CC BY
29667.613.75:620.193.82:582.284:582.282.123.2
ОЦЕНКА ФУНГИЦИДНОЙ АКТИВНОСТИ ШТАММОВ БАЗИДИОМИЦЕТОВ В ОТНОШЕНИИ ИНДУКТОРОВ ПЛЕСНЕВЕНИЯ ПИЩЕВЫХ ПРОДУКТОВ ГРИБАМИ ИЗ РОДА PENICILLIUM LINK
Тромовых т.и. (профессор)*, 2Кузнецова л.с. (генеральный директор), 1жилинская н.В. (аспирант), 1лушина К.В. (студент)
1 Московский государственный университет пищевых производств, 2ООО «Микобор», г. Москва, Россия
© Коллектив авторов, 2014
В статье рассмотрены фунгицидные свойства ксилотроф-ных базидиомицетов Trametes versicolor (L.) Lloyd, Fomitopsis officinalis (Vill.) Bondartsev & Singer и Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst для оценки возможности создания противоплесневых препаратов. В результате исследований установлено, что спиртовые и водные экстракты мицелия всех изученных штаммов оказывают антибиотическое действие на рост тест-штаммов рода Penicillium Link., вызывающих плесневение пищевых продуктов. Выявлен наиболее устойчивый штамм Penicilium chrysogenum ВКМ F-4499 к действию экстрактов базидиомицетов. Показано, что все исследуемые штаммы базидиомицеты проявляют гиперингибирующее действие в отношении микромицетов рода Penicillium, что можно объяснить наличием хитиназной активности.
Ключевые слова: гиперингибирующая активность, противо-плесневые препараты, Piptoporus betulinus, Trametes versicolor, Fomitopsis officinalis, фунгицидная активность, хитиназная активность
ESTIMATION OF FUNGICIDAL ACTIVITY OF BASIDIOMYCETES STRAINS AGAINST MOULD PENICILLIUM SPECIES LINK IN FOOD
1Gromovykh T.I. (professor), 2Kuznetsova L.s. (general director), 1Zhilinskaya N.v. (postgraduate student), ^ushina K.v. (student)
Контактное лицо: Громовых Татьяна Ильинична, тел. (499) 750-01-11.
1Moscow state University of Food Production, 2«Micobor», Moscow, Russia
© Collective of authors, 2014
Authors considers the fungicidal properties of xylotrophe basid-iomycetes Trametes versicolor (L.) Lloyd, Fomitopsis officinalis (Vill.) Bondartsev & Singer and Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst to esti-nate the possibility of struggle with mold. We have shown that alcohol and aqueous extracts of the all tested strains mycelium have inhibited the growth of the Penicillium species test-strains, that cause of the food mould. Penicilium chrysogenum VKM F-4499 strain was the most resistant to action of basidiomycetes extracts. All the studied strains of basidiomycetes manifested the hyperinhibiting action in respect of mi-cromycetes of the Penicillium genus that can be explained by the presence of chitinase activity.
Key words: antimould substance, chitinase activity, Fomitopsis officinalis, fungicidal activity, hyperinhibiting activity, Piptoporus betulinus, Trametes versicolor
В современных условиях развития общества повышенное внимание уделяют обеспечению качества и безопасности продуктов питания, которые должны соответствовать требованиям, регламентированным в законодательных актах специальной комиссией Кодекс Алиментариус (Codex Alimentarius, 2013 - www.codexalimentarius.org/codex-home/ru/). За рубежом одной из систем, обеспечивающих гарантированную безопасность производства продукции на всех этапах технологического процесса, является система НАССР (Hazard Analysis and Critical Control Point), направленная, прежде всего, на предотвращение риска, связанного с производством и хранением пищевых продуктов. Особую опасность представляют грибы рода Penicillium Link, синтезирующие ми-котоксины.
В настоящее время отсутствуют надежные способы обезвреживания кормов от микотоксинов, поскольку эти вещества чрезвычайно устойчивы к действию высоких температур. Меры воздействия на токсины грибов (химические, физические, механические), как правило, не эффективны и отрицательно влияют на органолептические показатели и питательную ценность готовой пищи. Поэтому основными способами защиты продуктов питания, сырья и кормов от накопления в них микотоксинов являются, с одной стороны, предотвращение контаминации их токсинообразующими микроорганизмами, а с другой - использование специальных фунгицидных средств, способных предотвращать развитие мице-лиальных грибов на поверхности кормов и пищевых продуктов [1].
Ныне для предотвращения плесневения пищевой продукции с успехом используют антисептики, химические консерванты, фитонциды, органические кислоты, а также композиции химических веществ. Одним из главных направлений защиты поверхности продуктов питания от поражения плесневыми грибами является использование биоконсервантов, особый интерес среди которых вызывает биопотенциал доброкачественных грибов или доброкачественной плесени [1-3].
Доброкачественную плесень уже применяют в производстве копченых и сыровяленых колбас в Румынии, Венгрии, Италии, Испании [2]. Используемые грибы при созревании не только придают особый внешний вид колбасе - налет плотной белой или серой плесени на оболочке, но и регулируют выделение влаги в процессе сушки колбас. С применением доброкачественной плесени, в определенной степени, компенсируют колебания влажности воздуха в камере созревания, что способствует образованию специфического аромата колбасы [2, 3].
При производстве венгерской салями на поверхности колбас выращивают слой плесени с преобладанием рода Sporichthya вида asimetricae. Эта плесень способствует быстрому высыханию колбасы и обеспечивает равномерный ход сушки при большом диаметре батонов [3].
В Федеральном научно-исследовательском центре мясной промышленности (г. Кульмбах, ФРГ) был выделен штамм Penicillium malgiovensies, названный «благородной плесенью Кульмбах» (Edelschimmell Kulmbach), который используют для созревания копченых колбас [2].
Из результатов исследований последних десятилетий стало известно, что базидиальные грибы являются продуцентами целого ряда биологически активных веществ и могут стать незаменимыми источниками для получения веществ с разнообразными биологическими свойствами, в том числе - фунгицид-ными [4-6]. Большой потенциал для использования в пищевой промышленности имеют виды Trametes versicolor (L.) Lloyd, Fomitopsis officinalis (Vill.) Bond-artsev & Singer и Piptoporus betulinus (Bull.) P. Karst., благодаря установленному их антимикробному действию [7-9]. Однако до настоящего времени, к сожалению, фунгицидные свойства представителей этих видов не исследовали.
Учитывая современные научные тенденции, касающиеся сохранения качества и обеспечения микробиологической безопасности пищевой продукции с использованием консервантов природного происхождения, штаммы этих видов могут послужить основой для разработки и внедрения в производство новых поколений экологически безопасных комплексных пищевых добавок, предназначенных для длительной и надежной антимикробной защиты. Основными возбудителями порчи являются грибы рода Penicillium, среди которых доминируют P. commune, P. brevicompactum, P. chrysogenum и другие [1].
Цель работы - исследование фунгицидной активности штаммов базидиомицетов T. versicolor, F. officinalis и P. betulinus в отношении Penicillium spp. - причинных агентов плесневения для дальнейшей оценки возможности их использования в качестве противоплесневых добавок в технологиях пищевых продуктов и упаковочных материалов.
Для успешного выполнения поставленной задачи целесообразно изучение таких показателей, как антимикробная и хитиназная активности базидиоми-
цетов, что может служить объективным доказательством фунгицидных свойств выбранных штаммов базидиомицетных грибов [10].
объекты исследований
Объектами служили штаммы T. versicolor В 08/06 (ВКПМ F-1024), F. officinalis (ВКПМ F-961) [11] и P. betulinus (04, МГУПП), активные в отношении возбудителей плесневения.
В качестве тест-объектов использовали возбудителей плесневения колбас и сыров Penicillium spp., выделенные в научно-исследовательской лаборатории биозащиты сырья и продуктов питания Московского государственного университета пищевых производств [2]: P. brevicompactum (ВКМ F-4481) и P. nalgiovense (ВКМ F-4492), поражающие поверхности колбас, P. roqueforti (ВКМ F-4484) и P. commune (ВКМ F-4486), вызывающие поражение поверхности сыров, P. polonicum (ВКМ F-4497) и P. chrysogenum (ВКМ F-4499), выделенные из воздуха камер хранения готовых колбас.
методы исследований
Оценку антимикробной активности культу-ральных фильтратов и экстрактов мицелия штаммов базидиомицетов проводили методом «лунок».
Для получения экстрактов биомассу мицелия, выращенную в течение 14 суток на среде мальтакс-10, высушивали в термостате при 40-50 °С и измельчали на гомогенизаторе. Экстракты из биомассы мицелия получали путем смешивания дистиллированной воды или этанола и измельченной биомассы в соотношении 1:30 при 22 ±1 °С до постоянной массы. Полученные экстракты для освобождения от возможной бактериальной микробиоты дополнительно фильтровали через мембранный фильтр (0,5 мкм) и использовали в дальнейших исследованиях [11].
Оценка гиперингибирующей активности базидиомицетов.
Гиперингибирующие свойства используемых ба-зидиомицетов изучали в отношении тест-объектов рода Penicillum методом перпендикулярных штрихов на твердых агаризованных средах и методом встречных культур. Испытуемый штамм высевали штрихом (полоской) на поверхность агаровой пластинки в чашке Петри. После того, как мицелий штамма-базидиомицета разовьется, перпендикулярно его штриху подсевали тест-организм. Для оценки фунгицидной активности базидиомицетов методом встречных культур на одной половине чашки Петри делали одновременно посев культуры базидиомице-та, а на другой - Penicillum. Инкубирование культур проводили в термостате при 25±1 °С (Егоров Н.С., 2000).
Важным показателем гиперингибирующей активности, на наш взгляд, является сравнение ростовых показателей штамма базидиомицета в чистой культуре и при сокультивировании с Penicillum spp. Для
определения ростовых показателей на агаровой среде Maltax-10 в чашках Петри делали одновременно посев культуры базидиомицета в первом варианте (контроль) и совместно с пенициллом. Посевы инкубировали при 25±1 °С в течение всего срока роста штаммов на агаровой среде. Каждые сутки измеряли диаметр разрастания колоний и наблюдали за их культурально-морфологическими признаками (текстура и форма колоний, размер зоны нарастания). Измеряли суточную линейную скорость роста (СР) культуры и вычисляли среднюю скорость по формуле: СР = D-d/2t, где D - диаметр колонии, мм; d -диаметр инокуляционного блока, мм; t - время культивирования, сутки (Бухало А.С., 1988).
Изучение гиперингибирующей активности ба-зидиомицетов в отношении плесневых грибов рода Pénicillium на пленках упаковочных материалов.
Для исследований в качестве упаковочных материалов использовали колбасные оболочки - вискозную («Вискейз») и белковую («Белкозин»), которые обрабатывали спиртовым экстрактом мицелия T. versicolor и затем выкладывали на газоны с тестируемой культурой Pénicillium spp. Посевы инкубировали при комнатной температуре, отмечая зону задержки роста культуры плесневого гриба в течение заданного срока наблюдения (7 суток). В качестве контроля применяли соль поваренную пищевую (ГОСТ Р 51574-2000).
В другом варианте оценивали колонизацию вискозных оболочек для колбасных изделий штаммами базидиомицетов. Для этого первоначально пленку обрабатывали суспензией штамма Pénicillium spp. и помещали в чашку Петри на агаризированную среду Maltax-10; одновременно и поэтапно вносили иноку-лят штамма базидиомицета на оболочку на разных стадиях развития пеницилла (1, 2, 3, 5 и 7-е сутки роста).
Изучение хитиназной активности штаммов ба-зидиомицетов.
Хитиназную активность избранных базидио-мицетов определяли в культуральных фильтратах штаммов после окончания их выращивания в течение 10 суток. Биомассу мицелия и нерастворимые компоненты отделяли центрифугированием при 5000 об./мин в течение 30 минут. К 0,3 мл суспензии коллоидного хитина (10 мг/мл) добавляли 0,1 мл 0,5 М натрий ацетата уксусной кислоты (рН 5,5), аликво-ту анализируемого образца культурального фильтрата, воду до конечного объема 1,0 мл и инкубировали при 37 оС в течение 15 минут. Для определения хитиназной активности в полученных культуральных фильтратах использовали метод с 3,4-динитросали-циловой кислотой (ДНС), основанный на определении активности фермента по количеству образующихся в результате реакции редуцирующих сахаров с коллоидным хитином в качестве субстрата. Количество восстанавливающих сахаров устанавливали
по оптической плотности при длине волны 420 нм. Полученные значения переводили по калибровочной кривой. За единицу хитиназной активности принимали такое количество фермента, которое в описываемых условиях реакции вызывает прирост концентрации глюкозы на 1,0 мкмоль-мин-1.
результаты исследований
Выявили, что водные и спиртовые экстракты мицелия штаммов T. versicolor, P. betulinus и F. officinalis обладают фунгицидной активностью в отношении микромицетов рода Pénicillium. Отметим, что максимальной активностью обладают спиртовые экстракты мицелия штамма T. versicolor (Рис. 1).
Рис. 1. Показатели угнетения роста грибов рода Pénicillium при действии экстрактов мицелия T. versicolor (а), P. betulinus (б) и F. officinalis (в)
в
Обнаружили, что штамм P. chrysogenum F-4499 был устойчив к действию как водных, так и спиртовых экстрактов мицелия исследуемых базидиомицетов. Культуральные фильтраты всех штаммов базидиомицетов антимикробной активности не проявляли.
Для оценки гиперингибирующей активности T.
versicolor, P. betulinus и F. officinalis в отношении Penicillium изучали взаимоотношения штаммов методом перпендикулярных штрихов на Maltax-агаре. Принимая во внимание тот факт, что конкурентные грибы растут быстрее, в сравнении с базидиомицетами, последние культивировали в течение 3 суток, и затем посевы инокулировали спорами Penicillium spp.
Установили, что все исследуемые базидиомицеты проявляли активное гиперингибирующее действие и в течение 6-7 суток культивирования полностью подавляли рост и развитие Penicillium spp. При этом максимальным гиперингибирующим действием обладал штамм В 08/06 T. versicolor в отношении всех исследуемых тест-объектов, в том числе и устойчивого к действию водных и спиртовых экстрактов штамма P. chrysogenum F-4499 (Рис. 2).
а б
Рис. 3. Полное нарастание мицелия T. versicolor на «газон» микромицетов P nalgiovense F-4492 (а) и P.roqueforti F-4484 (б) на 7-е сутки сокультивирования
Высокую гиперингибирующую активность выявили также у штамма базидиомицета P. betulinus в отношении P. nalgiovense, P. roqueforti и P. nalgiovense, при этом эффект полной колонизации и лизиса мицелия отмечали в отношении штамма P. commune F-4486 (Рис. 4).
Рис. 2. Активность штамма В08/06 T. versicolor (1) в отноше^ нии штамма FM-4499 P. chrysogenum (2): А - подсев тест-культуры к колонии T.verscolor, Б - нарастание мицелия T.verscolor на колонии P. chrysogenum на 3-и сутки, В и Г - на 6 сутки совместного культивирования
При сокультивировании штамма T. versicolor с микромицетами P. roqueforti F-4484 и P. nalgiovense F-4492 на 7 сутки отмечали полное подавление их роста и лизис мицелия (Рис. 3).
Рис. 4. Нарастание мицелия P. betulinus (1) на «газон» микромицетов рода Penicillium: F-4492 P. nalgiovense (а, 2), F-4484 P. roqueforti (б, 2), F-4492 P. nalgiovense (в, 2); г - полное нарастание мицелия P. betulinus на «газон мицелия» P commune F-4486 на 7-е сутки сокультивирования
Для более объективной оценки степени фунги-цидного действия базидиомицетов определяли скорость нарастания мицелия на поверхности «газона»
микромицета. Установили, что при сокультивиро-вании штаммов базидиомицетов с P. chrysogenum, P. chrysogenum и P. polonicum происходит снижение скорости роста мицелия всех базидиомицетов в сравнении с показателем их суточной скорости роста в чистой культуре. При сокультивировании со штаммами микромицетов P. chrysogenum F-4499, P. nalgiovense F-4492 и P. roqueforti F-4484 отмечали незначительное снижение суточной скорости роста ба-зидиомицетов (табл. 1).
Таблица 1
скорость роста штаммов базидиомицетов в чистой культуре и при сокультивировании с Pénicillium spp.
Штаммы рода Penicillium Скорость роста базидиомицета, мм/сут
Fomitopsis officinalis Trametes versicolor Piptoporus betulinus
Контроль (рост без микромицета) 0,9 4,5 4,0
P.brevicompactum F-4481 0,8 3,3* 2,7*
P. chrysogenum F-4499 0,3* 2,6* 0,5*
P. commune F-4486 0,8 4,6 4,2
P. nalgiovense F-4492 0,7 4,2 3,7
P. polonicum F-4497 0,8 3,8* 3,6*
P. roqueforti F - 4484 0,8 4,5 3,6
Примечание «*» - различия достоверны
Штамм F. officinalis - медленно растущий, поэтому скорость колонизации этим штаммом Penicillium spp. была невысокой. Однако, при длительном сокультивировании в течение 20 суток, наблюдали полное нарастание на поверхность колоний всех штаммов Penicillium spp.
Учитывая высокую гиперингибирующую активность и скорость роста, для технологических целей целесообразно использование штамма В 08/06 T. versicolor в качестве антагониста - «фунгицида». Выявили, что при обработке спиртовым экстрактом мицелия штамма В 08/06 T. versicolor FM-4499 вискозная оболочка не инфицируется микромицетом P. chrysogenum (Рис. 5).
В другом варианте исследований установлено, что при интенсивном инфицировании микромице-том пленки вискозной оболочки «Вискейз» микро-мицет хорошо развивался и инфицировал пленку в течение 3-х суток полностью без внесения культуры T.versicolor (Рис.5, Г).
В Г
Рис. 5. Результаты испытания процесса инфицирования вискозной («Вискейз») и белковой («Белкозин») оболочек, обработанных спиртовым экстрактом мицелия T.versicolor: А - обработанная вискозная оболочка, Б - необработанная вискозная оболочка, В -обработанная белковая оболочка, Г- необработанная белковая оболочка
Во всех вариантах T.versicolor после внесения подавлял развитие P. chrysogenum. При внесении бази-диомицета в инфицированную оболочку через 3 суток, отмечали полное подавление плесневого гриба через 7 суток, а при внесении через 5 и 7 суток - полное вытеснение и лизис штамма F-4499 происходили на 10 сутки культивирования (Рис. 6).
Один из важных показателей проявления фунги-цидной активности - наличие ферментов хитиназ у продуцента, и эту способность продуцировать хи-тиназы связывают с гиперпаразитической активностью антагониста. При исследовании культуральных фильтратов штаммов T. versicolor, P. betulinus и F. officinalis показано, что они все обладали способностью к продукции хитиназ. Хитиназная активность культуральных фильтратов составила у T. versicolor - 9,1 ед/мл, у P. betulinus - 12,4 ед/мл и у F. officinalis -10,6 ед/мл. Наличием хитиназной активности у всех штаммов базидиомицетов можно объяснить механизм паразитирования на культурах микромицетов. Однако при практических рекомендациях следует учесть их скорость роста и антибиотическую активность синтезируемых ими соединений, экстрагируемых из мицелия.
заключение
Подводя итог наших предварительных исследований, необходимо отметить, что штаммы T. versicolor, P. betulinus и F. officinalis могут быть использованы для разработки биологически безопасных препаратов, предназначенных для противоплесневой защиты поверхности пищевых продуктов. При этом наиболее целесообразно применение штамма В 08/06 T. versicolor, что обусловлено его более высокими показателями скорости роста и цидной активности веществ, экстрагируемых из мицелия.
Рис. 6. Нарастание мицелия T.versicolor (1) на «газон» штамма РМ-4499 PenicШum сhrysogenum (2) на пленке: А - на 5-е сутки культивирования, Б - на 7-е сутки культивирования, В - контроль
цитированная литература
1.
Кузнецова Л.С., Михеева Н.В., Казакова Е.В. и др. Состав плесневых грибов, поражающих поверхность мясной продукции // Мясная индустрия. - 2009. - №3 - С. 28-30.
Кузнецова Л.С., Михеева Н.В., Чижов Г.П. «Ромонат» - добавка для стабилизации качества мясных продуктов // Мясная индустрия - 2009. - №9. - С. 30-33.
КузнецоваЛ.С. Научное обоснование и практические основы защиты поверхности пищевых продуктов от поражения мицелиальными грибами: Дисс...д.т.н. - МГУПБ, 2003. - 435с.
Шипулин В.И., Серов А.В., Шевченко И.М. Антимикробные препараты в производстве колбас // Мясная индустрия - 2009. - №4. - С. 63-65.
Петров П.Т., Скрипко А.Д., ЛитвиноваК.В. и др. Новые лекарственные средства на основе биологически активных соединений мицелиальных грибов // Успехи медицинской микологии. - 2006. - Т. 7. - С. 198-199. Феофилова Е.П. Новые биотехнологии получения биологически активных веществ из мицелиальных грибов // Успехи медицинской микологии. - 2007. - Т. IX. - С. 195-196.
Чхенкели В.А., Шниль Н.А. Противотуберкулезная активность базидиомицета Coriolus pubescens (Shum.: Fr.) Quel. и препарата, получаемого на его основе // Сибирский медицинский журнал - 2005. - Т. 50, №1. - С. 67-71. Громовых Т.И., Ковалева Г.К., Садыкова В.С., Айрапетова А.Ю. Биологические свойства нового штамма базидиомицета Tyv -2006 Fomitopsis officinalis (Will.) Bondartsev et Singer// Иммунология, аллергология, инфектология: Труды междисциплинарного микологического форума. - М., 2009. - №2. -С. 172-173.
Шишкина Л.Н., Капич А.Н. Антиоксидантная активность липидов ксилотрофныхбазидиомицетов // Успехи медицинской микологии. - 2006. - Т. VII. - С. 262-263.
Zhang W., Wang Y., Hou Y. Effect Chinese medicinal fungus water extract on tumor metastasis and some parameters of immune function // Int. Immunopharm. - 2004. - Vol. 4. - P. 461-468. 11. Громовых Т.И., Садыкова В.С., Ковалева Г. К., ЧерепановаЛ.И., ИнжеваткинЕ.А.Патент на изобретение № 2257222. Штамм базидиомицета Fomitopsis Tyv-2006, используемый для получения противоопухолевых препаратов. Заявка 207 20071474. Опубликовано 10.07.2009 г. Бюлл. № 19.
2.
3.
4.
5.
6.
7.
8.
9.
10
Поступила в редакцию журнала 14.02.2014 Рецензенты: А.Н. Лихачев
