Оценка генотоксичности объектов окружающей среды Текст научной статьи по специальности «Энергетика и рациональное природопользование»

УДК 575.224.667.281.155

ОЦІНКА ГЕНОТОКСИЧНОСТІ ОБ’ЄКТІВ НАВКОЛИШНЬОГО СЕРЕДОВИЩА О.В. Усенко, доцент, к.б.н., ХНАДУ

Анотація. Визначали генотоксичность об ’єктів довкілля за допомогою методики біотесту-вання на мухах Drosophila melanogaster. Апробація методу на різних категоріях вод і водних витяжок з ґрунтів і донних відкладів дозволяє рекомендувати використання даної тест-системи для експресного виявлення генотоксичності об ’єктів навколишнього середовища.

Ключові слова: генотоксичність, біотестування, муха Drosophila melanogaster, об ’єкти довкілля.

ОЦЕНКА ГЕНОТОКСИЧНОСТИ ОБЪЕКТОВ ОКРУЖАЮЩЕЙ СРЕДЫ Е.В. Усенко, доцент, к.б.н., ХНАДУ

Аннотация. Определяли генотоксичность объектов окружающей среды с помощью методики биотестирования на мухах Drosophila melanogaster. Апробация метода на разных категориях вод и водных вытяжек с грунтов и донных отложений позволяет рекомендовать использование данной тест-системы для экспрессного выявления генотоксичности объектов окружающей среды.

Ключевые слова: генотоксичность, биотестирование, муха Drosophila melanogaster, объекты окружающей среды.

GENOTOXICITY EVALUATION OF ENVIROMENTAL OBJECTS E. Usenko, Associate Professor, Candidate of Biological Science, KhNAHU

Abstract. The genotoxicity of environmental objects with the help of biotesting procedure on Drosophila melanogaster is determined. The approbation of the given method on various categories of water and water extracts from soils and bottom-sediments allows to recommend the use of the given testsystem for express revealing of the environmental objects genotoxicity.

Key words: genotoxicity, biotesting, Drosophila melanogaster, environmental objects.

Вступ

При вирішенні проблеми збереження природної біологічної розмаїтості фауни і флори та охорони здоров’я людини необхідно одержання інформації про генетичну небезпеку забруднення об’єктів довкілля для попере -дження розвитку мутагенних процесів і спадкових захворювань.

Аналіз публікацій

Визначення генотоксичності об’єктів навколишнього природного середовища за допо-

могою методики біотестування на мухах Drosophila melanogaster має, у порівнянні з іншими тест-системами (бактерії, рослини, культура тканин та інші), ряд переваг, які зумовлені тим, що у дрозофіли можна виявити всі типи мутацій. Вона має мале число хромосом, короткий життєвий цикл, велику плідність; метаболічна активація речовин, які поступають до організму, така, як у людини. Дані, отримані за допомогою цієї тест-системи, можуть бути екстрапольовані на високоорганізованих тварин, що включають і ссавців, і використані як прогноз ризику забруднення середовища для здоров’я людини [1].

Об’єктами дослідження слугували лінії дикого типу Oregon-R і Canton-S.

При визначенні генотоксичності забруднень навколишнього природного середовища використовували метод обліку частоти домінантних летальних мутацій (ДЛМ), який дозволяє враховувати геномні, хромосомні та генні мутації; є відносно простим, тому що не потребує ліній тестерів, і рекомендується при перевірці мутагенних якостей лікарських препаратів [2].

Мета і постановка задачі

Для використання методу ДЛМ при біотес-туванні з метою визначення генотоксичності об’єктів довкілля необхідно вирішення наступних задач:

- установлення метрологічних характеристик методу і діапазону реагування на еталонну речовину;

- проведення апробації методу на природних, зворотних, питних водах, ґрунтах і донних відкладеннях.

Суть методу обліку частоти ДЛМ полягає в наступному:

- імаго D. melanogaster (самців і самок окремо) обробляли природними, зворотними питними водами, витяжками з ґрунтів і донних відкладень протягом 72 годин;

- потім самців і самок поміщали в окремі пробірки до схрещування у співвідношенні !:!;

- через 24 години самок відсаджували на агарові пластинки, через 8 годин їх видаляли і підраховували загальну кількість відкладених яєць;

- через 48 годин розраховували % ДЛМ шляхом обліку трьох типів яєць: прозорих (неза-пліднених), матових (загибель до 9 годин ембріонального розвитку) і пофарбованих від жовтого до коричневого кольору (пізня ембріональна загибель після 9 годин розвитку);

- висновок про наявність або відсутність генотоксичності проби води (водної витяжки) робили на підставі встановлення перевищення частоти ДЛМ в дослідних зразках порівняно з контрольними;

- в якості генотоксичної речовини в експериментах використовували калій двохромовокислий, або біхромат калію (К2Сг2О4);

- метрологічні характеристики встановлювали відповідно до «керівного нормативного документа» (КНД 211.1.05) [3].

Визначення діапазону реагування тест-об’єкта та апробація методу

Визначення діапазону реагування тест-об’єкта на еталонну речовину і відтворюва-ності результатів біотестування на D. melanogaster.

З метою перевірки придатності тест-об’єкта для біотестування визначали діапазон реагування на еталонну речовину. Еталонною речовиною може бути яка-небудь речовина, якщо вона відповідає вимогам токсикологічних і фізико-хімічних характеристик (достатньо високий рівень токсичності, стабільність розчинів та ін.).

Для визначення діапазону реагування D. melanogaster було використано ^Cr2O7. Цю речовину обрано еталонною тому, що вона не має в складі молекули води, і водні розчини її стабільні. Генотоксична активність виявлена в результаті досліджень як на мікроорганізмах, так і на ссавцях [4-8].

Вплив біхромату калія на частоту ДЛМ у D. Melanogaster досліджено у концентраціях від 0,1 до 15.0 мг/л. Результати показали, що частота ДЛМ у всіх випробуваних концентраціях ^C^O-? статистично вірогідно перевищує контроль. При цьому перевищення % ДЛМ росте зі збільшенням концентрації ^C^O-? від 0,1 до 5 мг/л, збільшення порівнянні з контролем у 1,4-2,8 рази. За концентрацій 10,0 і 15,0 мг/л частота ДЛМ залишається на рівні концентрації ^C^O-? 5 мг/л.

Таким чином, у результаті проведених досліджень були виявлені концентрації від 0,1 до 5 мг/л, що впливають на динаміку росту частоти ДЛМ. Для перевірки придатності тест-об’єкта до біотестування безпосередньо перед його проведенням або у процесі культивування лінії дрозофіли визначали ефективну концентрацію (ЕК) K2Cr2O7, яка викликає вірогідне збільшення частоти ДЛМ. Якщо значення ЕК знаходяться у встановленому діапазоні реагування, тест-об’єкт можна використовувати для біотестування.

ЕК визначали в 16 незалежних експериментах. Було виявлено наступні значення ЕК К2 Cr2O7 (табл. 1).

В результаті таких досліджень встановлено наступний діапазон реагування для D. melanogaster. 0,1 - 0,3 мг/л ^C^O?.

Таблиця 1 Значення ефективної концентрації (ЕК) К^СьО^в мг/л

Установка метрологічних характеристик необхідна для забезпечення єдиних визначень генотоксичності за даним методом. Головною метрологічною характеристикою методу біотестування є відтворюваність результатів. Відтворюваність результатів - характеристика якості біотестування, що відображає близькість результатів тестування, отриманих за єдиною методикою, на одній еталонній речовині, але в різних умовах (наприклад, у різний час).

В ході статистичної обробки експериментальних даних поряд з іншими показниками обчислювали дисперсію - величину, яка відображає ступень варіювання ознаки, що у даному випадку і характеризує відтворюва-ність результатів визначень розчинів еталонної речовини (К2Сг2О7) за досліджуваною ознакою (% ДЛМ). У наших дослідженнях дисперсія в-середньому складала 32 %, що відповідає концентрації К2 Сг2О7 - 0,061 мг/л. Така низька величина концентрації біхромату калію, за якої ймовірно вірогідне перевищення контролю за % ДЛМ, свідчить про відтворюваність результатів визначень гено-

токсичності розчинів використаної еталонної речовини за досліджуваною ознакою.

Таким чином, у результаті проведених досліджень було встановлено відтворюваність методу, що забезпечує єдність визначень гено-токсичності, та діапазон реагування тест-об’єкта на еталонну речовину, використовується для перевірки придатності дрозофіли, з метою біотестування, і зумовлює вірогідність результатів.

З метою встановлення області використання методу біотестування на Б. melanogaster для визначення генотоксичності об’єктів довкілля було проведено апробацію на стічних, поверхневих і питних водах; витяжках з ґрунту і донних відкладів. У пробах води та витяжках визначали наявність чи відсутність гено-токсичної дії на Б. melanogaster за час біотестування. Результати апробації наведено у табл. 2.

Наведені в табл. 2 дані свідчать про переважне виявлення за допомогою апробованого методу генотоксичності проб стічної та поверхневої води, а також витяжки з донних відкладів, з яких усі випробувані виявили генотоксичність. Високий відсоток геноток-сичних проб (68 %) був виявлений при апробації на питних водах. При апробації на витяжках з ґрунту було виявлено 38 % генотоксичних проб.

Підсумки апробації свідчать про можливість використання методу біотестування на дрозофілах для генотоксичного аналізу вод з високим рівнем токсичності: стічних, поверхневих, забруднених питних вод; водних витяжок з донних відкладів і ґрунту.

Генотоксична оцінка водних джерел дозволяє враховувати ризик токсичного забруднення водного середовища для здоров’ я людини.

№ з/п ЕК К2Сг2О7 в мг/л

1 0,1

2 0,1

3 0,25

4 0,25

5 0,25

6 0,25

7 0,1

8 0,2

9 0,25

10 0,15

11 0,1

12 0,25

13 0,2

14 0,25

15 0,15

16 0,25

Таблиця 2 Результати апробації методики біотестування на Б. melanogaster

Об єкти довкілля Кількість проб % генотоксичних проб

тестованих генотоксичних

Стічна вода 2 2 100

Поверхнева вода 5 5 100

Питна вода 120 68 56

Водні витяжки з ґрунту 102 38 38

Водні витяжки з донних відкладів 4 4 100

Щоб якомога раніше оцінити небезпеку по-лютантів, що попадають у природні води, які використовуються населенням, рекомендується використовувати біотести, що дозволяють оперативно установити потенційну загрозу забруднення, здатність води до самоочищення [8].

Оцінка генотоксичності об’ єктів довкілля на підставі біотестування забезпечує ранню діагностику їх якості. Оперативно отримана інформація дозволяє провести наступну перевірку несприятливої ситуації прийнятими в медичній токсикології методами з використанням теплокровних тварин і вчасно вжити заходів з усунення назріваючої загрози здоров’ю населення і створення напруженої екологічної обстановки.

Висновки

1. Виявлено залежність виникнення частоти ДЛМ у D. melanogaster від різних концентрацій К2 Cr2O7.

2. Встановлено діапазон реагування тест-об’єкта на еталонну речовину та відтворюва-ність методу визначення генотоксичності за обліком % ДЛМ.

3. Проведено апробацію методу на різних категоріях вод і водних витяжок з ґрунтів і донних відкладів з використанням D. melano-gaster в якості тест-системи, на основі якої він рекомендується для експресного виявлення генотоксичності об’ єктів навколишнього середовища.

Література

1. Бочков Н.П. Наследственность человека и

мутагены внешней среды / Н.П. Бочков, А.Н. Чеботарев. - М. : Медицина. -1989. - Гл. 8. - С. 163-167.

2. Методические рекомендации по проверке

мутагенных свойств новых лекарственных препаратов. - М. : Медицина, 1981.

- 56 с.

3. Атестація методик біотестування: КНД

211.1.9.51-96: затв. Мінекобезпеки України 22.01.97. - Київ, 1997. - 33 с.

4. Bianchi V. Genetic effect of chromium com-

pounds / V. Bianchi, L. Cellotti, G. Lan-franchi, F. Majona and others. // Mutat. Res. - 1983. - Vol. 117. - P. 279-300.

5. Deflora S. Study of 106 organic and in organs

compounds in the Salmonella microsome test / S. Deflora // Carcinogenesis. - 1981.

- Vol. 2. - P. 283-298.

6. Пашин Ю.В. Мутагенная активность со-

единений хрома / Ю.В. Пашин, В.Я. Козаченко // Гигиена и санитария. - 1981. -№5. - С. 46-49.

7. Imreh St. Cytogenetic effects of chromium in

vivo and in vitro / St. Imreh, D. Radulescu // Mutat. - 1982 - Vol. 97. - P. 192-193.

8. Красовский Г.Н. Система критериев ком-

плексной оценки опасности химических веществ, загрязняющих окружающую среду / Г.Н. Красовский, С.Л. Авалиани,

З.И. Жолдакова, Г.Н. Косяков // Гигиена и санитария. - 1992. - № 9-10. - С. 23-60.

Рецензент: В.О. Юрченко, професор, д.т.н., ХНАДУ.

Стаття надійшла до редакції 4 листопада 2010 р.