 3 из 31 пациента, перенесших COVID-19 в легкой степени, у 9 из 28 серонегативных членов семьи и у 5 из 31 человека с бессимптомной формой
[26]. Вероятно, сочетание низких эпизодических вирусных нагрузок с имеющейся клеточной памятью к другим коронавирусам позволяет быстро нарастить перекрестно реагирующий пул Т-лимфоцитов, который препятствует развитию инфекции SARS-CoV-2
[27]. Описанные выше обстоятельства могут объяснить отсутствие специфических антител у контактировавших с инфицированными пациентами как результат того, что реакции Т-клеточного иммунитета оказывается достаточно для элиминации вируса без необходимости запуска гуморального звена с синтезом антител.
Немалую роль в таких случаях, вероятно, играют и неспецифические факторы защиты, такие как система комплемента, натуральные киллеры (НК-клет-ки), интерфероны. В случае SARS-CoV-2 предполагается, что вирус очень эффективно уклоняется от запуска ранних врожденных иммунных реакций, опосредованных, например, функцией ИФН 1-го и 3-го типов. Было показано, что SARS-CoV-2 оказывает влияние на запуск внутриклеточных врожденных механизмов, связанных с ИФН 1-го и 3-го типов in vitro и in vivo [28, 29]. Отсутствие полноценного отклика врожденного иммунитета ограничивает активацию адаптивных иммунных реакций. Отмечается, что если компоненты врожденного звена иммунитета не были подавлены вирусом, то инфекция протекает в бессимптомной или легкой форме, так как активация адаптивных иммунных реакций происходит относительно быстро [30].
Существенным ограничением определения Т-клеточного иммунитета к SARS-CoV-2 является то, что он основан на выявлении эффекторных Т-кле-ток, продолжительность циркуляции которых в периферической крови исчисляется месяцами (до 6—8 мес) [14] в случае их активации [12].
Оценка В-клеточного звена иммунитета
В связи с вышесказанным изучение и внедрение тестов для оценки B-клеточного звена долговременной памяти, особенно в случаях когда специфические поствакцинальные или после перенесенного заболевания антитела либо Т-клеточный иммунитет уже не определяются, имеют определяющее значение для установления иммунного статуса и прогноза результата контактов с SARS-CoV-2.
Установлено наличие B-клеток памяти к гомологичным участкам других простудных коронавирусов (HCoV) у лиц, не имевших контакта с SARS-CoV-2 [18]. Важно, что обнаружена возможность их пролиферации с последующим синтезом антител к гомо-
логичным участкам S2-cyöbe,^™^i (имеющей более высокую гомологию среди коронавирусов, чем S1 [16, 17]) и нуклеокапсида, обладающих перекрестной активностью в отношении SARS-CoV-2. Эти данные имеют существенное значение для установления иммунного статуса по отношению к COVID-19 для лиц, у которых нет в анамнезе SARS-CoV-2 или вакцинации [18]. Особенно следует отметить наличие перекрестных комплементарных антител, что было показано для детей и подростков [20], и, по-видимому, является следствием более высокой частоты встречаемости простудных заболеваний, вызванных коро-навирусами (HCoV) в детских коллективах. Примечательно, что в исследовании W. Kevin и соавт. была выявлена специфическая нейтрализующая активность сыворотки доноров, не инфицированных SARS-CoV-2, против псевдотипов SARS-CoV-2 и SARS-CoV-2-S в соответствии с уровнями S-свя-зывающего IgG SARS-CoV-2 и с эффективностью, сопоставимой с эффективностью сыворотки пациентов с COVID-19 [19].
Одним из ключевых аспектов оценки клеточного иммунитета является обнаружение В-клеточной памяти после вакцинации или перенесенной инфекции SARS-CoV-2. Формирование и сохранение ее было показано и при уменьшении антител [31], при этом долгоживущие B-клетки памяти способны обеспечить быстрое производство специфических ан-ти-RBD S1 и S2 COVID-19-антител.
В исследовании J.M. Dan и соавт. с участием 188 пациентов с подтвержденным COVID-19, 43 из которых были протестированы через 6 и более месяцев после заболевания, было показано, что количество B-клеток памяти в образцах крови пациентов через 6 мес после заболевания было больше, чем через 1 мес после заболевания, и не снижалось значимым образом в период до 8 мес. RBD-специфические В-клетки памяти отображали кинетику, аналогичную кинетике S-специфических В-клеток памяти. Однако подобного не наблюдалось для SARS-CoV-2-специфичес-ких CD4+- и CD8+-Т-клеток, период полужизни которых составил 3—5 мес [14]. Предполагается, что долгоживущие B-клетки памяти способны обеспечить быстрое производство специфических ан-ти-RBD S1 и S2 COVID-19-антител.
Заключение
Для более полного понимания формирования и эффективности иммунной памяти к SARS-CoV-2 требуется оценка содержания и функциональной активности различных ее компонентов, включая B-лим-фоциты, CD8+-, CD4+-T-лимфоциты, поскольку они имеют относительно независимые друг от друга механизмы действия клеточной памяти. При этом B-кле-точный механизм действия приводит к формированию
наиболее долговременной памяти (через 5—8 мес уровень специфических антител и количество В-кле-ток памяти сохранялись практически неизменными). В связи с этим актуальны оценка иммунитета к SARS-CoV-2, когда уровень антител становится недостаточным для их определения зарегистрированными тестами, и внедрение в клинико-диагностическую практику тест-систем, позволяющих выявить маркеры долговременной клеточной памяти. Очевидно, что для проведения мероприятий, направленных на диагностику и лечение новой коронавирус-
ной инфекции требуется оптимальная тест-система или установленный комплекс исследований, способных, помимо гуморального звена, оценивать Т- и В-клеточный иммунитет и долговременную иммунологическую память и при этом пригодных для рутинной клинико-диагностической практики. Важным становится и повышение осведомленности врачей клинических специальностей о способах оценки клеточного звена иммунитета и значении комплексного подхода к определению иммунного статуса пациентов.
ЛИТЕРАТУРА / REFERENCES
1. Временные методические рекомендации «Профилактика, диагностика
и лечение новой коронавирусной инфекции (COVID-19)». Версия 11 (07.05.2021). М., 2020. P. 6. [Temporary guidelines "Prevention, diagnosis and treatment of new coronavirus infection (COVID-19)" Version 11 (07.05.2021). Moscow, 2021. C. 6. (In Russ.)].
2. Kim D.S., Rowland-Jones S., Gea-Mal-lorqui E. Will SARS-CoV-2 Infection Elicit Long-Lasting Protective or Sterilising Immunity? Implications for Vaccine Strategies (2020). Front Immunol 2020;11:571481.
DOI: 10.3389/fimmu.2020.571481.
3. Gui M., Song W., Zhou H. et al. Cryo-electron microscopy structures
of the SARS-CoV spike glycoprotein reveal a prerequisite conformational state for receptor binding. Cell Res 2017;27(1):119-29. DOI: 10.1038/cr.2016.152.
4. Hoffmann M., Kleine-Weber H., Schro-eder S. et al. SARS-CoV-2 Cell Entry Depends on ACE2 and TMPRSS2
and Is Blocked by a Clinically Proven Protease Inhibitor. Cell 2020;181(2): 271-80. DOI: 10.1016/j.cell.2020.02.052.
5. Amanat F., Krammer F. SARS-CoV-2 Vaccines: Status Report. Immunity 2020;52(4):583-9.
DOI: 10.1016/j.immuni.2020.03.007.
6. Lambert D.W., Yarski M., Warner F.J. et al. Tumor necrosis factor-alpha con-vertase (ADAM17) mediates regulated ectodomain shedding of the severe-acute respiratory syndrome-coronavirus (SARS-CoV) receptor, angiotensin-con-verting enzyme-2 (ACE2). J Biol Chem 2005;280(34):30113-9.
DOI: 10.1074/jbc.M505111200.
7. Ziegler C.G.K., Allon S.J., Nyquist S.K. et al. SARS-CoV-2 Receptor ACE2
Is an Interferon-Stimulated Gene in Human Airway Epithelial Cells and Is Detected in Specific Cell Subsets across Tissues. Cell 2020;181(5):1016-35. DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.035.
8. Logunov D.Y., Dolzhikova I.V., Shcheb-lyakov D.V. et al. Safety and efficacy
of an rAd26 and rAd5 vector-based heterologous prime-boost COVID-19 vaccine: an interim analysis of a randomised controlled phase 3 trial in Russia. Lancet 2021;397(10275):671-81. DOI: 10.1016/S0140-6736(21)00234-8.
9. Потеряев Д.А., Хамитов Р.А., Ефимов Г.А. и др. Перспективы использования технологической платформы ELISPOT в системе противоэпидемических мероприятий против новой коронавирусной инфекции COVID-19. БИОпрепараты. Профилактика, диагностика, лечение 2020;20(3):146-58.
DOI: 10.30895/2221-996X-2020-20-3-146-158. [Poteryaev DA., Khamitov R.A., Efimov G.A. et al. Prospects for Using the ELISPOT Technological Platform as Part of Anti-Epidemic Measures Against the New Coronavirus Infection COVID-19. BIOpreparaty. Profilaktika, diagnostika, lecheniye = BIOprepara-tions. Prevention, Diagnosis, Treatment 2020;20(3):146-58. DOI: 10.30895/2221-996X-2020-20-3-146-158. (In Russ.)].
10. Cassaniti I., Percivalle E., Bergami F. et al. SARS-CoV-2 specific T-cell immunity in COVID-19 convalescent patients and unexposed controls measured by ex vivo ELISpot assay. Clin Microbiol Infect 2021;27(7):1029-34.
DOI: 10.1016/j.cmi.2021.03.010.
11. Wu S., Zhong G., Zhang J. et al. A single dose of an adenovirus-vectored vaccine provides protection against SARS-CoV-2 challenge.
Nat Commun 2020;11(1);1-7. DOI: 10.1038/s41467-020-17972-1.
12. Sherina N., Piralla A., Du L. et al. Persistence of SARS-CoV-2-specific B and T cell responses in convalescent COVID-19 patients 6-8 months after the infection. Med (N Y) 2021;2(3):281-95.
DOI: 10.1016/j.medj.2021.02.001.
13. Wajnberg A., Amanat F., Firpo A. et al. Robust neutralizing antibodies
to SARS-CoV-2 infection persist for months. Science 2020;370(6521):1227-30. DOI: 10.1126/science.abd7728.
14. Dan J.M., Mateus J., Kato Y. et al. Immunological memory to SARS-CoV-2 assessed for up to 8 months after infection. Science 2021;371(6529):eabf4063. DOI: 10.1126/science.abf4063.
15. Slota M., Lim J.B., Dang Y. et al. ELISpot for measuring human immune responses to vaccines. Expert Rev Vaccines 2011;10(3):299-306.
DOI: 10.1586/erv.10.169.
16. Crotty S., Aubert R.D., Glidewell J. et al. Tracking human antigen-specific memory B cells: a sensitive and generalized ELISPOT system. J Immunol Methods 2004;286(1-2):111-22. DOI: 10.1016/j.jim.2003.12.015.
17. Buisman A.M., de Rond C.G., Oztürk K. et al. Long-term presence of memory B-cells specific for different vaccine components. Vaccine 2009;28(1):179-86.
DOI: 10.1016/j.vaccine.2009.09.102.
18. West D.J., Calandra G.B. Vaccine induced immunologic memory for hepatitis B surface antigen: implications for policy on booster vaccination. Vaccine 1996;14(11):1019-27.
DOI: 10.1016/0264-410x(96)00062-x.
19. Czerkinsky C.C., Nilsson L.A., Nygren H. et al. A solid-phase enzyme-linked immunospot (ELISPOT) assay for enumeration of specific antibody-secreting cells. J Immunol Methods 1983;65(1-2): 109-21. DOI: 10.1016/0022-1759(83)90308-3.
20. Jahnmatz M., Kesa G., Netterlid E. et al. Optimization of a human IgG B-cell ELISpot assay for the analysis of vaccine-induced B-cell responses. J Immunol Methods 2013;391(1-2):50-9.
DOI: 10.1016/j.jim.2013.02.009.
21. Bernasconi N.L., Traggiai E., Lanzavecchia A. Maintenance
of serological memory by polyclonal activation of human memory B cells.
Science 2002:298(5601):2199-202. DOI: 10.1126/science.1076071.
22. Vabret N., Britton G.J., Gruber C. et al. Immunology of COVID-19: Current State of the Science. Immunity 2020;52(6):910-41.
DOI: 10.1016/j.immuni.2020.05.002.
23. Ni L., Ye F., Cheng M.L. et al. Detection of SARS-CoV-2-Specific Humoral and Cellular Immunity in COVID-19 Convalescent Individuals. Immunity 2020;52(6):971-7.
DOI: 10.1016/j.immuni.2020.04.023.
24. Tarke A., Sidney J., Kidd C.K. et al. Comprehensive analysis of T cell immunodominance and immunopreva-lence of SARS-CoV-2 epitopes
in COVID-19 cases. Cell Rep Med
2021;2(2):100204.
DOI: 10.1016/j.xcrm.2021.100204.
25. Mateus J., Grifoni A., Tarke A. et al. Selective and cross-reactive SARS-CoV-2 T cell epitopes in unexposed humans. Science 2020;370(6512):89-94.
DOI: 10.1126/science.abd3871.
26. Sekine T., Perez-Potti A., Rivera-Ballesteros O. et al. Robust T Cell Immunity in Convalescent Individuals with Asymptomatic or Mild COVID-19. Cell 2020;183(1):158-168.
DOI: 10.1016/j.cell.2020.08.017.
27. Braun J., Loyal L., Frentsch M. et al. SARS-CoV-2-reactive T cells in healthy donors and patients with COVID-19. Nature 2020;587(7833):270-4.
DOI: 10.1038/s41586-020-2598-9.
28. Bastard P., Rosen L.B., Zhang Q. et al. Autoantibodies against type I IFNs
in patients with life-threatening COVID-19. Science
2020;370(6515);eabd4585. DOI: 10.1126/science.abd4585.
29. Blanco-Melo D., Nilsson-Payant B.E., Liu W.C. et al. Imbalanced Host Response to SARS-CoV-2 Drives Development of COVID-19.
Cell 2020;181(5):1036-45. DOI: 10.1016/j.cell.2020.04.026.
30. Sette A., Crotty S. Adaptive immunity to SARS-CoV-2 and COVID-19. Cell 2021;184(4):861-80.
DOI: 10.1016/j.cell.2021.01.007.
31. Nguyen-Contant P., Embong A.K., Kanagaiah P. et al. S Protein-Reactive IgG and Memory B Cell Production after Human SARS-CoV-2 Infection Includes Broad Reactivity
to the S2 Subunit. mBio 2020;11(5):e01991-20. DOI: 10.1128/mBio.01991-20.
Вклад авторов
А.В. Лобов, П.И. Иванова: сбор и анализ данных литературы, написание текста статьи; И.Ж. Шубина: разработка дизайна обзора, участие в написании текста статьи; Е.А. Погодина, В.И. Казей, Е.Д. Максимова: анализ источников литературы. Authors contributions
A.V. Lobov, P.I. Ivanova: collection and analysis of literature data, writing the text of the article; I.Zh. Shubina: review design development, participation in writing the text of the article; E.A. Pogodina, V.I. Kazey, E.D. Maksimova: analysis of literature sources.
ORCID авторов / ORCID of authors
A.В. Лобов / A.V. Lobov: https://orcid.org/0000-0002-4703-5863 П.И. Иванова / P. I. Ivanova: https://orcid.org/0000-0002-3481-2854 Е.А. Погодина / E.A. Pogodina: https://orcid.org/0000-0002-0421-3287 Е.Д. Максимова / E.D. Maksimova: https://orcid.org/0000-0003-2027-6621
B.И. Казей / V.I. Kazey: https://orcid.org/0000-0003-2032-6289 И.Ж. Шубина / I.Zh. Shubina: https://orcid.org/0000-0002-9374-3158
Конфликт интересов. Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов. Conflict of interest. The authors declare no conflict of interest.
Финансирование. Работа выполнена без спонсорской поддержки. Financing. The work was performed without external funding.
Статья поступила: 01.10.2021. Принята к публикации: 22.10.2021. Article submitted: 01.10.2021. Accepted for publication: 22.10.2021.
