Оценка качества травы лапчатки белой Текст научной статьи по специальности «Фундаментальная медицина»

ФАРМАКОГНОЗИЯ И БОТАНИКА

О.М. Шимко, О.М. Хишова

ОЦЕНКА КАЧЕСТВА ТРАВЫ ЛАПЧАТКИ БЕЛОЙ

Витебский государственный медицинский университет

В статье представлены макроскопические и микроскопические признаки травы лапчатки белой. Оценку качества травы лапчатки белой предложено проводить по содержанию основных биологически активных веществ - фла-воноидов. Для идентификации флаво-ноидов предложена ТСХ-методика: в качестве стандарта использовали раствор ФСО рутина в спирте 40% Р с концентрацией 0,5 мг/мл. Количественное определение флавоноидов в пересчете на рутин проводили спектрофотометрическим методом, используя реакцию ком-плексообразования с раствором алюминия хлорида. Разработанные методики предлагаются для стандартизации травы лапчатки белой и лекарственных средств на ее основе.

Ключевые слова: лапчатка, трава, флавоноиды, рутин, стандартизация.

ВВЕДЕНИЕ

Разработка лекарственных средств (ЛС) на основе лекарственного растительного сырья (ЛРС) является важной задачей фармацевтической технологии.

ЛС на основе ЛРС обладают мягким фармакологическим действием, минимумом нежелательных эффектов, низкой токсичностью и высокой безопасностью.

Одним из лекарственных растений (ЛР), представляющим интерес для научной медицины, является лапчатка белая (Potentilla alba L.).

Лапчатка белая вошла в официальную медицину более 30 лет назад. Известно, что ЛС лапчатки белой оказывают влияние на щитовидную железу, регулируют ее функцию, ликвидируют диффуз-

ные изменения, снимают многочисленные токсические явления в организме.

Фармакологические эффекты лапчатки белой обусловлены химическим составом. Корневища с корнями лапчатки белой содержат углеводы (крахмал), ири-доиды, сапонины, фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды (кверцетин), дубильные вещества (галлотанин) до 17% [1]. Трава лапчатки белой содержит иридоиды, сапонины, фенолкарбоновые кислоты, флавоноиды (рутин), дубильные вещества до 6%. В листьях обнаружены фенолкарбоновые кислоты и их производные (п-кумаровая и эллаговая кислоты), флавоноиды (кверцетин, кемпферол, цианидин) [1]. Установлено, что трава лапчатки белой кумулирует Мп, 2п, Си, Бе, Со, Бе, Б1, А1, причем содержание Б1, А1, 2п, Мп превышает критерий степени концентрирования минеральных элементов для ЛРС в 1,7; 2,5; 3,0; 4,0 раза, соответственно [1]. Следует отметить, что лапчатка белая содержит также элементарный йод и анион йодистой кислоты [1].

Первые клинические исследования лапчатки белой были проведены украинскими исследователями Г.К. Смыком и

В.В. Кривенко в начале 1970-ых годов [2]. В качестве объекта исследования использовали настой 1: 20 всего растения целиком, собранного во время цветения. Уже после месяца лечения пациенты отмечали резкое улучшение состояния здоровья, уменьшались явления тиреотоксикоза, экзофтальм, тахикардия, тремор рук [2]. После 2-3 курсов лечения значительно уменьшалась в размерах щитовидная железа от III до I стадии, а в некоторых случаях

- до нормальных размеров. Кроме того, нормализовались показатели основного обмена и ЭКГ, уменьшалось содержание уровня глюкозы и холестерина в крови, снижалось артериальное давление [2].

По данным электрокардиографии, отмечалось замедление частоты пульса, улучшение обменных процессов миокарда, восстановление нормальной атриовентрикулярной проводимости [2].

Проведено лечение настоем лапчатки белой 45 разновозрастных больных тиреотоксикозом (38 женщин и 7 мужчин) [3]. В результате проведенного исследования все пациенты отметили улучшение состояния здоровья, уменьшение раздражительности и улучшение сна, снижение тахикардии и артериального давления, нормализацию веса. Щитовидная железа уменьшалась в размерах, исчезал тремор и экзофтальм [4].

Установлено, что настой лапчатки белой является эффективным ЛС для лечения тиреотоксикоза, хорошо переносится при длительном применении, не вызывает побочных эффектов [4].

Изучение фармакологической активности извлечений из лапчатки белой показало, что экстракты из корней и травы являются практически нетоксичными. Авторами [4] в эксперименте установлено, что внутрижелудочное введение настоя из подземной и надземной части растения (1:20) в максимально возможном количестве (0,5 мл) не вызывало гибель мышей самцов (весом 20-22 г) и изменения их поведения, массы и внешнего вида.

При внутрижелудочном введении мышам 0,5 мл лиофилизированного экстракта БЬ50 равна 4215 мг/кг. Это позволило отнести исследуемый лиофилизиро-ванный экстракт к группе малотоксичных. Признаки острого отравления мышей проявились через 3-4 часа после введения ЛС и характеризовались повышенной возбудимостью с последующим угнетением, непроизвольным мочеиспусканием, ограничением двигательной активности, сменяющейся тремором. Выжившие животные переносили ЛС относительно хорошо. При вскрытии погибших животных и исследовании внутренних органов обнаружены точечные кровоизлияния в подслизистом слое желудка и тонкого кишечника, отмечено увеличение размера надпочечников, печени и почек. Внутримышечное введение лиофилизированного экстракта лапчатки белой повышало его токсическое действие: все животные погибли на второй день (БЬ 50 была равна 2629 мг/кг) [4].

Описанные фармакологические эффекты лапчатки белой связывают с биоло-

гически активными веществами (БАВ) -флавоноидами как Р-витаминными средствами [2].

Сегодня, несмотря на значительные достижения научной медицины, включая оперативные методы, химио-, гормоно- и физиотерапию, проблема лечения многих заболеваний человека не стала менее актуальной. Особенно это относится к заболеваниям эндокринной системы и, в частности, щитовидной железы. Наиболее распространенным недугом «щитовидки» является тиреотоксикоз. Попытки многочисленных фармацевтических фирм создать эффективное средство для лечения гипер-тиреоза до настоящего времени не увенчались успехом.

В связи с этим арсенал терапевтических средств, предназначенных для лечения заболеваний щитовидной железы, достаточно узок, и в последнее время он не расширяется, а наоборот, сокращается. Снято с производства такое ЛС, как дий-одтирозин. Официальная медицина для лечения заболеваний щитовидной железы применяет главным образом ЛС гормонов щитовидной железы (левотироксин, тиреоидин, трийодтиронин и их аналоги), антитиреоидные средства (мерказолил) и ЛС, содержащие йод [4].

Однако они обладают рядом побочных отрицательных действий на организм. Тиреоидин и трийодтиронин противопоказаны при тиреотоксикозе, сахарном диабете, ишемической болезни сердца; мерказолил может вызывать развитие лейкопении и гранулоцитопении, противопоказан при беременности и наличии узлов в железе; ЛС йода противопоказаны при беременности, заболеваниях почек, аллергических заболеваниях, новообразованиях щитовидной железы [4].

Наиболее распространенным остается оперативный метод лечения, который часто сопровождается осложнениями,

дающими около 10 процентов инвалидности. «Менее» существенными недостатками хирургического удаления щитовидной железы являются: пожизненная заместительная гормонотерапия, развитие состояния гипотиреоза, высокие риски повреж-

дения паращитовидной железы при проведении операции[4].

Все это вынуждает сегодня искать альтернативные способы лечения больных и создавать новые ЛС.

Цель данной работы - изучение диагностических признаков травы лапчатки белой, а также ее стандартизация по содержанию основной группы БАВ - флаво-ноидов.

МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ

Объектом исследования являлась высушенная трава лапчатки белой трех серий:

• серия I - трава лапчатки белой, собранная в Центральном Ботаническом Саду Национальной Академии Наук Республики Беларусь (ЦБС НАН РБ) (г. Минск) в 2007 году;

• серия II - трава лапчатки белой, собранная в ЦБС НАН РБ (г. Минск) в 2008 году;

• серия III - трава лапчатки белой, собранная в Витебской области, в деревне Ра-нино в 2008 году.

Макроскопический анализ ЛРС является очень важным в общем комплексе фармакогностического исследования. Его основная задача - определение подлинности сырья.

Главная цель для определения подлинности ЛРС - найти в общей картине морфологических признаков специфичные, особенные, присущие исследуемому объекту, отличающие его от других.

Микроскопический анализ зависит от морфологической группы исследуемого объекта, а также от состояния сырья -цельного, измельченного или порошкообразного. При исследовании цельного сырья берут кусочки пластинки с краем и жилкой. При исследовании резанного сырья берут по несколько различных кусочков.

Микропрепараты готовили по методике, приведенной в Государственной Фармакопее Республики Беларусь [5].

В качестве метода исследования для идентификации флавоноидов использовали тонкослойную хроматографию (ТСХ). В качестве стандарта использовали раствор фармакопейного стандартного образ-

ца (ФСО) рутина в спирте 40% Р с концентрацией 0,5 мг/мл.

Испытуемый раствор: к 1,0 г измельченного сырья травы лапчатки белой прибавляли 30 мл спирта (40 %, об/об) Р, нагревали с обратным холодильником на водяной бане в течение 45 мин, охлаждали в течение 30 мин и фильтровали.

Раствор сравнения: 5 мг рутина Р растворяли в 10 мл спирта 96 % Р.

Пластинка: ТСХ пластинка со слоем силикагеля Р.

Подвижная фаза: бутанол Р - уксусная кислота ледяная Р - вода Р (4:1:2 об/об/ об).

Наносимый объем пробы: по 10 мкл в виде полос.

Фронт подвижной фазы: не менее 10 смот линии старта.

Высушивание: на воздухе в течение 10-15 мин.

Проявление: пластинку опрыскивали 30г/л спиртовым раствором алюминия хлорида Р в 95% спирте Р и просматривали в ультрафиолетовом свете при длине волны 365 нм.

Количественное определение флавоноидов в траве лапчатки белой в пересчете на рутин проводили спектрофотометрическим методом, используя реакцию ком-плексообразования с раствором 30 г/л алюминия хлорида Р.

Для выбора оптимальных условий экстракции флавоноидов из травы лапчатки белой было проведено исследование по определению влияния на полноту извлечения следующих факторов: природы экстрагента (вода очищенная, спирт этиловый 40 %, 60 %, 70 %, 95%); степени измельчения (100 - 250 мкм, 250 -500 мкм, 500 -1000 мкм, 1000 - 2000 мкм); соотношения сырье: экстрагент (0,5:50; 1:50; 1,5 :50; 2:50); время экстракции, мин (15 + 15, 30 + 15, 45 + 15, 60 + 15) [5].

В ходе проведенных исследований нами подобраны оптимальные условия экстракции флавоноидов травы лапчатки белой: экстрагент спирт 40% Р, измельченность сырья 100 -250 мкм, соотношение сырье: экстрагент 1:30, время экстракции 45 мин, температура экстракции 85-90° С.

1,000 г измельченного сырья помещали в колбу вместимостью 50 мл со шлифом, прибавляли 30,0 мл спирта (40%, об/об) Р. Колбу закрывали, взвешивали с точностью до 0,01 г и кипятили с обратным холодильником на водяной бане в течение 45 мин. Затем колбу с содержимым охлаждали в течение 30 мин, взвешивали, доводили массу колбы до первоначальной спиртом (40%, об/об) и фильтровали (раствор А).

Испытуемый раствор. К 1,0 мл раствора А прибавляли 2,0 мл раствора 30 г/л алюминия хлорида Р в 96 % спирте Р и доводили спиртом (95%, об/об) Р до объема 25,0 мл.

Раствор сравнения. 0,050 г ФСО рутина растворяли при нагревании на водяной бане в 50 мл спирта (40%, об/об) Р. Охлаждали и доводили спиртом (40%, об/об) Р до объема 100,0 мл (раствор В). К

1.0 мл раствора В прибавляли 2,0 мл раствора 30 г/л алюминия хлорида Р в 96 % спирте Р и доводили спиртом (95 % , об/об) Р до объема 25,0 мл.

Компенсационный раствор (а). К

1.0 мл раствора А прибавляли 2-3 капли раствора кислоты уксусной Р и доводили спиртом (95 % , об/об) Р до объема 25,0 мл.

Компенсационный раствор (Ь). К

1.0 мл раствора В прибавляли 2-3 капли раствора кислоты уксусной Р и доводили спиртом (95 % , об/об) Р до объема 25,0 мл.

Измеряли оптическую плотность испытуемого раствора и раствора сравнения при 412 нм через 30-40 мин, используя компенсационный раствор (а) и компенсационный раствор (Ь), соответственно.

Содержание суммы флавоноидов в пересчете на рутин, в процентах, рассчитывали по формуле, на абсолютно сухое сырье (X):

А ■ т0 ■ 30

X =------0----,

А0 ■ т

где А - оптическая плотность испытуемого раствора;

А0 - оптическая плотность раствора ФСО рутина;

т - масса навески испытуемого сырья, г;

т 0- масса навески ФСО рутина, г. РЕЗУЛЬТАТЫИ ОБСУЖДЕНИЕ

Макроскопические признаки травы лапчатки белой. Внешние признаки. Цельные или частично измельченные олиственные цветоносные стебли длиной до 20 см с листьями чешуевидными, прикорневые листья на длинных черешках, пальчато-сложные, состоят из 5 обратноланцетных листочков, сверху темнозеленые, снизу шелковистые, с темнобурыми прилистниками. Стеблевые листья небольшие, чешуевидные, в числе 1-2, с маленькими яйцевидно-ланцентными прилистниками. Все растение покрыто прижатыми шелковистыми серебристыми волосками. Цветки белые, до 3 смв диаметре, на длинных цветоносах, собраны по 2-5 в верхушечные полузонтики. Венчик из 5 свободных лепестков, чашечка с подчаши-ем опушены, пятинадрезанные. Тычинок и пестиков много.

Микроскопические признаки травы лапчатки белой. При рассмотрении листа с поверхности видны клетки эпидермиса в очертании многоугольные, с прямыми стенками. Устьица только на нижней стороне листа с 4-7 околоустьич-ными клетками (аномоцитный тип). На нижней стороне листа присутствуют многочисленные длинные простые волоски с толстыми стенками, иногда перекрученные или согнутые. Реже встречаются головчатые волоски двух типов: с одноклеточной ножкой и двухклеточной головкой и многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой. В клетках мезофилла многочисленные друзы оксалата кальция (рис. 1,2.)

1 -головчатые волоски с одноклеточной ножкой и двухклеточной головкой;

2 -простые волоски.

Рисунок 1 - Лист лапчатки белой

1 - устьица;

2 - головчатые волоски с многоклеточной ножкой и одноклеточной головкой;

3 - простые волоски;

4 - место прикрепления волоска.

Вестник фармации№1 (47) 2010 Рисунок 2 - Лист лапчатки белой

На рисунке 3 приведена последовательность зон хроматограмм раствора сравнения и

испытуемого раствора.

Верх хроматог )афической пластинки

Рутин: флуоресцирующая зона желто-зеленого цвета. Флуоресцирующая зона синего цвета Флуоресцирующая зона желтозеленого цвета (рутин)

Раствор сравнения Испытуемый раствор

Рисунок 3 - Последовательность зон хроматограмм раствора сравнения и

испытуемого раствора

Результаты качественного обнаружения флавоноидов травы лапчатки белой представлены в таблице 1.

На всех хроматограммах испытуемых серий травы лапчатки белой имеется

полоса, значение которой совпадает со значением ФСО рутина (таблица 1).

Результаты количественного определения флавоноидов травы лапчатки белой в пересчете на рутин представлены в таблице 2.

Таблица 1 - Результаты качественного обнаружения флавоноидов в траве лапчатки белой

Серия ФСО рутина извлечения из травы лапчатки белой

1 0,75±0,01 0,75±0,01

2 0,75±0,02 0,75±0,02

3 0,75±0,01 0,75±0,01

Таблица 2 - Количественное содержание флавоноидов в траве лапчатки белой

Серия X Б2 Б АХ е, % е, %

1 3,37 0,0066 0,0814 0,0448 0,23 6,71 2,98

2 2,61 0,0043 0,0652 0,0359 0,18 6,94 3,08

3 3,50 0,0022 0,0472 0,0260 0,13 3,85 1,71

Содержание флавоноидов в траве лапчатки белой составило от 2,61% до 3,50%. Предложенная методика легка в исполнении и хорошо воспроизводится (таблица 2).

Полученные результаты исследования легли в основу Фармакопейной статьи «Лапчатки белой трава» Государственной Фармакопеи Республики Беларусь [6].

ВЫВОДЫ

1. Изучены диагностические (макроскопические и микроскопические) признаки травы лапчатки белой. Микроскопические признаки: длинные простые волоски с толстыми стенками, иногда перекрученные или согнутые. Реже - головчатые волоски двух типов: с одноклеточной ножкой и двухклеточной головкой и много-

клеточной ножкой и одноклеточной головкой. Основные макросопические признаки: цельные или частично измельченные оли-ственные цветоносные стебли длиной до 20 см с листьями чешуевидными, прикорневые листья на длинных черешках, пальчато-сложные, состоят из 5 обратноланцетных листочков, сверху темнозеленые, снизу шелковистые, с темнобурыми прилистниками.

2. Подобраны оптимальные условия экстракции флавоноидов травы лапчатки белой. В качестве экстрагента предложено использовать спирт 40 % Р, измельчен-ность сырья - 100 - 250 мкм, соотношение сырьё: экстрагент - 1: 30 , время экстракции - 45 мин, температура экстракции - 85

- 90° С.

3. Для идентификации флавоноидов лапчатки белой предложено использовать тонкослойную хроматографию. В качестве стандарта использовали раствор ФСО рутина в спирте 40 % с концентрацией 0,5 мг/мл.

4. Разработана спектрофотометрическая методика определения флавоноидов в траве лапчатки белой в пересчете на рутин. Данная методика может быть использована для стандартизации травы лапчатки белой и лекарственных средств на ее основе.

SUMMARY

O.M. Shymko, O.M. Khishova STANDARDIZATION OF GRASS POTENTILLA ALBA

In the article macroscopic and microscopic attributes of grass Potentilla alba are submitted. The estimation of quality of a grass Potentilla alba for carrying out under the contents of basic biologically active substances - flavonoids is offered. For identification of flavonoids is thin-layer chromatography offered. As the standard a solution PSO routine in spirit 40 % R with concentration

0,5 mg/ml was used. Quantitative definition of flavonoids in recalculation on routines spectrophotometric methods have carried out, using reaction of formations of complex with a solution of aluminums chlorides R. The developed techniques for standardization of a

grass Potentilla alba and medicinal means on its basis are offered.

Keywords: potentilla alba, grass, flavonoids, routine, standartization.

ЛИТЕРАТУРА

1. Семенова, Е.Ф. Химический состав лапчатки белой и применение ее с лечебной целью / Е.Ф. Семенова, Е.В. Преснякова // Химия и компьютерное моделирование. Бутлеровсие сообщения. - 2001. - № 5. -С. 32 - 34.

2. Смик, Г.К. Перстач бший - ефективний 3aci6 для лшування захворювань щитoвиднoi залози / Г.К. Смик, В.В. Кривенко. - Фармацевтический журнал, №2, 1975. - с. 58-62

3. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Том 1. - Минск, 2006 - С.268.

4. Приходько, Е.И. Лечение больных тиреотоксикозом травой перстач белый / Е.И. Приходько / Врачебное дело, № 6. - 1976.

- С.14.

5. Шимко, О.М. Количественное определение флавоноидов в траве лапчатки белой / О.М. Шимко, О.М. Хишова // Достижения фундаментальной, клинической медицины и фармации. Материалы 64-ой юбилейной научной сессии университета, посвященной 75-летию его образования. -Витебск, 2009 - С. 110- 112

6. Государственная фармакопея Республики Беларусь. Том 3. - Минск, 2009. -

С.710.

Адрес для корреспонденции:

210023, Республика Беларусь, г. Витебск, пр. Фрунзе, 27,

Витебский государственный

медицинский университет,

кафедра фармацевтической технологии

с курсом ФПК и ПК,

тел. раб.: 8 (0212) 37-00-13

Шимко О.М.

Поступила 03.03.2010 г.