CC BY
9
ОЦЕНКА ФЕРРОКИНЕТИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПРИ ТОКСИЧЕСКОМ ГЕПАТИТЕ В УСЛОВИЯХ АЛИМЕНТАРНОЙ ДЕПРИВАЦИИ ПРОТЕИНА*
Волощук О. Н., Копыльчук Г. П.
Институт биологии, химии и биоресурсов Черновицкого национального университета имени Юрия Федьковича
AN ASSESSMENT OF THE FERROKINETIC INDICES IN RATS WITH TOXIC HEPATITIS UNDER THE CONDITIONS OF ALIMENTARY DEPRIVATION OF PROTEIN
Voloshchuk O. N., Kopylchuk G. P.
Institute of Biology, chemistry and bioresources of Chernovtsi national university named by Yurii Fedkovych
Волощук О. Н., доцент кафедры биохимии и биотехнологии Копыльчук Г. П., профессор кафедры биохимии и биотехнологии Voloshchuk O. N., docent of the Biochemistry and biotechnology department Kopylchuk G. P., professor of the Biochemistry and biotechnology department
Резюме
В работе проведена оценка феррокинетических показателей сыворотки крови крыс с ацетаминофен-индуцирован-ным гепатитом в условиях алиментарной депривации протеина.
Исследования проведены на 4 группах животных: 1 — контроль; 2 — крысы, содержащиеся на низкопротеиновом рационе; 3 — крысы с острым ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся на полноценном рационе; 4 — крысы с ацетаминофен-индуцированным гепатитом, содержащиеся в условиях алиментарной депривации протеина. Содержание сывороточного железа и общей железосвязывающей способности сыворотки определяли колориметрически,% насыщения трансферрина железом — как отношение концентрации сывороточного железа к максимальной железосвязывающей способности трансферрина сыворотки. Наличие включений гемосидерина и характер гемосидероза определяли в срезах печени, окрашенных по методу Перлса. Количественное определение С-реактивного белка в сыворотке крови проводили иммуноферментным методом.
Показано, что у белок-дефицитных животных достоверных изменений показателей обмена железа и накопления гемосидерина не наблюдается. В то же время у животных с ацетаминофен-индуцированным гепатитом установлено 5-кратное увеличение содержания сывороточного железа на фоне незначительного повышения ОЖСС и двукратного увеличения насыщения трансферрина железом. При этом в гепатоцитах и клетках ретикулоэндотелиальной системы наблюдается накопление гемосидерина в мелкодисперсной форме, что соответствует 2 степени гемосидероза, на фоне появления в сыворотке С-реактивного белка. У белок-дефицитных животных с токсическим повреждением печени наблюдается резкое увеличение сывороточного железа на фоне снижения ОЖСС при максимальном насыщении трансферрина ионами железа. Установлено, что для животных данной группы характерным является 3 степень гемосидероза смешанного типа и интенсификация воспалительной реакции в печени.
Сделан вывод, что алиментарная депривация протеина в условиях токсического повреждения печени является критическим фактором для структурно-функционального состояния печени, поскольку сопровождается нарушением обмена железа в организме, развитием гемосидероза и интенсификацией воспалительного процесса в печени. Результаты исследований могут использоваться для биохимического обоснования терапевтических подходов к устранению и коррекции последствий токсического повреждения печени.
Ключевые слова: ацетаминофен-индуцированный гепатит, алиментарная депривация протеина, феррокинетиче-ские показатели, гемосидерин, С-реактивный белок
Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология 2016; 134 (10): 54-57
Summary
The ferrokinetic indices of blood serum of rats with acetaminophen-induced hepatitis under the conditions of alimentary deprivation of protein were assessed in the work.
Research was conducted on 4 groups of animals: 1 — control; 2 — rats maintained on low-protein diet; 3 — rats with acute acetaminophen-induced hepatitis, maintained on full-value ration, 4 — rats with acute acetaminophen-induced hepatitis, maintained under the conditions of alimentary deprivation of protein.
The serum iron content of and serum iron binding capacity were determined colorimetrically,% of the transferrin iron saturation — as a ratio of serum iron concentration to maximal iron binding capacity of serum transferrin. The presence of hemosiderin inclusions and the character of hemosiderosis were determined in the liver sections, stained by Perls method. Qualitative determination of C-reactive protein in blood serum was carried out by immunoenzymatic method.
* Иллюстрации к статье -на цветной вклейке в журнал
Волощук
Оксана Николаевна
Voloshchuk Oxana N. [email protected]
оценка феррокинетических показателей при токсическом гепатите.
| an assessment of the ferrokinetic indices in rats with toxic hepatitis.
It is shown, that in protein-deficiency rats any significant changes of iron metabolism indices and hemosiderin accumulation weren't observed. At the same time in rats with acetaminophen-induced hepatitis the 5-fold increase of the serum iron content against the background non-significant increase of serum iron binding capacity and the 2-fold increase of the transferrin iron saturation is established.
Simultaneously in the hepatocytes and reticuloendothelial system cells the accumulation of hemosiderin in the low dispersion form is observed, equating the second degree of hemosiderosis on the background emerging of C-reactive protein in serum. In protein-deficiency rats with toxic liver injury an abrupt increase of serum iron against the background reduction of the total serum iron binding capacity and maximal saturation of transferrin by iron ions is observed. It is established, that for animals from current group the third degree of mixed type hemosiderosis and the intensification of the inflammatory reaction in liver is characterstic.
Conclusion was made, that alimentary deprivation of protein under the conditions of toxic liver injury is the critical factor for structural-functional state of liver, being accompanied by the iron metabolism disturbances, development of hemosiderosis and intensification of the inflammatory reaction in liver. Research results may be used for the biochemical rationale of the therapeutic approaches for the elimination and correction of the toxic liver injury consequences.
Keywords: acetaminophen-induced hepatitis, alimentary deprivation of protein, ferrokinetic indices, hemosiderin, C-reac-tive protein
Eksperimental'naya i Klinicheskaya Gastroenterologiya 2016; 134 (10): 54-57
Введение
Оценка состояния основных функций печени при гепатопатологии является необходимой для понимания биохимических механизмов нарушения ее функционирования, разработки критериев ранней диагностики гепатопатологических состояний и поиска эффективных гепатопро-текторных препаратов [1]. В последнее время особый интерес представляет проблема перегрузки железом печени при заболеваниях печени различной этиологии [2-4]. Избыток железа является потенциально токсичным для организма вследствие активации перекисного окисления липидов и повреждения мембран клеток, окислительной деструкции белков и нуклеиновых кислот [5, 6]. Безопасный диапазон содержания железа в организме достаточно узкий и строго контролируется, в первую очередь во избежание возникновения как дефицита железа, так и его избытка в печени. Прямым морфологическим маркером перегрузки железом ткани является гемосидероз [7, 8].
В литературе гемосидероз печени чаще всего представлен как проявление наследственного гемохроматоза, обусловленного фенотипической экспрессией мутантных генов белков-переносчиков железа [9, 10]. Однако встречаются данные о наличии феномена гемосидероза печени при хронических диффузных заболеваниях печени, а также как следствие интоксикации, чрезмерного потребления железа, новообразований и других патологических процессов [7, 11]. При этом ранняя диагностика печеночной перегрузки железом необходима для выбора правильной тактики лечения и прогноза состояния пациента, поскольку накопление гранул гемосидерина в клетках печени сопровождается интенсификацией воспалительного процесса [12].
Целью нашей работы была оценка феррокинетических показателей сыворотки крови, а также характера гемосидероза печени у крыс с ацетами-нофен-индуцированным гепатитом в условиях алиментарной депривации протеина.
Материал и методы исследования
Исследования проводили на белых нелинейных i крысах массой 90-100 г и возрастом 2-2,5 месяца. i Работу с животными проводили с учетом положений Хельсинской декларации Всемирной меди- с цинской ассоциации от 1964 г., дополненной в 1975, ( 1983 и 1989 гг. л Крыс содержали по одной в пластмассовых н клетках с песчаной подстилкой, доступ к воде ad р libitum. Нормирование суточного рациона про- у водили с учетом принципа парного питания. Исследования проводили на 4 группах животных: э 1 — контроль (К); 2 — крысы, содержащиеся на t низкопротеиновом рационе (НПР); 3 — крысы л с острым ацетаминофен-индуцированным гепа- г титом, содержащиеся на полноценном рационе н (Г); 4 — крысы с ацетаминофен-индуцированным з
гепатитом, содержащиеся в условиях алиментарной депривации протеина (НПР+Г).
Животные 1-й и 3-й группы на протяжении 28 суток получали рацион, включающий 14% белка (в виде казеина), 10% жиров и 76% углеводов, сбалансированный по всем нутриентам [13]. Животные 2-й и 4-й группы получали изоэнергетический рацион, содержащий 4,7% белка, 10% жиров, 85,3% углеводов.
После четырехнедельного содержания крыс на экспериментальной диете моделирование ацета-минофен-индуцированного гепатита осуществляли путем введения per os ацетаминофена в дозе 1 г/кг массы животных в 2% крахмальной взвеси на протяжении 2 дней с помощью специального зонда [14].
Цервикальную дислокацию крыс под легким эфирным наркозом осуществляли на 31 сутки эксперимента.
Концентрацию железа в сыворотке крови и общую железосвязывающую способность сыворотки крови определяли колориметрическим методом с помощью набора реагентов фирмы "Филисит-Ди-агностика" (г. Днепропетровск, Украина).% насыщения трансферрина железом рассчитывали как отношение концентрации сывороточного железа к максимальной железосвязывающей способности трансферрина сыворотки. Для гистологического исследования срезы печени фиксировали в 10%-ном нейтральном формалине и заливали в парафин. Гистологические срезы ткани печени окрашивали методом Перлса. Тяжесть перегрузки клеток печени железом оценивали по Р.|. 8Ьеиег: 0-я степень — пигмент отсутствует; 1-я степень — пигмент менее
чем в 25% гепатоцитов в виде мелкодисперсных зерен преимущественно в перипортальной зоне, 2-я степень — пигмент в 25-50% гепатоцитов периферии долек присутствует в мелко и грубодисперс-ной форме, 3-я ст. — пигмент присутствует в мелко и грубодисперсной форме и занимает 50-75% гепатоцитов, присутствует в макрофагах и эпителии желчных протоков; 4-я степень — наличие пигмента носит сливной характер, окрашивая более 75% паренхимы, включая стромальные элементы [7]. Концентрацию С-реактивного белка определяли иммуноферментым методом с помощью диагностического набора hsCRP ELISA (США).
Статистическую значимость полученных результатов биохимических анализов оценивали с помощью непараметрического критерия Ман-на-Уитни с применением программы обработки статистических данных «Statistica 6.0».
Результаты исследования
Результаты проведенных исследований показали, что у белок-дефицитных животных наблюдается незначительное повышение содержания сывороточного железа (рис. 1) и общей железосвязывающей способности сыворотки (ОЖСС) (рис. 2) на фоне сохранения на уровне контрольных значений насыщения трансферрина железом (рис. 3). При этом у животных данной группы не отмечается накопление гемосидерина в печени и появление С-реактивного белка в сыворотке крови (рис. 6).
В то же время у животных с ацетаминофен-ин-дуцированным гепатитом установлено 5-кратное увеличение содержания сывороточного железа (рис. 1) на фоне незначительного повышения ОЖСС (рис. 2), при этом наблюдается двукратное увеличение насыщения трансферрина железом (рис. 3) по сравнению с показателями контроля. Следует отметить, что у животных с токсическим повреждением печени, содержащихся в условиях полноценого питания, наблюдается накопление гемосидерина в мелкодисперсной форме в гепатоцитах и клетках
ретикулоэндотелиальной системы (рис. 4), что соответствует 2 степени гемосидероза. При этом в сыворотке крови животных указанной группы установлено появление С-реактивного белка (рис. 5).
Оценка феррокинетических показателей животных с токсическим повреждением печени, индуцированном в условиях содержания крыс на низкобелковом рационе, показала выраженный дисбаланс обмена железа. В данной группе животных наблюдается резкое увеличение сывороточного железа (рис. 1) на фоне снижения ОЖСС (рис. 22) при максимальном насыщении трансферрина ионами железа (рис. 3). При этом в печени выявлены включения гемосидерина как в мелко, так и грубодисперсной форме (рис. 6). Установлено, что для животных данной группы характерным является 3 степень гемосидероза смешанного типа. В то же время наблюдается интенсификация воспалительной реакции в печени, о чем свидетельствует двукратное увеличение уровня С-реактивного белка в сыворотке крови.
Обсуждение полученных результатов
Гомеостаз железа в организме является высокоорганизованным процессом, управление которым обеспечивается рядом локальных и системных регуляторов путем контроля степени захвата, сохранения и выделения железа [15, 16]. Ключевая роль в регуляции гомеостаза железа принадлежит печени, поскольку она обеспечивает формирование депо железа в виде ферритина, синтезирует белки обмена железа (ферропортин, церулоплазмин), регулирует расходы железа при участии гепсиди-на [17]. При этом избыток железа накапливается в ткани печени в форме нерастворимого гемосидерина [11].
Проведенные исследования показали, что 4-не-дельное содержание крыс в условиях алиментарной депривации протеина не вызывает значительных изменений обмена железа. При этом повышение концентрации железа в сыворотке в условиях
дефицита белка, вероятно, может быть связано с нарушением синтеза железосвязывающих белков.
Установленное нами достоверное повышение содержание сывороточного железа на фоне повышения ОЖСС и насыщения трансферрина железом у животных с ацетаминофен-индуцированным гепатитом указывает на нарушение процесса рециркуляции железа. Около 80% железа сыворотки поступает в костный мозг для синтеза гемоглобина в созревающих эритроидных клетках из макрофагов, захватывающих эритроциты, при этом избыток железа возвращается в плазму крови, где циркулирует в форме трансферрина [18]. Указанный факт изменения феррокинетических показателей при токсическом повреждении печени свидетельствует о нарушении в гепатоцитах перехода железа в состав трансферрина, что способствует его избыточному накоплению.
оценка феррокинетических показателей при токсическом гепатите.
| an assessment of the ferrokinetic indices in rats with toxic hepatitis,
Следует отметить, что наиболее критические изменения феррокинетических показателей наблюдаются в группе животных с ацетаминофен-инду-цированным гепатитом, содержащихся в условиях алиментарного дефицита белка: установлено резкое увеличение концентрации сывороточного железа на фоне снижения ОЖСС при максимальном насыщении трансферрина ионами железа. Поскольку уровень железа поддерживается путем регуляции его всасывания и рециркуляции [17], вероятно, что в данных экспериментальных условиях наблюдается нарушение синтеза белков обмена железа как вследствие нарушения белоксинтезирующей функции печени, так и дефицита аминокислот.
С одной стороны, повышение концентрации свободного железа в сыворотке в данных условиях может индуцировать процессы свободно-радикального окисления липидов, в первую очередь мембран гепатоцитов, усугубляя структурно-функциональные нарушения в печени. С другой стороны, наблюдается депонирование в ткани печени нерастворимого гемосидерина, служащего формой отложения избытка железа. При этом характер гемосидероза определяют путем гистологического исследования срезов печени, окрашенных по методу Перлса [7].
Результаты наших исследований показали, что перегрузка клеток печени железом в форме гемосидерина характерна только для животных с токсическим повреждением печени, содержащихся в различных условиях белкового питания, при этом характер гемосидероза указанных групп животных отличается. У полноценно питающихся животных
с токсическим повреждением печени наблюдается 2 степень гемосидероза, тогда как белковая недостаточность у крыс с токсическим гепатитом вызывает 3 степень гемосидероза, характеризирующейся усиленным накоплением гемосидерина как в мелко, так и грубодисперсной форме.
В литературе [12] показано, что накопление гранул гемосидерина вызывает интенсификацию воспалительного процесса в печени, маркером которого являются белки острой фазы. Наиболее информативным маркером воспаления на сегодня считают С-реактивный белок [19], изменения концентрации которого используют для мониторинга процесса воспаления. Установленное нами увеличение концентрации С-реактивного белка в сыворотке крови белок-дефицитных крыс с токсическим гепатитом по сравнению с полноценно питающимися крысами согласуется с данными о более выраженом гемоси-дерозе печени животных данной группы и свидетельствует, что алиментарная депривация протеина усугубляет течение воспалительного процесса при токсическом повреждении печени.
Итак, алиментарная депривация протеина в условиях токсического повреждения печени является критическим фактором для структурно-функционального состояния печени, поскольку сопровождается нарушением обмена железа в организме, развитием гемосидероза и интенсификацией воспалительного процесса в печени. Результаты исследований могут использоваться для биохимического обоснования терапевтических подходов к устранению и коррекции последствий токсического повреждения печени.
Литература
1. Волощук О. Н., Копыльчук Г. П., Бучковская И. М. Активность маркерных ферментов печени при токсическом гепатите в условиях алиментарной депривации протеина // Экспериментальная и клиническая гастроэнтерология. — 2014. — Т. 108, № 8. — С. 96-100.
2. Deugnier Y., Turlin B. Pathology of hepatic iron overload // World J. Gastroenterol. — 2007. — Vol. 5, № 35. — P. 4755-4760.
3. Eng S. C., Taylor S. L. Hepatic iron overload in alcoholic end-stage liver disease is associated with iron deposition in other organs in the absence of HFE-1 hemochromatosis // Liver Int. — 2005. — Vol. 25, № 3. — Р. 513-517.
4. Ioannou G. N., Dominitz J. A. The effect of alcohol consumption on the prevalence of iron overload iron deficiency, and iron deficiency anemia // Gastroenterology. — 2004. — Vol. 126, № 5. — Р. 1293-1301.
5. Hentze M. W., Muckenthaler M. U., Andrews N. C. Balancing acts: molecular control of mammalian iron metabolism // Cell. — 2004. — Vol. 117. — Р. 285-297.
6. Tziomalos К., Perifanis V. Liver iron content determination by magnetic resonance imaging // World J. Gastroenterol. — 2010. — Vol. 16, № 13. — Р. 1587-1597.
7. Богуш Л. С., Бычков В. М., Рогов Ю. И. и др. Особенности гемосидероза у больных диффузными заболеваниями печени // Рецепт. — 2008. — Т. 60, № 4. — С.122-130.
8. Смирнов О. А. Железо-регуляторный гормон печени гепцидин и его место в системе врожденного иммунитета // РЖГГК. — 2010. — № 5. — С. 10-15.
9. Nash S., Marconi S., Sikorska К. et al. Role of Liver Biopsy in the Diagnosis of Hepatic Iron Overload in the Era of Genetic Testing // Am. J. Clin. Pathol. — 2002. — Vol. 118. P. 73-81.
10. BaconR.B. Hemochromatosis: Diagnosis and Management // J. Gastroenterol. — 2001. — Vol. 120, № 4. — P. 718-725.
11. Pereira L. Q., Strefezz R., Cata o-Dias J.L. Hepatic Hemosiderosis in Red-Spectacled Amazons (Amazona pretrei) and Correlation with Nutritional Aspects // Avian. Diseases. — 2010. — Vol. 54. — P. 1323-1326.
12. Птський Л. Л., Громашевський Л. Л., Решетткова В. М. та in. Морфолопчш методи вертифшаци стеатозу та гемосидерозу печшки у хворих на хрошчний гепатит С // Украшський морфолопчний альманах. — 2008. — Т. 6, № 3. — С. 57-62.
13. Волощук О. Н., Копыльчук Г. П., Кадайская Т. Г. Состояние системы энергообеспечения митохондрий печени в условиях алиментарной депривации протеина // Вопр. питания. — 2014. — Т. 83, № 3. — С. 12-16.
14. Voloshchuk O. N., Kopylchuk G. P. The Peculiarities of the Structural and Functional State of the Cytochrome Component of the Liver Mitochondrial Respiratory Chain under Conditions of Acetaminophen-Induced Hepatitis on the Background of Alimentary Protein Deprivation // Biophysics. — 2015. — Vol. 60, № 3. — Р. 420-424.
15. Naigamwalla D. Z., Webb J. A., Giger U. Iron deficiency anemia // Can. Vet. J. — 2012. — Vol. 53, № 3. — Р. 250-256.
16. Березенко В. С., Мостовенко Р. В., Диба М. Б. Роль по-рушень обмшу залiза в прогресуванш хрошчних вiрусних гепатипв // Гастроэнтерология и гепатоло-гия. — 2012. — Т. 42, № 2. — С. 102-105.
17. Anderson G. J., FrazerD. M. Hepatic iron metabolism // Semin Liver Dis. — 2005. — Vol. 25, № 4. — Р. 420-432.
18. Казюкова Т. В. Дефицит железа у демй и подростков // Лечебное дело. — 2005. — № 1. — С. 10-16.
19. PepysM. B., Hirschfield G. M. C-reactive protein: a critical update // J. Clin. Invest. — 2003. — Vol. 111. — P. 1805-1812.
К статье
Оценка феррокинетических показателей при токсическом гепатите в условиях алиментарной депривации протеина (стр. 54-57)
= 1000т I 900 -
I 800
700 600 -500 400 300 -200 100 0-
Шк
■нпр
Шг
ЕЗнпр+г
НПР
НПР+Г группа
: 600
i
{ 500 400 300 200 100 0
НПР
И НПР
Шг
ш нпр+г
НПР+Г группа
Рисунок 1.
Содержание железа в сыворотке крови крыс в условиях ацетаминофен-индуциро-ванного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина
Примечание:
*- достоверная разница по сравнению с контрольной группой (тут и далее) Легенда: К — контроль НПР — низкопротеиновый рацион
Г — ацетаминофен-индуцированный гепатит
НПР+Г — ацетаминофен-индуцированный гепатит на фоне
алиментарной депривации протеина
-
-
Рисунок 2.
Общая железосвязывающая способность сыворотки крови крыс в условиях ацетаминофен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина
Рисунок 3.
% насыщения сывороточного трансферрина железом в условиях ацетамино-фен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина
Рисунок 4.
Отложения гемосидерина в печени крыс в условиях ацетаминофен-индуциро-ванного гепатита. Окраска по методу Перлса, Х40.
35 т
30
25
20
15
10
5
0
т 1
1
ш
rirr
ШК ■нпр ш г ш нпр+г
НПР
НПР+Г группа
Рисунок 5.
Содержание С-реактивного белка в сыворотке крови крыс в условиях ацетамино-фен-индуцированного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина
Рисунок 6.
Отложения гемосидерина в печени крыс в условиях ацетаминофен-индуциро-ванного гепатита на фоне алиментарной депривации протеина. Окраска по методу Перлса, Х40.
мг/л
«
-
* '
:::::: ;
;
ШК
Инпр щ нпр+г
НПР
НПР+Г группа
%
