CC BY
24
УДК 639.386.1: 57.085.2
Ключевые слова: рыбы, слизь, кровь, агрегация тромбоцитов
Key words: fish, mucus, blood, thrombocyte aggregation
'Фомина Л.Л., 'Кулакова Т.С., 2Жунина О.А., 'Ошуркова Ю.Л., 'Вайцель А.Э.
ОЦЕНКА ГЕМОСТАТИЧЕСКОЙ АКТИВНОСТИ СЛИЗИ КОЖИ РЫБ IN VITRO
EVALUATION OF FISH SKIN MUCUS HEMOSTATIC ACTIVITY IN VITRO
'ФГБОУ ВО «Вологодская государственная молочнохозяйственная академия им. Н.В. Верещагина» Адрес: 160555, Россия, Вологодская обл., г. Вологда, с. Молочное, Шмидта ул., д. 2.
E-mail: academy@molochnoe.ru
Vologda State Dairy Farming Academy named after N.V Vereshchagin, Federal State Budgetary Educational Institution of Higher Education Address: 160555, Russia, Vologda region, Vologda, Molochnoe village, Shmidta st. E-mail: academy@molochnoe.ru 2ОАО «Всероссийский научный центр молекулярной диагностики и лечения» Адрес: 117149, г. Москва, Симферопольский бульвар, д. 8. E-mail: olga_yarova@bk.ru Russian Research Center of Molecular Diagnostics and Therapy, Public Company Address: 117149, Russia, Moscow, Simferopolskiy blvd., 8. E-mail: olga_yarova@bk.ru
Фомина Любовь Леонидовна, к. б. н., доцент каф. внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства.
E-mail: fomina-luba@mail.ru. Тел. +7 921 122-17-63
Fomina Lyubov L., PhD of Biology Science, Associate Professor of the Internal Non-communicable Diseases, Surgery and Obstetrics Dept. E-mail: fomina-luba@mail.ru. Tel. +7 921 122-17-63 Кулакова Татьяна Сергеевна, к. с.-х. н., доцент каф. зоотехнии и биологии. E-mail: dofas@yandex.ru. Тел. +7 911 510-40-75 Kulakova Tatyana S., PhD of Agricultural Science, Associate Professor of the Zootechnics and Biology Dept.
E-mail: dofas@yandex.ru. Tel. +7 911 510-40-75 Жунина Ольга Александровна, к. б. н., зав. отделом биотехнологических и доклинических исследований.
E-mail: olga_yarova@bk.ru. Тел. +7 906 738-62-94 Zhunina Olga A., PhD of Biology Science, Head of Biotechnology and Preclinical Research Dept. E-mail: olga_yarova@bk.ru. Tel. +7 906 738-62-94 Ошуркова Юлия Леонидовна, к. б. н., доцент каф. внутренних незаразных болезней, хирургии и акушерства.
E-mail: yul.oshurkova@yandex.ru. Тел. +7 911 511-37-89 Oshurkova Yulia L., PhD in Biology Science, Associate Professor of the Internal Non-communicable Diseases, Surgery and Obstetrics Dept. E-mail: yul.oshurkova@yandex.ru. Tel. +7 911 511-37-89 Вайцель Анастасия Эдуардовна, аспирант факультета ветеринарной медицины и биотехнологий.
E-mail: nastya08066@mail.ru. Тел. +7 911 517-44-12 Vaytsel Anastasiya E., Post-Graduate Student of the Faculty of Veterinary Medicine and Biotechnology. E-mail: nastya08066@mail.ru. Tel. +7 911 517-44-12
Аннотация. В работе приведены результаты оценки гемостатических свойств слизи кожи карпов. Установлено, что время свертывания цельной крови овец под влиянием слизи составило (3,36±0,03) мин против (8,39±0,15) мин в контроле. При оценке влияния слизи на плазменно-коагуляционный гемостаз овец не получено достоверных значений. При использовании слизи кожи рыб как агониста тромбоцитов овец получили индекс агрегации (102,92±10,28) % против (19,2±2,36) % в контроле, скорость агрегации - (0,01±0,004) мин против (0,12±0,02) мин в контроле. Одновременно с этим образующиеся под действием слизи агрегаты тромбоцитов были одинаково устойчивы как в контрольной, так и в опытной группе. Индекс дезагрегации тромбоцитов составил (9,13±1,22) % против (9,09 ±0,41) % соответственно.
Summary. The work presents the evaluation results of carp skin mucus haemostatic properties. It has been found that coagulation time of whole sheep blood under the influence of mucus is (3,36±0,03) min. compared to (8,39±0,15) min. in the control. No reliable indicators have been obtained when evaluating the mucus influence on sheep's plasma-coagulation hemostasis. The aggregation index has been (102,92±10,28) % compared to (19,2±2,36) % in the control, the aggregation rate has been (0,01±0,004) min. compared to (0,12±0,02) min. in control when skin mucus was used as a sheep thrombocyte agonist. Simultaneously, the thrombocyte aggregates formed under mucus action were equally stable both in the control group and in the test group. The thrombocyte disaggregation index has been (9,13±1,22) % compared to (9,09±0,41) %, respectively.
Введение
В ветеринарной и медицинской хирургической практике для остановки кровотечений чаще всего применяются препараты на основе биологических тканей. На сегодняшний день существует несколько проектов, целью которых является создание универсального биологического клея, способного остановить кровотечение или же заживить рану. Тестируются и используются в хирургической практике: Клей «MeTro» (Австралийский университет, Сидней) на основе молекул белка протоэласти-на, который способен заклеить рану даже на лёгком, а в итоге ускорить ее заживление [7]; «DERMABOND» - клей медицинский для местного применения (Closure Medical Corp. (ETHICON, Inc.), в состав которого входит мономерное (2-октилцианоакрилат) вещество [4]; биологический клей «BioGlue»® компании CryoLife, Inc. (США), имеющий в основе альбумин плазмы быка (АПБ) [2].
Широкое применение нашли препараты на основе биологических тканей рыб и ракообразных. Препараты на основе хитозана активно применяются для остановки кровотечений в медицинской и военной практике [3]. Перевязочные материалы с использованием тромбина и фибриногена лосося удачно останавливали как аортальное, так и поверхностное раневое кровотечение, причем результаты этого исследования показали, что многократное воздействие плазменных белков лосося в течение шести месяцев не давало никаких неблагоприятных эффектов со стороны иммунной системы [10]. В Северо-Восточном федеральном университете имени М.К. Аммосова идут исследования по созданию медицинского биологического клея на основе плавательного пузыря осетра, богатого коллагеном. Новый препарат, разрабатываемый медицинским институтом и учеными-химиками биолого-географического факультета федерального вуза, позволит заживлять кожный покров и раны при оперативном вмешательстве на паренхиматозных органах - печени, почках, селезенке, легких [5]. Общим минусом является высокая стоимость, а также сложность получения компонентов для изготовления этих препаратов.
Известно, что слизь рыб обладает бактерицидными свойствами, а, так как в водной среде процесс свертывания крови затруд-
нен, возможно, слизь выполняет и гемо-статическую функцию. В настоящее время отсутствует информация о наличии на фармацевтическом рынке гемостатических препаратов на основе активных компонентов слизи кожи рыб, но в 1958-м году советские ученые Б.А. Кудряшов, Г.В. Андреенко, П.Д. Улитина нашли, что слизь с кожи трески, даже разведенная в 10 раз, способна свертывать оксалатную плазму в течение (12-13) сек и предположили, что она является богатым источником протромбокиназы [6].
Поэтому цель нашего исследования -оценка гемостатической активности слизи кожи рыб как возможной основы биомедицинского препарата для активации свертывания крови.
Материалы и методы
Для исследования использовали слизь с кожи карпов (Cyprinus carpio (Linnaeus), 1758), выращенных в промышленных условиях в рыбоводческом хозяйстве ООО РТФ «Диана» Ка-дуйского района Вологодской области. Слизь получали по методике Шультца и др. (2007), где слизь собиралась в полиэстеровые губки, нарезанные на кусочки 2*2*1 см. Рыбу вылавливали из аквариума, используя мелкий сачок, располагали непотревоженным боком кверху и давали в течение 5-ти секунд обсохнуть, затем проводили губкой, удаляя примерно 30 % слизи с одной стороны тела. Губка, содержащая слизь, помещалась в шприц, который выдавливался до тех пор, пока из губки не выходила проба слизи, которая помещалась в 1,5 мл пробирку Эппендорфа. В шприц с губкой добавляли 1 мл дистиллированной воды, которую затем выдавливали для растворения и выведения оставшейся слизи.
Влияние слизи на цельную кровь млекопитающих определяли следующим способом: на одно предметное стекло наносили автоматическим дозатором каплю нативной крови овцы в объеме 100 мкл, на второе предметное стекло - 50 мкл крови и 50 мкл слизи кожи рыб, каждые 30 сек определяли при осторожном наклоне стекла образование плотного сгустка. Точность метода оценивалась на основании результатов повторных определений гемостатической активности
слизи с одной и той же порцией крови донора (не менее 9-ти определений).
Влияние слизи кожи карпов на показатели плазменного гемостаза исследовалось в бедной тромбоцитами плазме (БТП), для получения которой кровь овец центрифугировали на лабораторной центрифуге со скоростью 3000 оборотов в минуту в течение 20-ти минут. Полученную плазму исследовали на од-ноканальном коагулометре THROMBOSTAT производства Behnk Elektronik (Германия). Определяли действие слизи на вторичный гемостаз по следующей методике: к бедной тромбоцитами плазме в объеме 0,1 мл, предварительно инкубированной в течение 60-ти секунд, добавляли в равном объеме слизь кожи рыб. В качестве сравнения использовали время свертывания БТП с тромбином.
Для оценки агрегационной активности слизи кожи рыб кровь овцы забирали из яремной вены в пробирки с цитратом натрия 3,8 % в соотношении 9:1, центрифугировали 10 мин при 1500 об./мин для получения обогащенной тромбоцитами плазмы (ОТП). Часть плазмы отбирали, а оставшуюся центрифугировали при 3000 об./мин в течение 20-ти мин, получая бедную тромбоцитами плазму. Для оценки агонистической способности слизи кожи рыб применяли количественный метод, основанный на регистрации изменений светопропускания богатой тромбоцитами плазмы с применением ФЭК по Howard M.A.
Определяли суммирующий индекс агрегации тромбоцитов (СИАТ), скорость агрегации (СА), индекс агрегации тромбоцитов (ИАТ) и индекс дезагрегации тромбоцитов (ИДТ) овец со слизью рыб (опытная группа) и индуктором агрегации - АДФ в концентрации 0,1 мг/мл (контрольная группа).
Полученные в ходе исследования результаты обрабатывали с помощью программного пакета Statistica 6.1. и с помощью программного пакета Microsoft Excel. Значения полученных в работе результатов представлены в виде средней величины и стандартной ошибки средней (M±m). Сравнение данных проводилось с применением U-критерия Манна-Уитни для независимых групп. Значение P приняли равным 0,05.
Результаты и обсуждение
Вследствие того, что рыбы обитают в водной среде, у них в процессе эволюции выработалось множество защитных механизмов. Внутренние, внешние и общие пути свертывающей системы крови костных рыб впервые были продемонстрированы в работах иностранных авторов [9]. Исследования, проведенные на костистых рыбах, указывают на то, что процесс коагуляции является принципиально схожим с таким же процессом у других позвоночных, в частности у млекопитающих [6, 8].
По современным представлениям, в остановке кровотечения участвуют 2 механизма: сосу-дисто-тромбоцитарный (первичный) гемостаз и плазменно-коагуляционный (вторичный) гемостаз. Однако было выявлено, что вторичный гемостаз у рыб все-таки менее активен - такие показатели, как тромбиновое и протромбиновое время, у рыб в (5-10) раз продолжительнее, чем у млекопитающих [1, 8], но, в тоже время, скорость свертывания крови рыб намного выше, чем у млекопитающих. Это можно объяснить тем, что физиологическую роль вторичного гемостаза у рыб может брать на себя выделяемая ими кожная слизь.
Основываясь на результатах исследований Б.А. Кудряшова, Г.В. Андреенко,
m J_J.
3
Рис. 1. Оценка влияния слизи кожи рыб на цельную кровь овец: 1 - внесение слизи в 0,05 мл крови овцы, 2 - оценка скорости образования сгустка - покачивание стекол каждые 30 сек, 3 - свернувшаяся под воздействием слизи кровь овцы.
Таблица 1
Сравнение времени свертывания нативной крови овцы и под воздействием
слизи кожи карпов (Cyprinus carpió)
Показатели Нативная кровь (n=9) Нативная кровь+слизь кожи карпов (n=9)
Время образования сгустка, мин 8,39 ±0,15 3,36 ±0,03*
Примечание: «*» - различия с нативной кровью достоверны (р<0,05).
П.Д. Улитиной, показывающих, что у рыб найдены основные тромбогенные белковые компоненты, а также что слизь кожи рыб является богатым источником протромбо-киназы, нами были проведены исследования по влиянию слизи кожи карпов на цельную кровь (рис. 1), плазменный гемостаз и тромбоциты овец.
Анализируя результаты проведенного исследования, можно отметить, что цельная кровь под воздействием слизи кожи рыб сворачивается быстрее (табл. 1).
Таким образом, можно заключить, что слизь кожи рыб обладает гемостатическими свойствами. Для установления механизма гемостаза (первичный или вторичный) нами было изучено влияние слизи на бедную тромбоцитами плазму овец (вторичный гемостаз) и обогащенную тромбоцитами плазму овец (первичный гемостаз).
При изучении действия слизи на плаз-менно-коагуляционное звено гемостаза овец были получены результаты, представленные в таблице 2. В качестве сравнения использовали время свертывания БТП с тромбином.
Анализируя данные таблицы, нужно отметить отсутствие достоверной активации плазменных факторов свертывания крови овец под воздействием слизи (в некоторых случаях плазма не сворачивалась). Таким образом, мы не можем утверждать, что слизь действует на вторичный гемостаз.
Для оценки влияния слизи кожи рыб на первичный гемостаз определяли агрега-ционную активность тромбоцитов овец под
воздействием слизи (опытная группа) в сравнении с действием индуктора агрегации АДФ (контрольная группа). АДФ является активатором тромбоцитов. При добавлении его в плазму, богатую тромбоцитами, формируются агрегаты, повышается прозрачность плазмы, и, следовательно, увеличивается поток проходящего через кювету света. Результаты определения индуцированной агрегации тромбоцитов у овец контрольной и опытной групп приведены в таблице 3.
Анализируя получившиеся результаты, можно сказать, что при использовании слизи кожи рыб как агониста тромбоцитов получили достоверно более высокий индекс и скорость агрегации, чем при использовании АДФ - сильнейшего индуктора агрегации тромбоцитов млекопитающих. Одновременно с этим, образующиеся агрегаты по устойчивости равны индуктору АДФ, на что указывает отсутствие достоверных различий между индексами дезагрегации.
Таким образом, можно заключить, что слизь кожи рыб оказывает гемостатическое действие за счет активации тромбоцитов овец, то есть воздействует на первичный гемостаз.
Отличия плазменно-коагуляционного гемостаза рыб от млекопитающих могут объясняться тем, что физиологическую роль вторичного гемостаза у рыб может брать на себя выделяемая ими кожная слизь, в которой содержится очень большое количество фактора свертывания тканевого тром-бопластина, тем самым выполняя роль гемостатика [6].
Таблица 2
Показатели БТП+тромбин, (n=8) БТП+слизь кожи карпов, (n=8)
Время образования сгустка, мин 21±0,20 12±8,50
Время свертывания бедной тромбоцитами плазмы (БТП) крови овец под влиянием активаторов (сек)
Таблица 3
Сравнение агрегационной активности слизи кожи рыб и АДФ
Показатели Единицы измерения Контрольная группа (n=10) Опытная группа (n=10)
СИАТ % 21,98 ±2,71 36,17 ±1,52*
СА мин 0,12 ± 0,02 0,01±0,004*
ИАТ % 19,2±2,36 102,92±10,28*
ИДТ % 9,13 ± 1,22 9,09 ±0,41
Примечание: «*» - различия достоверны (р<0,05).
Анализируя результаты исследования ге-мостатической активности слизи кожи карпов, мы установили, что цельная кровь под ее воздействием сворачивается быстрее. Таким образом, можно заключить, что слизь кожи рыб обладает гемостатическими свойствами.
Мы не можем утверждать, что слизь действует на вторичный гемостаз, так как по результатам исследования можно отметить отсутствие достоверной активации плазменных факторов свертывания овец под действием слизи кожи рыб.
Заключение
Анализируя получившиеся результаты, можно констатировать, что при использовании слизи кожи рыб как агониста тромбоцитов получили достоверно более высокий индекс и скорость агрегации, чем при использовании АДФ - сильнейшего агониста тромбоцитов млекопитающих. Одновременно с этим образующиеся агрегаты обладают той же устойчивостью, что и образующиеся под действием АДФ, что указывает на оптимальную структуру сгустка.
Подводя итог, может показаться весьма практичным решение о создании биологического ге-мостатика на основе слизи кожи рыб, тогда как проблема кровотечений в хирургии и медицине очень актуальна, а спрос на подобные препараты высок. Слизь кожи рыб является дешевым возобновляемым ресурсом и богатым источником белковых компонентов - протромбокиназы и тромбокиназы (протромбина и тромбина), обладает значительной гемостатической активностью как для рыб, так и для млекопитающих. Разработанный на ее основе препарат будет активировать тромбоциты и способствовать ускорению свертывания крови млекопитающих при кровотечениях различного генеза.
Исследование выполнено при финансовой поддержке РФФИ и Правительства Вологодской области в рамках научного проекта № 18-44-350002.
Список литературы
1. Березина Д.И., Вайцель А.Э., Фомина Л.Л Сравнительно-физиологические аспекты системы гемостаза рыб // Сб. тр. Всеросс. науч. конф. «Эволюционные и экологические аспекты изучения живой материи». Череповецкий государственный университет. Череповец, 2017. С. 38433.
2. Биологический клей "BioGlue®". Режим доступа [URL]: http://www.mst.ru/products/biomaterials/ bioglue.
3. В России разработано новое гемостатическое средство // Военно-промышленный курьер. Режим доступа [URL]: http://vpk-news.ru/news/25817.
4. Кожный клей «Дермабонд» (Dermabond) // Ле-гаси МЕД шовный материал и медицинское оборудование. Режим доступа [URL]: http://www.legmed.ru/ catalogue/?section=374.
5. Ксенофонтов А.М. Никифоров П.В., Федоров А.П. Экспериментальный метод применения биологического клея на основе плавательного пузыря осетра при операциях на печени // Здоровье и образование в XXI веке. 2012. T. 14. № 1. С. 223-224
6. Кудряшов Б.А., Андреенко Г.В., Улитина П.Д. Тромботропин и протромбокиназа морских рыб // «Докл. высш. школы», биол. науки. 1958. № 3.
7. MeTro - клей, заживляющий раны // Hi-Tech News НОВОСТИ ВЫСОКИХ ТЕХНОЛОГИЙ. Режим доступа [URL]: https://hi-news.ru/technology/metro-unikalnyj-klej-zazhivlyayushhij-rany.html.
8. Фомина Л.Л., Кулакова Т.С., Березина Д.И. Определение активности плазменно-коагуляционного звена системы гемостаза рыб клоттинговыми методами с использованием коагулометра // Актуальные вопросы ветеринарной биологии. 2017. Т. 35. № 3. С. 54-58.
9. Doolittle R.F., Surgenor D.M. Blood coagulation in fish // American Journal of Physiology. 1962. № 203 (5). P. 964-970.
10. Rothwell S.W. The long term immunological response of swine after two exposures to a salmon thrombin and fibrinogen hemostatic bandage / S. W. Rothwell, T. Settle, S. Wallace [et al.] // Biologicals. Nov. 2010. V. 38. I. 6. P. 619-628.
