CC BY
36
2009
Известия ТИНРО
Том 157
УДК 595.384.2:639.3
Н.П. Ковачева1, С.В. Холодкевич2 , Р.М. Васильев1, И.А. Загорский1, А.В. Иванов2, Е.Л. Корниенко2*
1 Всероссийский научно-исследовательский институт рыбного хозяйства и океанографии, 107140, г. Москва, ул. Верхняя Красносельская, 17;
2 Санкт-Петербургский научно-исследовательский центр экологической безопасности РАН, 197110, г. Санкт-Петербург, ул. Корпусная, 18
ОЦЕНКА ФУНКЦИОНАЛЬНОГО СОСТОЯНИЯ КАМЧАТСКОГО КРАБА В УСЛОВИЯХ МАРИКУЛЬТУРЫ МЕТОДОМ НЕИНВАЗИВНОГО КОНТРОЛЯ ЕГО КАРДИОАКТИВНОСТИ В РЕАЛЬНОМ ВРЕМЕНИ
Впервые исследованы динамика изменения характеристик кардиоактивнос-ти (частоты сердечных сокращений и стресс-индекса) промысловых самцов камчатского краба Paralithodes camtschaticus в фоне и при различных стрессорных воздействиях, часто встречающихся в условиях аквакультуры (хэндлинг, транспортировка, кормление, изменение температуры воды). Кардиоактивность животных измерялась и анализировалась в реальном времени неинвазивно с помощью разработанных в НИЦЭБ РАН волоконно-оптического метода лазерной фотоплетизмографии и адаптированного для беспозвоночных метода вариационной пуль-сометрии. Показано, что метод позволяет без стрессирования животных осуществлять в реальном времени мониторинг функционального состояния камчатского краба в условиях естественного обитания, его транспортировки, содержания и воспроизводства в искусственных условиях аквакультуры.
Ключевые слова: камчатский краб, марикультура, функциональное состояние, кардиоактивность.
Kovacheva N.P., Kholodkevich S.V., Vasilyev R.M., Zagorsky I.A., Ivanov A.V., Kornienko E.L. Red king crab functional state assessment by non-invasive real-time control of their cardiac activity in aquaculture // Izv. TINRO. — 2009. — Vol. 157. — P. 197-205.
The dynamics of cardiac activity characteristics (heart rate and stress-index) in commercial size males of the red king crab Paralithodes camtschaticus is studied under different stressors which are frequently encountered in aquaculture (handling, transportation, feeding, water temperature changes). The cardiac activity of the animals was measured and analyzed by the fiber-optic photoplethysmography method developed in SRCES RAS and pulsometry variation method adapted to
* Ковачева Николина Пешкова, доктор биологических наук, заведующая лабораторий, e-mail: nikolinak@mail.ru; Холодкевич Сергей Викторович, доктор технических наук, заведующий лабораторией, е-mail: Kholodkevich@mail.ru; Васильев Роман Михайлович, научный сотрудник, e-mail: vasilevrm@mail.ru; Загорский Иван Александрович, научный сотрудник, e-mail: zagorsky_eg@mail.ru; Иванов Алексей Валентинович, кандидат физико-математических наук, старший научный сотрудник, е-mail: ivanovalexei@yahoo.com; Корниенко Евгений Леонидович, научный сотрудник, е-mail: kornienko_el@mail.ru.
invertebrates. The methods allow to perform without stress a real-time monitoring of the red king crab functional state under natural conditions, during transportation and under artificial conditions of maintenance and cultivation in aquaculture.
Key words: red king crab, aquaculture, functional state, cardiac activity.
Введение
В настоящее время культивирование ракообразных — перспективное направление марикультуры в России. Одним из ценнейших видов промысловых ракообразных является камчатский краб. Наряду со стабильно высоким уровнем потребления варено-мороженой продукции интенсивно растет спрос на живого краба. В ряде мегаполисов появились предприятия по передержке холодновод-ных гидробионтов с применением установок замкнутого цикла водоснабжения, что свидетельствует об актуальности содержания и культивирования вида (Ко-вачева, 2008). Успешность культивирования напрямую зависит от эффективности контроля функционального состояния гидробионтов как основы оптимизации технологии. Одним из возможных методов такого контроля является анализ физиологических изменений в реальном времени (Холодкевич, 2007; Kholodkevich et al., 2007, 2008; Пат. РФ № 2308720), поскольку именно физиологические показатели наиболее лабильные и информативные в условиях синергического действия внешних факторов.
В настоящей работе с помощью разработанного в Санкт-Петербургском научно-исследовательском центре экологической безопасности РАН (Холодкевич, 2007; Kholodkevich et al., 2007, 2008; Пат. РФ № 2308720) волоконно-оптического метода лазерной фотоплетизмографии и адаптированного для беспозвоночных метода вариационной пульсометрии исследованы динамика изменения частоты сердечных сокращений (ЧСС) и стресс-индекса самцов камчатского краба Paralithodes camtschaticus при различных стрессорных воздействиях. Данное исследование продолжает работу Н.П. Ковачевой с соавторами (2008), в которой впервые сообщалось о неинвазивной регистрации кардиоактивности камчатского краба.
Использованный метод лазерной фотоплетизмографии позволил нам неин-вазивно регистрировать активность сердца крабов в лабораторных условиях при минимальном воздействии на особь (Ковачева, 2008; Ковачева и др., 2008). Метод прошел апробацию на речных раках, морских и пресноводных моллюсках при решении экологических и экотоксикологических задач, связанных с мониторингом качества природных и очищенных сточных вод (Холодкевич, 2007; Kholodkevich et al., 2007, 2008).
Целью работы являлось выяснение адаптивных возможностей камчатского краба в условиях установки замкнутого цикла водоснабжения к стресс-факторам, часто встречающимся в условиях аквакультуры, и степени их воздействия на его кардиоактивность.
Материалы и методы
Исследована кардиоактивность 10 взрослых самцов (ширина карапакса > 15 см) камчатского краба, доставленных в течение 12 ч из Баренцева моря. Эксперименты проводили в лаборатории воспроизводства ракообразных ВНИРО в изотермических емкостях с непрозрачной крышкой (с целью снижения внешних стрессорных воздействий) объемом 200 и 500 л в искусственной морской воде при температуре от 5 до 12 оС и солености 32 %о. Крабов содержали в индивидуальных емкостях.
В соответствии с методикой С.В. Холодкевича с соавторами (Холодкевич, 2007; Пат. РФ № 2308720) для регистрации сердечной активности на панцирь в области проекции сердца приклеивали миниатюрное пластиковое "седло", в нем закрепляли оптоволоконный датчик, сигнал с которого усиливался лазерным фото-
плетизмографом, а затем через аналого-цифровой преобразователь поступал на компьютер, где обрабатывался с помощью разработанного в НИЦЭБ РАН программного обеспечения. На рис. 1 приведена схема экспериментальной установки.
о - оптоволоконный датчик О - температурный датчик
Рис. 1. Схема экспериментальной установки
Fig. 1. Scheme of experimental setup
Суть метода лазерной фотоплетизмографии заключается в следующем. На пульсирующую сердечную мышцу животного направляется световой пучок низкой интенсивности. Частично отраженный свет, модулированный по амплитуде колебаниями тканей сердца, с помощью фотоприемника преобразуется в пропорциональный световому потоку электрический сигнал, который после усиления и оцифровки анализируется вычислительным устройством. Таким образом, этот метод позволяет вести неинвазивную запись сердечной активности.
По выборке из 100 кардиоинтервалов вычислялись основные показатели адаптированного метода вариационной пульсометрии: среднее значение кардио-интервала, ЧСС, среднее квадратичное отклонение и стресс-индекс, который равен обратной величине удвоенного произведения ЧСС и дисперсии и является аналогом индекса напряженности, используемого в методе вариационной пульсомет-рии и отражающего степень напряженности регуляторных систем людей.
Непрерывную регистрацию in vivo ЧСС и стресс-индекса осуществляли до, в процессе и после кормления, хэндлинга, транспортировки, механического воздействия.
При исследовании зависимости ЧСС от температуры начальная температура была 5 оС, к середине эксперимента ее ступенчато поднимали до 12 оС и вновь снижали до 5 оС. Продолжительность одного этапа эксперимента составляла 5 сут. Исследовано 2 краба.
При имитации транспортировки крабов помещали в изотермическую емкость без воды на 24 ч (1 краб) и 47 ч (2 краба). В начале эксперимента температура была 8 оС, в конце 12 оС. Для поддержания влажности тела крабов накрывали смоченным в морской воде материалом.
Результаты и их обсуждение
Зависимость кардиоактивности от температуры воды
В первые сутки после реальной транспортировки из Баренцева моря среднесуточная ЧСС у обоих крабов находилась на высоком уровне — 60 уд/мин (рис. 2). В течение двух недель этот показатель снижался до 30-35 уд/мин. Начиная
199
с 4-й недели понижение ЧСС остановилось, среднесуточный показатель ЧСС составил 18-25 уд/мин.
о -i-i-i-i-i-i-
О 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30 32 34
Время, сут
Рис. 2. Динамика ЧСС камчатского краба в установке замкнутого цикла водоснабжения после транспортировки из Баренцева моря
Fig. 2. Dynamics of the red king crab heart rate frequency kept in the closed recycling water system from the Barents Sea
Таким образом, на адаптацию крабов (контролируемую по нормализации их кардиоактивности) после транспортировки в течение 12 ч и посадки в искусственную морскую воду ушло три недели.
При температуре 5 оС ЧСС первого краба составляла 18-20, второго — 2325 уд/мин. Стресс-индекс обоих крабов составлял менее 30 усл. ед. (рис. 3). В результате повышения температуры воды до 8 оС ЧСС обоих крабов возрасла до 34-36 уд/мин. Дальнейший подъем температуры сопровождался ростом ЧСС. Максимальное значение ЧСС у обоих крабов — 45 уд/мин, отмечено при максимальной температуре 12 оС (рис. 3). Стресс-индекс при этом не претерпевал существенных изменений (рис. 4), что указывает на то, что плавные изменения температуры в несколько градусов не приводят к стрессированию животных.
0 2 4 6 8 10 12 14 16 18 20 22 24 26 28 30
Время, сут
Рис. 3. Зависимость ЧСС камчатского краба от температуры воды
Fig. 3. Dependence of the red king crab heart rate frequency on water temperature
Динамика кардиоактивности при стрессорных воздействиях
При кормлении. При захвате крабом корма отмечено увеличение ЧСС с 25 до 40 уд/мин и стресс-индекса с 10 до 650 усл. ед. Показатели оставались повышенными в течение 1 ч от начала кормления (рис. 5).
200
15
Время, сут
Рис. 4. Зависимость стресс-индекса камчатского краба от температуры воды Fig. 4. Dependence of the red king crab stress index on water temperature
50 60 70 Время, мин
Рис. 5. Динамика ЧСС и стресс-индекса камчатского краба в процессе кормления
Fig. 5. Dynamics of the red king crab heart rate frequency and stress index in the process of feeding
При механическом воздействии на краба (чистка бассейна) отмечен скачок ЧСС с 30 до 40 уд/мин и стресс-индекса с 0-200 до 1200 усл. ед. (рис. 6). По окончании воздействия ЧСС и стресс-индекс оставались несколько часов на повышенном уровне.
При модельной транспортировке. До начала первого эксперимента (имитация транспортировки в течение 24 ч) ЧСС краба составляла 30 уд/мин, стресс-индекс колебался от 10 до 600 усл. ед. (рис. 7). В результате переноса и посадки краба в транспортировочный контейнер ЧСС увеличилась до 40 уд/мин. В течение следующих 3 ч отмечено снижение ЧСС до 20-25 уд/мин и стресс-индекса до 0-10 усл. ед. (рис. 7). На протяжении следующих 20 ч происходило плавное снижение ЧСС до 15 уд/мин. После перемещения краба из контейнера в воду, спустя 24 ч имитации транспортировки, на протяжении почти 30 мин не отмечалось никаких изменений ЧСС и стресс-индекса, после чего ЧСС увеличилась до 40 уд/мин, а стресс-индекс до 3500 усл. ед. В течение следующих суток ЧСС составляла 43-47 уд/мин, стресс-индекс изменялся в диапазоне от 200 до 2000 усл. ед. (рис. 7).
В первые 6 ч после начала второго эксперимента (транспортировка в течение 47 ч) ЧСС краба снизилась с 40 до 30-35 уд/мин (рис. 8). На протяжении следующих 10-11 ч ЧСС оставалась на уровне 27-32 уд/мин. Через 28 ч ЧСС крабов составляла 20 и 25 уд/мин. Через 35 ч у первого краба отмечено сни-
201
I
s
S
<J и
20 25
Время, мин
Рис. 6. Динамика ЧСС и стресс-индекса камчатского краба при механическом воздействии
Fig. 6. Dynamics of the red king crab heart rate frequency and stress index under mechanical effect
a>
£P
500 U
24 30
Время, ч
Рис. 7. Кардиоактивность камчатского краба в процессе транспортировки в течение 24 ч
Fig. 7. Cardiac activity of red king crab during 24 hours transportation
i s
S
<J и
Время, ч
Рис. 8. Динамика ЧСС крабов при длительной транспортировке без воды Fig. 8. Dynamics of the red king crab heart rate frequency during long transportation without water
жение ЧСС с 26 до 10 уд/мин. В следующие 10 ч ЧСС колебалась от 9 до 13 уд/мин. Через 45 ч после начала эксперимента первый краб погиб. У второго краба через 42 ч ЧСС снизилась с 23 до 6 уд/мин, через 47 ч он погиб. При этом температура воздуха внутри транспортировочной емкости постепенно увеличивалась с 8 до 14 оС. Таким образом, максимальная продолжительность выживания при имитации транспортировки составила 47 ч.
В начале эксперимента стресс-индекс первого краба возрос с 300 до 700 усл. ед. (рис. 9). После этого регистрировали плавное снижение до 50-200, позднее до 0-10 усл. ед. У второго краба стресс-индекс в первые часы составил 100 усл. ед. и в течение 36 ч эксперимента плавно снижался.
ч
о
а>
¿Г
Рис. 9. Динамика стресс-индекса крабов при длительной транспортировке без воды Fig. 9. Dynamics of the red king crab stress-index during long term transportation without water
В сумарном виде экспериментальные данные по регистрации ЧСС и стресс-индекса камчатского краба представлены в таблице.
Значения ЧСС и стресс-индекса камчатского краба в экспериментах Values of heartbeat frequency and stress index in the experiments with red king crab
Действие ЧСС, уд/мин Стресс-индекс, усл. ед.
В покое при температуре воды 5 оС 18-25 1-50
Изменение температуры
8 оС 25-35 50-220
12 оС 35-45 150-600
Адаптация после транспортировки
Первая неделя 45-60
Вторая неделя 30-45
Третья неделя 25-45
Четвертая неделя 18-25
Чистка бассейна 40 До 1200
Прием пищи 40 650
Транспортировка 24 ч
До транспортировки 27-30 10-500
В конце транспортировки 17 1
Через 30 мин после посадки в воду 40 До 3500
До настоящего времени активность сердца с помощью фотоплетизмографии неинвазивно определяли только у крабов Carcinus тавпаБ (береговой краб) и Gaвticв dвprвssus. При этом значения ЧСС крабов варьировали от 30 до 90 уд/мин при температуре воды 16 оС и от 75 до 189 уд/мин при температуре
воды 27 0С (Depledge, 1984; Aagaard et al., 1991, 2000). В этих исследованиях крабов подвергали механическому воздействию, обусловленному спецификой отведения сигнала, что могло влиять на характер их сердечной деятельности. Кроме того, повышенная по сравнению с нашими данными ЧСС может быть следствием таксономической особенности данного вида крабов.Отмеченная в нашей работе зависимость ЧСС крабов от температуры воды и ее абсолютные значения близки к полученным для американского омара Homarus americanas (Worden, Clark, 2006). При температуре воды 2 оС ЧСС омаров составляла 20 уд/мин, при 10 оС — уже 40-45, а при 12 оС — около 50 уд/мин.
В то же время имеется несоответствие наших результатов данным, полученными для камчатского краба Г.Г. Матишовым с соавторами (2008), согласно которым ЧСС крабов при температуре воды 5-6 оС составляла 76,0 ± 1,34 уд/мин, а при 12 оС — свыше 100 уд/мин. Причиной столь высокого уровня ЧСС, по всей видимости, является то, что животные находились в стрессорном состоянии, обусловленном инвазивностью использованного метода.
Снижение ЧСС ракообразных во время нахождения на воздухе связано, вероятно, с замедлением процессов их метаболизма. Кроме камчатского краба такое замедление наблюдалось ранее у другого вида Decapoda — широкопалого рака Astacus astacus L. (Федотов и др., 2002) — при исследованиях, проведенных тем же методом, что и в настоящей работе.
Нами отмечен рост ЧСС в процессе приема пищи крабами в среднем на 1015 уд/мин, что соответствует данным, полученным на дандженесском крабе Cancer magister (McGaw, 2005), ЧСС которого возрастала с 74 до 84 уд/мин и оставалась на этом уровне на протяжении 5-6 ч после кормления. Через 10 ч ЧСС приходила в норму.
Заключение
Неинвазивность примененного нами метода позволяет в реальном времени без травмирования и стрессирования животных осуществлять длительные непрерывные наблюдения за изменениями физиологического состояния камчатского краба как при его культивировании, так и в природных условиях. Метод может быть использован для неинвазивного мониторинга функционального состояния камчатского краба в условиях естественного обитания, совершенствования технологии его транспортировки, содержания и воспроизводства в условиях аквакультуры.
Зарегистрированные существенные изменения функционального состояния краба в ответ на стрессорные воздействия должны учитываться при оптимизации биотехники его культивирования и разработке стратегии сохранения и восстановления природных запасов камчатского краба методами марикультуры.
Фоновые значения исследованных нами показателей по мере накопления данных позволят исследовать фундаментальные основы закономерностей сердечной ритмики ракообразных в зависимости от условий обитания и, возможно, таксономического положения.
Список литературы
Ковачева Н.П. Аквакультура ракообразных отряда Decapoda: камчатский краб Paralithodes camtschaticus и гигантская пресноводная креветка Macrobrachium rosenbergii : монография. — М. : ВНИРО, 2008. — 239 с.
Ковачева Н.П., Холодкевич С.В., Васильев Р.М. и др. Оценка функционального состояния камчатского краба в режиме реального времени по его кардиоактивнос-ти // Вопр. рыб-ва. — 2008. — Т. 9, № 2(34). — С. 513-517.
Матишов Г.Г., Зензеров В.С., Емелина А.В., Муравейко В.М. Устойчивость камчатского краба Paralithodes camtschaticus Баренцева моря к температурному фактору // ДАН. — 2008. — Т. 420, № 4. — С. 571-573.
Пат. № 2308720 РФ. Способ биологического мониторинга окружающей среды (варианты) и система для его осуществления / С.В. Холодкевич, А.В. Иванов, Е.Л. Корниенко, А.С. Куракин. Бюл. изобр. — 2007. — № 29.
Федотов В.П., Холодкевич С.В., Строчило А.Г. Активность сердца раков Astacus astacus в период раннего онтогенеза // Журн. эволюц. биохим. и физиол. — 2002. — Т. 38, № 4. — С. 335-340.
Холодкевич С.В. Биоэлектронный мониторинг уровня токсичности природных и сточных вод в реальном времени // Эколог. химия. — 2007. — Вып. 16(4). — С. 223-232.
Aagaard A., Andersen B.B., Depledge M.H. Simultaneous monitoring of physiological and behavioural activity in marine organisms using Non-invasive, computer-aided techniques (Carcinus maenas ) // Mar. Ecol. Prog. Ser. — 1991. — Vol. 73. — Р. 277-282.
Aagaard A., Styrishave B., Warman C.G., Depledge M.H. The use of cardiac monitoring in the assessment of mercury toxicity in the subtropical pebble crab (Gaetice depressus) // Sci. Mar. — 2000. — Vol. 64(4). — Р. 381-386.
Depledge M.H. Photoplethysmography — a non-invasive technique for monitoring heart beat and ventilation rate in Decapod Crustaceans // Comp. Biochem Physiol. — 1984. — Vol. 77A. — P. 369-371.
Kholodkevich S.V., Fedotov V.P., Kuznetsova T.V. et al. Fiber-optic remote biosensor systems for permanent biological monitoring of the surface waters quality and bottom sediments in the real time. http://www/ices.dk/products/CMdocs/CM-2007/l/ I-2007.pdf.
Kholodkevich S.V., Ivanov A.V., Kurakin A.S. et al. Real time biomonitoring of surface water toxicity level at water supply stations // J. of Environmental Bioindicators. — 2008. — Vol. 3, № 1. — P. 23-34.
McGaw I.J. Does feeding limit cardiovascular modulation in the Dungeness crab Cancer magister during hypoxia? // J. of Exp. Biol. — 2005. — Vol. 208. — P. 83-91.
Worden M.K., Clark C.M., Conaway M., Qadri S.A. Temperature dependence of cardiac performance in the lobster Homarus americanus // J. of Exp. Biol. — 2006. — Vol. 209. — P. 1024-1034.
Поступила в редакцию 11.02.09 г.
