CC BY
120
УДК 639.371.2.034.004.12(560)
В. Г. Чипинов, Е. С. Джаригазов, Н. В. Болонина
ОЦЕНКА КАЧЕСТВА СПЕРМЫ ОСЕТРОВЫХ РЫБ РАЗЛИЧНЫМИ МЕТОДАМИ И ОПЫТ ЕЕ НИЗКОТЕМПЕРАТУРНОЙ КОНСЕРВАЦИИ
В последнее время во всем мире неуклонно растет интерес к разведению осетровых рыб. Не является исключением и Турция, где в мае 2009 г. нами были проведены исследования по вопросам формирования маточного стада осетровых рыб и криоконсервации спермы.
Оценка качества спермы осетровых рыб на предприятиях аквакультуры в России традиционно проводится по балльной шкале [1]. В Турции для оценки качества спермы рыб применяется метод, сходный с балльной оценкой Персова: также проводится глазомерная оценка качества спермы, однако вместо баллов ставятся плюсы и градация оценки несколько иная [2]. Качество спермы оценивается следующим образом:
++++ - очень быстрое поступательное движение спермиев;
+++ - быстрое поступательное движение;
++ - медленное поступательное движение;
+ - колебательное движение;
- - нет каких-либо движений.
Для практического применения в осетроводстве глазомерная оценка качества спермы вполне достаточна и объективна, из нескольких проб спермы всегда можно отобрать лучшие для осеменения. Однако сравнительная оценка качества спермы при проведении таких научных исследований, как криоконсервация, формирование продукционных стад, может быть недостаточно объективной и может зависеть не только от особенностей восприятия исследователя, но и от выбранного метода.
В экспериментах по выяснению продолжительности подвижности спермиев после активации при разных значениях температурах воды мы решили использовать оба метода оценки.
Самцы русского осетра были проинъецированы сурфагоном из расчета 5 мл раствора на особь, температура воды составляла 16 °С. Для проведения исследований большого количества спермы не требовалось, сцеживание осуществляли однократно, через 24 часа после инъекции.
В эксперименте было 5 вариантов с различной температурой воды, 2 пробы спермы от разных самцов. Качество спермы оценивали сразу после активации, через 3 минуты после активации и далее через каждые 5 минут. Активацию проводили водой из расчета 1 мл спермы к 50 мл воды.
Воду для активации готовили заранее, доводя температуру до необходимой. После активации пробы ставили в термостаты, для оценки брали небольшие порции прямо из емкостей в термостатах. Результаты экспериментов показаны в табл. 1
Таблица 1
Изменение активности спермы русского осетра при разных термических режимах
Вариант Температура
Время\^ активации\ 4 °С 9 °С 14 °С 19 °С 24 °С
1 2 1 2 1 2 1 2 1 2
0 мин +++ 5 +++ 5 ++++ 5 ++++ 5 ++++ 5 +++ 4 ++++ 5 ++++ 4 ++++ 5 +++ 4
3 мин +++ 5 +++ 4 ++++ 5 ++++ 5 +++ 5 +++ 4 +++ 4 +++ 3 +++ 4 +++ 3
8 мин +++ 4 +++ 4 ++ 3 +++ 4 ++ 4 ++ 3 ++ 1 ++ 3 ++ 2 ++ 1
13 мин +++ 4 +++ 3 +++ 2 ++ 3 ++ 2 ++ 2 ++ 2 ++ 2 ++ 2 + 1
18 мин +++ 4 ++ 2 ++ 2 ++ 2 ++ 2 ++ 2 ++ 1 + 2 + 1 - 1
23 мин ++ 3 + 2 ++ 2 + 2 ++ 2 ++ 2 + 1 - 1 - 1
28 мин ++ 2 + 2 + 1 + 1 + 1 + 1 - 1
33 мин + 2 + 2 -1 - 1 - 1 - 1
38 мин + 2 - 1
43 мин + 1
Некоторое количество спермиев (1-2 %) в варианте 1 при температуре 4 °С сохраняло колебательные движения в течение 2 часов.
Из табл. 1 видно, что оценки не всегда совпадают. Так, например, проба, оцененная в 5 баллов, может иметь три или четыре плюса. По шкале Персова 1 балл ставится при полностью неподвижных спермиях. В таблице есть пробы, оцененные нами на 1 балл и + соответственно. В этих случаях количество живых спермиев не превышало 5 %.
Кафедрой «Аквакультура и водные биоресурсы» Астраханского государственного технического университета и лабораторией «Аквакультура и биологические ресурсы» Южного научного центра РАН проводятся исследования по проблемам замораживания, длительного хранения и использования в аквакультуре спермы различных видов осетровых рыб. Накопленный материал позволил создать инновационные технологии криосохранения и последующего использования половых продуктов осетровых. При их внедрении можно добиться таких важнейших прикладных результатов, как значительная экономия площадей, поскольку отпадает необходимость содержать стадо самцов; возможность получать икру в любое удобное для хозяйства время; возможность обмениваться или закупать замороженную сперму для предотвращения инбридинга; широкое поле деятельности для производства различных гибридных форм с высокой степенью гетерозиса; сохранение генетического материала редких и исчезающих осетровых.
В покупке технологий криоконсервации половых клеток осетровых заинтересованы существующие и проектируемые рыбоводные хозяйства в Российской Федерации и за рубежом. Осетроводство в настоящее время является крайне привлекательной отраслью для инвесторов во всем мире. Активно развивается в этом отношении Юг России, Московская и прилегающие к ней области, европейские страны, в первую очередь Германия, Италия, Испания, Франция, Румыния, Болгария. Развивается аквакультура осетровых в Северной (США) и Южной Америке (Уругвай и Чили). Строятся крупные комплексы в Азии (Объединенные Арабские Эмираты, Малайзия, Казахстан, Туркмения, Китайская Народная Республика и др.). Все эти предприятия крайне заинтересованы в той экономии производственных площадей и независимости от обстоятельств при получении посадочного материала, которые может обеспечить внедрение современных достижений в области криобиологии.
Несомненно, что технологии криосохранения половых клеток осетровых будут широко востребованы не только для целей коммерческого рыборазведения, но и в значительной степени для применения в воспроизводстве естественных популяций осетровых и сохранения чистых редких и исчезающих видов этих уникальных рыб.
Криоконсервация остается одним из наиболее привлекательных и быстроразвивающихся направлений сохранения редких исчезающих видов. Наличие в криобанке генетически репрезентативных коллекций геномов рыб и маточных стад на осетровых рыбоводных заводах позволяет с максимальным эффектом сохранить генетическое разнообразие этих ценных промысловых рыб.
Определение оптимальных темпов замораживания и состава криозащитных сред является главным направлением исследований в этой области. Эта проблема актуальна не только для России, но и для всего мира. Например, в Центральном научно-исследовательском институте рыбного хозяйства в г. Трабзон (Турция) также проводят исследования в области криозамораживания спермы различных видов рыб, в том числе и осетровых.
Летом 2009 г. нами был поставлен ряд совместных экспериментов по криозамораживанию спермы русского осетра. Работа проводилась с двумя самцами. Полученная сперма хранилась в холодильнике при температуре +4 °С.
Сама методика замораживания состоит из следующих этапов:
— сбор материала;
— оценка качества спермы;
— подготовка криозащитных сред;
— оценка качества спермы после эквилибрации;
— наполнение пробирок;
— замораживание;
— оценка качества после разморозки.
Для более удобной оценки качества нативной спермы мы решили использовать как балльную шкалу Персова, так и систему турецких исследователей. Качество нативной спермы показано в табл. 2.
Таблица 2
№ самца Качество спермы
І 5; +++; 95 %
2 5; +++; І00 %
В качестве криозащитных сред использовались: НС1-трис-буфер с диметилсульфоксидом (ДМСО), НС1-трис-буфер с метанолом и среда Штайна, которые добавлялись к сперме в соотношении 1 : 1.
Качество спермы после эквилибрации при температуре +4 °С в течение 40 минут показано в табл. 3.
Таблица 3
Кризащитная среда
№ самца HO-трис-буфер с ДМСО HO-трис-буфер с метанолом Среда Штайна
І 4; +++; 80 % 4; ++; 60 % 4; +++; 85 %
2 5; +++; 90 % 4; ++; 80 % 4; +++; 90 %
В качестве емкостей для замораживания использовали соломинки вместимостью 0,5 мл, один конец которых был глухим, а другой запаивался обычной зажигалкой после наполнения.
Замораживание осуществляли вручную. В пенопластовый контейнер заливали жидкий азот, над поверхностью которого на высоте 5 см помещали металлическую плиту с соломинками. Таким образом, замораживание происходило в парах азота. Скорость замораживания регулировалась высотой металлической плиты над поверхностью жидкого азота. После заморозки соломинки помещали в жидкий азот в черпаках.
Размораживание происходило при температуре +37 °С. Качество спермы после дефроста-ции показано в табл. 4.
Таблица 4
№ самца Криозащитная среда
HO-трис-буфер с ДМСО HO-трис-буфер с метанолом Среда Штайна
І 3; +; І5 % 2; +; І0 % 3; ++; 25 %
2 3; +; 20 % 2; + ; І5 % 3; ++; 30 %
Такое малое количество живых спермиев после дефростации можно объяснить тем, что скорость замораживания соблюдалась не очень четко и практически не контролировалась. Интенсивность испарения изменялась с изменением уровня азота в контейнере.
Эксперименты показали некоторые практические отличия методов оценки качества спермы по балльной шкале Персова, принятой в России, и по системе, используемой турецкими исследователями.
В результате исследований установлено, что активность спермы дольше всего сохраняется при температуре среды +4 °С. Количество живых спермиев и скорость их движения оказались наибольшими при температуре воды +9 °С.
СПИСОК ЛИТЕРА ТУРЫ
1. Персов Г. М. Дозирование спермиев как способ управления оплодотворением яйцеклеток осетровых: Докл. АН СССР. - 1953. - Т. 90, № 6. - С. 1183-1185.
2. Criopreservation of Chinese sturgeon (Acipenser sinensis) sperm / L. Liu, Q. Wei, F. Guo et al. // J. Appl. Ichthyol. - 2006. - Vol. 22. - P. 384-388.
Статья поступила в редакцию 2.03.2010
ESTIMATION OF THE QUALITY OF THE SPERM OF STURGEON FISHES EMPLOYING DIFFERENT METHODS AND THE EXPERIENCE OF ITS LOW-TEMPERATURE CONSERVATION
V. G. Chipinov, E. S. Dzharigazov, N. V. Bolonina
The comparative estimation of the quality of the sperm of Russian sturgeon with the use of activated water of different temperature has been made. Experiments showed some practical differences in the methods of evaluating the quality of sperm according to the Persov’s number scale, accepted in Russia, and according to the system, utilized by Turkish researchers, and also substantial difference in the time of the activity between the versions of experiment. The tests of different cryoprotective media while freezing the Russian sturgeon sperm have been carried out.
Key words: sperm activation, the temperature of medium, activity, cryoprotective media.
