CC BY
69
УДК 632.954:632.95.028
A.М. Антоненко,
B.Г. Бардов,
О.М. Коршун,
В.В. Карпенко,
М. М. Коршун,
А. О. Ліпавська
Національний медичний університет імені О. О. Богомольця Інститут гігієни та екології
(дир. - член-кор. НАМН України, проф. В.Г. Бардов) м. Київ
ОПТИМІЗАЦІЯ АНАЛІТИЧНОГО КОНТРОЛЮ ЗАЛИШКОВИХ КІЛЬКОСТЕЙ ДІЮЧИХ РЕЧОВИН ГЕРБІЦИДУ МАЙСТЕР ПАУЕР ОБ
Ключові слова: гербіциди, високоефективна рідинна хроматографія, об’єкти навколишнього середовища Key words: herbicides, highperformance liquid chromatography, environmental objects
Резюме. Разработаны высокочувствительные и селективные методы определения форамсульфурона, тиенкарбазон-метила и ципросульфа-мида при совместном присутствии в пробах воды, почвы и зерна кукурузы с использованием высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методы основаны на экстракции гербицидов из проб, очистке экстрактов от коэкстрактивных веществ и дальнейшем хроматографическом определении. Внедрение разработанных и запатентованных методов в практику оптимизирует контроль за применением гербицидов в сельском хозяйстве и их мониторинг в окружающей природной среде.
Summary. The highly sensitive and selective methods for determination of foramsulfuron, thiencarbazone-methyl and cyprosulfamide under their combined presence in water, soil and maize samples using high-performance liquid chromatography were developed. Methods are based on extraction of herbicides from the samples, purification of extracts from coextract substances and further chromatographic determination. Implementation of developed and patented methods into practice helps to control usage of herbicides in agricultural practice and optimize their monitoring in the environment.
Антирезистентна стратегія застосування пестицидів передбачає не лише розробку сполук з новим механізмом дії, але і впровадження препаратів на основі двох і більше діючих речовин (д.р.), тобто комбінованих. Серед дозволених до використання в Україні 573 гербіцидних форму-ляцій кількість комбінованих становить 117, тобто 20 % [2]. Д.р. комбінованого препарату можуть чинити як різну, так і однакову біологічну дію на цільовий об’єкт та належати як до різних, так і до однієї хімічної групи. Зокрема, обидві д.р. препарату Євро-лайтнінг - імазамокс та іма-запір - належать до імідазолінонів та пригнічують активність ацетолактатсинтетази, чим гальмують синтез амінокислот. Дві д.р. препарату Бетанал експерт - десмедифам та фенме-дифам - належать до фенілкарбаматів та за механізмом гербіцидної активності є інгібіторами фотосинтезу, третя д.р. - етофумезат -представник бензофуранів та інгібує синтез ліпідів [15].
Застосування в сільському господарстві комбінованих препаратів ставить завдання визначення в об’єктах довкілля їх д.р. при сумісній присутності. Так, нами були підібрані умови одно-
часного визначення у воді та ґрунті трьох імі-дазолінонів - імазапіру, імазамоксу та імазе-тапіру [5].
В Україні з 2003 року був дозволений до використання комбінований гербіцид МайсТер 62 WG (фірма „Байєр КропСаєнс АГ”, Німеччина) [8]. У 2010 році були проведені державні випробування на кукурудзі удосконаленого варіанту препарату - МайсТер Пауер ОБ (д.р. -форамсульфурон, 31,5 г/л + йодсульфурон-метил натрію, 1 г/л + тієнкарбазон-метил, 10 г/л + антидот ципросульфамід, 15 г/л). Усі його 3 д.р. належать до великого і дуже перспективного класу інгібіторів ацетолактатсинтетази, але форамсульфурон та йодсульфурон-метил натрію
- до сульфонілсечовин, а тієнкарбазон-метил -до сульфоніламіно-карбоніл-триазолінонів; гер-біцидний антидот та регулятор росту рослин -ципросульфамід - віднесено до групи суль-фонамідів [15]. Слід звернути увагу на низький вміст у формуляції йодсульфурон-метил натрію, але значний вміст токсикологічно значущої сполуки - ципросульфаміду, для якої, як і для д.р. препарату, обґрунтовані допустима добова доза та гігієнічний норматив у зерні кукурудзи.
Раніше фахівцями Інституту екогігієни і токсикології імені Л.І. Медведя були розроблені аналітичні методи визначення форамсульфурону та йодсульфурон-метил натрію; фахівцями Інституту гігієни та екології Національного медичного університету імені О.О. Богомольця - методи визначення тієнкарбазон-метилу та ципросуль-фаміду (табл. 1). Усі ці методики ґрунтувались на високоефективній рідинній хроматографії (ВЕРХ) та передбачали визначення в пробі кожної сполуки окремо. Фахівці Федерального наукового центру гігієни ім. Ф.Ф. Ерисмана (Росія) для контролю за застосуванням препарату Аден-го 465 8С розробили методику одночасного визначення тієнкарбазон-метилу та ципросуль-фаміду, але визначення його третьої складової -
ізоксафлютолу - потребувало інших пробопід-готовки та умов хроматографування [4].
Враховуючи зазначене, метою нашого дослідження була розробка хроматографічних методів аналітичного визначення форамсульфурону, ті-єнкарбазон-метилу та ципросульфаміду при сумісній наявності в об’єктах навколишнього середовища.
МАТЕРІАЛИ ТА МЕТОДИ ДОСЛІДЖЕНЬ Для досягнення мети було необхідно обрати хроматографічний метод, розробити умови якісної ідентифікації та кількісного визначення форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та ци-просульфаміду при сумісній наявності, визначити екстрагенти та способи очищення екстрактів проб води, ґрунту та зерна кукурудзи.
Таблиця 1
Гігієнічні нормативи та межі кількісного визначення форамсульфурону, йодсульфурон-метил натрію, тієнкарбазон-метилу та ципросульфаміду [3]
Об’єкт Гігієнічний Межа Номер
кількісного методичних
дослідження норматив
визначення вказівок
Форамсульфурон
Вода Ґрунт Зерно кукурудзи ГДК - 0,002 мг/дм3 ОДК - 0,08 мг/кг МДР - 0,05 мг/кг 0,001 мг/дм3 0,05 мг/кг 0,05 мг/кг № 431-2003 № 433-2003 № 432-2003
Йодсульфурон-метил натрію
Вода ГДК - 0,06 мг/дм3 0,005 мг/дм3 № 238-2001
Ґрунт ГДК - 0,01 мг/кг 0,005 мг/кг
Зерно кукурудзи МДР - 0,025 мг/кг 0,025 мг/кг № 367-2002
Тієнкарбазон-метил
Вода Ґрунт Зерно кукурудзи ГДК - 0,01 мг/дм3 ОДК - 0,4 мг/кг МДР - 0,4 мг/кг 0,005 мг/дм3 0,25 мг/кг 0,2 мг/кг № 933-2009 № 934-2009 № 936-2009
Ципросульфамід
Вода - 0,02 мг/дм3 № 1065-2011
Ґрунт - 0,2 мг/кг № 1063-2011
Зерно кукурудзи МДР - 0,5 мг/кг 0,5 мг/кг № 1064-2011
При розробці аналітичних методів визначення досліджуваних сполук використовували аналітичні стандарти форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та ципросульфаміду з вмістом д.р. 98,4;
99,2 та 98,8 % відповідно. Хімічні назви, структурні формули та фізико-хімічні властивості досліджуваних сполук наведені у табл. 2.
Вихідний стандартний розчин кожної з досліджуваних речовин містив 100 мкг сполуки в
1 мл ацетонітрилу. Змішуванням та послідовним розведенням цих вихідних розчинів сумішшю ацетонітрил-0,1 % водний розчин ортофосфорної кислоти (35+65, об.+об.) готували 5 робочих градуювальних розчинів суміші досліджуваних речовин з масовою концентрацією кожної сполуки 6; 5; 4; 2 та 1 мкг/мл та контрольний розчин суміші з масовою концентрацією кожної сполуки 3 мкг/мл.
Таблиця 2
Фізико-хімічні властивості досліджуваних сполук [13, 14]
Ознака Сполука
форамсульфурон тієнкарбазон-метил ципросульфамід
Назва за ІЮПАК
Хімічна
формула
1-(4,6-диметоксипіримідин-2-іл)-3-[2-(диметилкарбамоїл)-5-формамідофетлсульфоніл] сечовина
•СОК(СИ3)2 3О2ШСОШ
метил 4-[(4,5-дигідро-3-метокси-4- N-[4-
метил-5-оксо-1Н-1,2,4-тріазол-1- (циклопропілкарбамоїл)фенілс
іл)карбонілсульфамоїл] -5- ульфоніл]-о-анізамід
метилтіофен-3-карбоксилат
* О N
СН3 Н
о О
лл
.-СН3
Н3С
Емпірична формула
Молекулярна маса, г/моль
Температура плавлення, °С
Тиск насиченої пари,
Па
Коефіцієнт розподілу Кото (20 °С), logРow
Розчинність у воді(20 °С),
г/л
Розчинність в органічних розчинниках (20 °С), г/л
С17Н20^078
452.4
194.5
4,2х10-11 (20 °С)
-0,78 (рН 7)
0,04 (рН 5) 3,3 (рН 7) 94,6 (рН 8)
ацетон - 1,925 метанол - 1,660 гептан - <0,010
СцН^^^
390,4
205
9,0х10-14 (25 °С)
-1,98 (рН 7) 0,436
ацетон - 9,54 етанол - 0,23 гексан - 1,5х10"4
Cl8Hl8N205S
374,4
217
<2,2х10-2 (50 °С)
3,4 (рН 4)
1,1 (рН 7)
26 (рН 8)
етанол - 0,47 гексан - <0,001
ОСН
ОСН
О
Хроматографічний аналіз розчинів суміші досліджуваних сполук проводили на рідинному хроматографі фірми Шимадзу (Японія) з ультрафіолетовим (УФ) детектуванням. Спочатку проводили хроматографічний аналіз розчину кожної речовини для подальшої ідентифікації піку конкретної сполуки на хроматограмі суміші. Після вибору оптимальних умов розділення форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та цип-росульфаміду, хроматографування кожного гра-дуювального розчину суміші проводили тричі для побудови графіків залежності висоти хроматографічного піка кожної сполуки від концентрації.
Ідентифікацію форамсульфурону, тієнкарба-зон-метилу та ципросульфаміду в екстрактах проб води, ґрунту та кукурудзи проводили за часом утримування кожної з трьох сполук в градуювальних розчинах суміші, кількісне визначення - за відповідною залежністю висоти хроматографічного піку речовини від концен-
трації в градуювальному розчині, яку встановлювали на підставі кореляційного та регресій-ного аналізів.
РЕЗУЛЬТАТИ ТА ЇХ ОБГОВОРЕННЯ
Враховуючи фізико-хімічні властивості досліджуваних сполук (табл. 2), а саме, кращу розчинність у полярних (метанол, ацетон), ніж у неполярних (гексан, гептан) розчинниках, молекулярну масу (< 3000) та низьку леткість форам-сульфурону і тієнкарбазон-метилу, серед усіх хроматографічних методів ми обрали метод обер-нено-фазової ВЕРХ.
Хроматографічне розділення та детектування досліджуваних сполук є важливим етапом методики виконання вимірювань. Для отримання адекватних результатів визначення досліджуваних речовин при сумісній наявності необхідно було встановити оптимальні умови хромато-графування суміші форамсульфурону, тієнкар-базон-метилу та ципросульфаміду: найбільш чутливий та селективний детектор, придатні неру-
хому та рухому фази, швидкість потоку рухомої фази, мінімальну кількість речовини, що детек-тують, та лінійний діапазон детектування.
При обернено-фазовій хроматографії нерухома фаза неполярна, рухома - дуже полярна (наприклад, водні розчини ацетонітрилу чи метанолу). Найпоширенішою нерухомою фазою є обернена фаза С18, яку використовують для розділення як неполярних, так і полярних водорозчинних та малополярних сполук. Тому як нерухому фазу ми використали Нуклеосил 100-
5 С18, яким була заповнена сталева колонка довжиною 25 см, внутрішнім діаметром 4,6 мм.
На ефективність розділення речовин істотно впливає вибір елюенту. При підборі рухомої фази для хроматографічного розділення досліджуваних сполук ми випробовували суміші ацето-нітрил-вода, метанол-вода, ацетонітрил-водні розчини ортофосфорної або оцтової кислот у різних за об’ємом співвідношеннях. Встановлено, що оптимальною для елюювання досліджуваних сполук є суміш ацетонітрил-0,1 % водний розчин ортофосфорної кислоти (35+65,
об.+об.) з об’ємною витратою 1 мл/хв.
Спектри більшості пестицидів характеризуються поглинанням в ультрафіолетовій (УФ) зоні, а розчинники, що зазвичай використовують в обернено-фазовій ВЕРХ (метанол, ацетонітрил, вода), прозорі для УФ випромінювання [1, 11].
Тому для визначення досліджуваних сполук ми використали УФ детектор з дейтерієвою лампою. Хроматографічний аналіз проводили при довжині хвилі 230 нм, яка, за результатами проведених нами досліджень залежності розміру піку на хроматограмі від довжини хвилі УФ променів, була визнана найбільш вдалою для одночасного детектування усіх досліджуваних речовин.
Для встановлення оптимальної чутливості, мінімальної кількості кожної сполуки, що детек-тують, та лінійного діапазону детектування, в інжектор хроматографа з петлею 20 мкл вводили градуювальні розчини суміші форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та ципросульфаміду з різними концентраціями, починаючи з максимальної. Аналіз проводили при температурі колонки 30 °С.
Встановлено, що при чутливості 0,02 одиниці абсорбції на шкалу мінімальна кількість детектування кожної сполуки становить 20 нг, лінійний діапазон детектування - (20-120) нг. Час утримування форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та ципросульфаміду за таких умов хро-матографування становить 7,1±0,1; 10,8±0,1 та 12,0±0,1 хвилини відповідно. Типова хромато-грама суміші приведена на рис. 1, градуювальні графіки залежності висоти хроматографічного піку сполуки (мм) від концентрації у градую-вальному розчині (мкг/мл) - на рис. 2.
Рис. 1. Хроматограма градуювального розчину суміші форамсульфурону (1), тієнкарбазон-метилу (2) та ципросульфаміду (3) з масовою концентрацією 4 мкг/мл кожної сполуки
01234567
Концентрація, мкг/мл
О форамсульфурон О тієнкарбазон-метил Д ципросульфамід
Рис. 2. Градуювальні залежності висоти хроматографічного піка форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та ципросульфаміду (мм) від концентрації у градуювальному розчині (мкг/мл)
Градуювальні залежності висоти хроматографічного піка форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та ципросульфаміду (мм) від концентрації у градуювальному розчині (мкг/мл) описані рівняннями лінійної регресії:
Иї = -0,16+6,55хр, (1)
И = 2,39+18,83x0, (2)
кс = 2,48+20,75x0, (3)
де к, И, Ис - висота піка форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та ципросульфаміду, мм;
р - масова концентрація форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу або ципросульфаміду в градуювальному розчині, мкг/мл.
Для одержання достовірних результатів якісного та кількісного визначення пестициду в
об’єктах довкілля дуже важливими є попередні стадії підготовки проби: екстракція сполуки та очистка отриманого екстракту від коекстрак-тивних речовин. Тому наступним етапом нашого дослідження була розробка способів підготовки проб води, ґрунту та зерна кукурудзи до подальшого хроматографічного визначення в них досліджуваних сполук.
Одним із найпоширеніших методів вилучення пестицидів з різних матриць залишається рідинна екстракція, яка характеризується універсальністю, нетривалістю операцій, експресністю та не призводить до руйнації досліджуваних компонентів [1, 10]. Одержані екстракти крім дослід-
жуваної сполуки містять значну кількість домішок, які ускладнюють подальше хроматографічне визначення, зокрема, призводять до появи сторонніх піків на хроматограмі, які можуть маскувати пестицид, що визначається [1, 9]. Цим зумовлена необхідність очищення екстрактів, для чого застосовують різноманітні фізичні та хімічні методи, вибір яких залежить від природи досліджуваної речовини та супутніх домішок [1, 12].
З проб води, підкислених 1 М водним розчином ортофосфорної кислоти, форамсульфурон, тієнкарбазон-метил та ципросульфамід екстрагували етилацетатом на апараті для струшування при температурі 60 °С; екстракт сушили безводним сульфатом натрію та концентрували на ротаційному випарнику. Досліджувані сполуки з проб ґрунту та зерна кукурудзи вилучали сумішшю ацетонітрил-вода. Отримані екстракти фільтрували через фільтр, аліквоту очищували на концентруючих патронах С18 та концентрували на ротаційному випарнику. Сухий залишок розчиняли в рухомій фазі та піддавали хроматографічному аналізу.
Розроблені нами оптимальні умови екстракції, очищення та хроматографічного визначення фо-рамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та ципро-сульфаміду при сумісній присутності в пробі води, ґрунту та зерна кукурудзи були покладені в основу двох патентів [6, 7].
ВИСНОВКИ
1. Розроблено умови одночасного визначення форамсульфурону, тієнкарбазон-метилу та ци-просульфаміду методом високоефективної рідинної хроматографії в об’ єктах навколишнього середовища, що дозволяє значно прискорити аналіз та зменшити витрати на його проведення.
2. Впровадження розроблених та запатентованих методів у практику роботи установ Дер-
жавної санітарно-епідеміологічної служби та Міністерства екології та природних ресурсів України сприяє контролю за застосуванням у сільському господарстві препаратів на їх основі, удосконаленню моніторингу пестицидів у довкіллі та проведенню заходів з мінімізації їх шкідливої дії на здоров’ я населення.
СПИСОК ЛІТЕРАТУРИ
1. Аналітична хімія залишкових кількостей пес-
тицидів: навч. посібник / М.А. Клисенко, Л.Г. Александрова, В.Ф. Демченко, Т.Л. Макарчук. - К.:
ЕКОГІНТОКС, 1999. - 238 с.
2. Доповнення до переліку пестицидів і агрохі-мікатів, дозволених до використання в Україні: за станом на 01.03.2011 р. / М-во екології та природних ресурсів України. Офіц. вид. - К.: Юнівест Медіа, 2011. - 368 с.
3. Допустимі дози, концентрації, кількості та рівні вмісту пестицидів у сільськогосподарській сировині, харчових продуктах, повітрі робочої зони, атмосферному повітрі, воді водоймищ, ґрунті: ДСанПіН 8.8.1.2.3.4.-000-2001 / МОЗ України. Офіц. вид. - К., 2001. - 244 с.
4. МУК 4.1.2766-10. 4.1. Методы контроля. Химические факторы. Измерение концентраций тиен-карбазон-метила, ципросульфамида и изоксафлютола в воздухе рабочей зоны и смывах с кожных покровов операторов методом высокоэффективной жидкостной хроматографии. Методические указания [Електронний ресурс]: ВеєІРгауо Информационно-правовой портал. - Режим доступу: http://bestpravo.ru/ гоє-8І]8ко.іе/ ^-погшу/к^^Ш. - Назва з екрану.
5. Пат. 24827 иА, МПК (2006) в0Ш 30/00. Спосіб визначення імідазолінонових гербіцидів у воді та ґрунті / Бардов В.Г., Омельчук С.Т., Коршун М.М., Гиренко Д.Б., Горбачевський Р.В.; власник Національний медичний університет імені О.О. Богомольця. - № и200703435; заявл. 29.03.2007; опубл. 10.07.2007, Бюл. № 10.
6. Пат. 58529 ИА, МПК в0Ш 33/18 (2006.01). Спосіб визначення сульфонілсечовинних гербіцидів у воді / Бардов В.Г., Антоненко А.М., Коршун М.М., Гиренко Д.Б., Коршун О.М.; власник Національний медичний університет імені О.О. Богомольця. - № и 2010 13998; заявл. 24.11.2010; опубл. 11.04.2011, Бюл. № 7.
7. Пат. 58531 ИА, МПК в0Ш 33/02 (2006.01), в0Ш 33/24 (2006.01). Спосіб визначення сульфоніл-сечовинних гербіцидів у ґрунті та зерні кукурудзи /
В.Г.Бардов, А.М.Антоненко, М.М.Коршун, Д.Б.Гиренко, О.М.Коршун; власник Національний медичний університет імені О.О. Богомольця. - № u 2010 14000; заявл. 24.11.2010; опубл. 11.04.2011, Бюл. № 7.
8. Перелік пестицидів і агрохімікатів, дозволених до використання в Україні / М-во екології та природних ресурсів України. Офіц. вид. - К.: Юнівест Маркетинг, 2003. - 352 с.
9. Практическая газовая и жидкостная хроматография: учеб. пособие / Б.В. Столяров, И.М. Савинов, А.Г. Виттенберг [и др.]. - СПб.: Изд-во С.-Петербург. ун-та, 1998. - 612 с.
10. Применение жидкостной экстракции в анализе водорастворимых витаминов / Н.Я. Мокшина, О.В. Ерина, Г.В. Шаталов, Д.В. Быковский // Аналитика и аналитики: другий міжнар. форум, 22-26 вересня 2008 р.: реферати докл. - Воронеж, 2008. - Т. 2.
- С. 481.
11. Садек П. Растворители для ВЭЖХ / Пол Са-дек. - М.: БИНОМ, Лаборатория знаний, 2006. - 704 с.
12. Чмиль В. Д. Состояние и перспективы использования современных инструментальных методов анализа пестицидов в Украине / В.Д. Чмиль // Современные проблемы токсикологии. - 2002. - № 2. - С. 56-61.
13. The e-Pesticide Manual [Електронний ресурс]: A World Compendium The e-Pesticide Manual / Version
3.2 2005-06. - Thirteenth Edition: СБ-вид-во CDS Tomlin, 2005. - 1 електрон. опт. диск (CD-R); 12 см. -Систем. вимоги: Pentium; 32 Mb RAM; CD-ROM Windows 95/98/2000/NT/XP. - Назва з титул. екрану.
14. The PPDB A to Z List of Pesticide Active Ingredients [Електронний ресурс]: PPDB: Pesticide Properties University of Hertfordshire. - Режим доступу: http://sitem.herts.ac.uk/aeru/footprint/en/index.htm. -Назва з екрану.
15. World of Herbicides Poster [Електронний ресурс]: HRAC Herbicide Resistance Action Committee.
- Режим доступу: http://www.hracglobal.com. - Назва з екрану.
♦
