CC BY
88
637.33:576.852.4
ОЦЕНКА ФЕРМЕНТАТИВНОЙ АКТИВНОСТИ НЕКОТОРЫХ ШТАММОВ МОЛОЧНОКИСЛЫХ БАКТЕРИЙ
ГРАЖИНА ЦИХиШ, ЕЖИ РЫМАШЕВСКИ, МАРИАН КУЯВСКИ
Институт технологии молочного дела Сельскохозяйственно-техническая академия ( Олыитын, Польша)
Знание протеолитической и сбраживающей активности молочнокислых бактерий имеет решающее значение при подборе чистых культур для производства сыров [1 - 6 ]. Процесс созревания сыра -результат действия энзиматических комплексов, главным образом, ферментов, свертывающих белки молока, и ферментов молочнокислых бактерий. Микроорганизмы, участвующие в созревании сыра, воздействуют на субстрат либо путем освобождения ферментов, связанных с клеточной мембраной, либо, после лизиса клеток, путем освобождения внутриклеточных ферментов [5 -
к ].
Исследования [1, 11 - 15] и [16, 17, 18] свидетельствуют, что ферменты молочнокислых стрептококков можно разделить^ на две группы: внутриклеточные ферменты и ферменты, связанные с клеточной стенкой и цитоплазматической мембраной. Обе энзиматические системы различаются аминокислотным составом, молекулярным весом, устойчивостью к низким температурам и субстратной специфичностью.
Несмотря на значительный прогресс в изучении действия культур молочнокислых бактерий, вследствие их изменчивости необходима постоянная оценка ферментативной активности. Технический прогресс в области производства сыров также предъявляет новые требования к применяемым культурам. ,
В связи с вышесказанным целесообразной оказалась оценка протеолитической и сбраживающей активности внутриклеточных экстрактов и экстрактов клеточной стенки некоторых штаммов молочнокислых бактерий. Кроме того, предприняли попытку выделить р - галактозидазу и ферменты, сбраживающие лактозу, а также протеазы, используя метод хроматографии на геле ОЕАЕ-БерЬаёех А-5р.
В опыте использовали штаммы Б^ЛасИз 192, Б^Лас^ Т1 , ЬЬсЛасиэ Р-16иЬЬс. Ьи^апсиБ 171 из коллекции предприятия по производству молочных биопрепаратов “Биолакта” в г.Олынтыне. В качестве питательной среды служила сыворотка из молока, частично гидролизованного пепсином по Рымашевскому и сотр. [18], обогащенная добавкой глюкозы (0,5%), минеральных солей (Мй804 , МпБ04 и по 0,012%) и дрож-
жевым экстрактом (0,5%). Культуру вели в ферментере типа Вю1ес (модель 1601) емкостью 5 дм при 30 (молочнокислые стрептококки) ■-1-^ ^29 н 37° С (молочнокислые палочки). Питательную среду чнокулировали 5% добавкой культуры. В процессе культива-
'Ч
ции кислотность питательной среды поддерживали на постоянном уровне (pH 6,7 для молочнокислых стрептококков и pH 5,4 для молочнокислых палочек) путем автоматического добавления 25% раствора NH4 ОН. Процесс культивации бактерий проводили до момента окончания логарифмической фазы роста. Биомассу отделяли от питательной среды с помощью центрифуги Шарплесса (Penwalt - Англия) при 5500 g, а затем трижды промывал» стерильным 0,05 М натрий-фосфат-ным буфером pH 7,0, центрифугируя после каждой промывки в течение 15 мин. Центрифугированную биомассу замораживали при - 20° С. Замороженную биомассу дезинтегрировали механическим методом под давлением (дезинтегратор Biotex Х-25, 200 МПа). После дезинтеграции биомассу мацери-ровали в 0,05 М натрий-фосфатном буфере pH 7,0 (40 мл буфера на один объем камеры дезинтегратора) в течение 4 ч, после чего центрифугировали при 5500 g в течение 15 мин (центрифуга Beckman J-21С), получая таким образом внутриклеточный экстракт и осадок клеточной стенки. Осадок маце-рировали 4 ч в 2 М растворе NaCl, а затем центрифугировали указанным способом, получая экстракт клеточной стенки.
Характеристику экстрактов выполнили на основании следующих анализов:
A. Содержание белка по [19 ].
Б. Протеолитическая активность по [9 ].
В качестве субстрата использовали 1%-ный раствор изоэлектрического казеина в Q,05 М натрий-фосфатном буфере pH 6,0. К 2 см субстрата добавляли 2 см исследуемого экстракта и инкубировали при 30° С в течение 12 ч, после чего добавляли эквивалентное количество 11 % трихлорук-сусной кислоты и фильтровали. Содержание продуктов протеолиоза определяли спектрофотометрическим методом, измеряя абсорбцию при 280 нм (спектрофотометрBeckman, кювета 1 см). Приняли, согласно [9 ], что 1 ед. активности соответствует повышению оптической плотности фракции, растворимой в 5,5%-ной трихлоруксусной кислоте, на 0,01 (при 280 нм).
B. Сбраживающая активность по модифицированному методу [20].
В качестве субстрата использовали обезжиренное восстановленное молоко, стерилизованное при
0,6 атм в течение 15 мин. К 50 см субстрата добавляли 5 см исследуемого экстракта и выдерживали 6 ч при 30 или 37° С. Повышение кислотности определяли путем титрования 0,1 н. NaOH против фенолфталеина. В качестве единицы сбраживающей активности приняли повышение титруемой кислотности субстрата на 1 мл 0,1 н. NaOH.
Г. Хроматографическое разделение на геле DEAE-Sepnadex А-50.
Использовали колонку размером 2,5 х 40 см. Наносили ! 00 мгбелка, который затем разделяли с использов; нием 0,05 М натрий-фосфатного буфера pH 7,0 в пределах концентрации NaCl от 0,0 до 1,0 М (Gradiei t-Mikser фирмы Pharmacia) [21 ].Элюат собирали с помощью автоматического коллектора фракций ISCO-1200). Абсорбция элюата при 280 нм измерялась автоматически в проточной кю-
bfx
Таблица 1
Штамм Вид экстракта Содержание белка, мг/мл Активность, ед. активи. / 1мг белка
протеолитическаи сбраживающая
Streptococcus lactis 192 внутриклеточный 6,40 22,39 1,81
клеточной стенки 1,70 44,57 10,29
Streptococcus lactis TI внутриклеточный 2,09 41,50 5,88
клеточной стенки 2,50 14,03 2,76
Uictobaeillus lactis F-16 внутриклеточный 8,71 ' 20,32 2,70
клеточной степки 1,90 28,76 5,30
Lactobacillus bulgaricus 171 внутриклеточный 3,13 20,04 4,30
клеточной стенки 1,13 30,55 1,81
і а-
ifw.v
Пр1П
Яин-
lkV-Й
І-І L-.П ШЇІН
гЧиІ:
l.-j.'.llj
;■ см.
ічга
І; /ІНКіТ
іійн
І KHJ
ветс (0,5 см). В полученных фракциях, как и в экстрактах, определяли содержание белка, проте-олитическую и сбраживающую активность (А, Б, В).
В результате опытов отмстили существенные различия между внутриклеточными экстрактами и экстрактами клеточной стенки как в отношении ферментативной активности, так и по содержанию белка. Экстракты клеточной стенки, за исключением экстракта Str. laclis Т] , характеризовались более высокой протеолитической активностью и в несколько раз меньшим содержанием белка, чем соответствующие внутриклеточные экстракты. Экстракт клеточной стенки Str. lactis Т i отличался более высоким содержанием белка и примерно в три раза меньшей протсолитической активностью, чем внутриклеточный экстракт этого штамма (табл. 1). Исследуемые экстракты характеризовались различной сбраживающей активностью. Самой высокой сбраживающей активностью отличался экстракт клеточной стенки Str. lactis 192, а самой низкой - внутриклеточный экстракт Str. lactis 192 и экстракт клеточной стенки Lbc. bulgaricus 171 (табл. 1).
Существенные различия между внутриклеточными экстрактами и экстрактами клеточной стенки наблюдались также при их разделении на геле DEAE-Sephadcx. В результате хроматографического разделения внутриклеточных экстрактов юлучали от пяти (Str. lactis 192 и Lbc. bulgaricus 171) до семи (Str. lactis Ti ) фракций. Полученные фракции, как и экстракты, характеризовались различной ферментативной активностью и разным содержанием белка. Наибольшие различия касались протсолитической активности. В большинстве фракций отметили присутствие протсолитических ферментов, причем при разделении всех четырех внутриклеточных экстрактов (сплошные линии) получили по две фракции, характеризующиеся самой высокой протсолитической активностью (см.рисунок). Получены также фракции, не проявляющие протсолитической активности, - две при разделении внутриклеточного экстракта Sir. lactis Т1 и одна при разделении экстракта Lbc. bulgaricus 171. Эти фракции характеризовались относительно высокой сбраживающей активностью.
В результате хроматографического разделения экстрактов клеточной стенки исследуемых штам-
2 Заказ 190
мов молочнокислых бактерий получили от двух (Зт 1аси5 192 и Б1г. ^с^ ТО до семи (ЕЬс. 1ас115 Е-16) фракций, отличающихся как в отношении ферментативной активности, так и по содержанию белка. Обе фракции, полученные в результате разделения экстракта клеточной стенки 81г. 1асИ5 192, характеризовались подобным содержанием белка и протсолитической и сбраживающей активностью (табл. 2).Фракции, полученные в результате разделения экстракта клеточной стенки 1асИ8 Т1, тоже имели подобное содержание белка и сбраживающую активность. Однако фракция 2 отличалась примерно ь 2,5 раза большей протсолитической активностью (табл. 2). Иные результаты получены
Таблица 2
Вид экстракта Фракции Объем фракций,мл Содержание белка Протеолитическая активность Сбраживающая активность
мг/мл общее, мг ед. актив./ 1 мгбелка общая ед. актив. сд. актив./ 1 мг белка общая, ед. актив.
Внутриклеточный Streptococcus lactis 192
1 70 0,51 35,70 1 9,75 705,46 0,81 28,84
2 45 0,29 13,05 42,21 550,85 4,04 52,74
3 25 0,48 12,00 8,85 106,25 1,35 16,15
4 60 0,18 10,80 23,76 256,62 3,09 33,36
5 90 0,15 13,50 5,78 78,03 0,35 4,77
Клеточной стенки 1 75 0,18 13,50 30,71 414,58 7,25 97,87
2 145 0,25 35,00 41,20 1442,00 11,68 . 408,80
Внутриклеточный Streptococcus lactis Tі
1 45 0,25 11,20 . 108,96 1220,40 9,16 102,60
2 60 0,39 23,40 22,10 516,90 2,96 69,24
3 30 0,17 5,25 105,14 552,0 29,06 152,57
4 35 0,35 12,07 41,52 501,16 5,80 70,00
5 65 0,34 22,10 30,45 672,94 2,16 47,79
6 -55 0,35 12,14 0,00 0,00 2,35 28,53
7 60 0,23 13,50 0,00 0,00 4,15 55,99
Клеточной стенки 1 120 0,46 55,20 10,59 584,35 2,15 118,70
2 80 0,35 28,00 24,82 694,86 5,31 148,57
Внутриклеточный Lactobacillus lactis F-16
1 74,00 0,065 4,81 119,23 573,50 11,38 57,74
2 40,00 0,050 2,00 118,30 236,60 18,00 36,00
3 46,00 0,098 4,51 75,00 338,25 6,37 28,73
4 70,00 0,270 18,90 31,48 81,85 1,93 36,48
5 48,00 0,035 1,68 128,57 215,99 9,71 16,31
6 45,00 0,015 ' 0,68 933,33 634,66 4,00 2,72
Клеточной стенки 1 100,00 0,083 8,30 103,30 857,39 6,79 56,36
2 91,00 0,070 6,37 62,50 398,12 15,14 96,44
3 45,00 0,160 7,20 27,97 201,38 10,88 78,34
4 77,00 0,010 0,77 357,50 275,28 52,00 40,04
5 51,00 0,010 0,51 785,00 400,35 44,00 22,44
6 59,00 0,014 0,83 991,00 822,53 34,29 28,46
7 40,00 0,015 0,60 191,67 115,00 32,00 19,20
Внутриклеточный Lactobacillus bulgaricus 171
1 97,00 0,250 24,25 53,00 1285,25 6,40 155,20
2 32,00 0,310 9,92 10,65 105,65 8,26 81,94
3 45,00 0,138 6,21 10,54 65,45 14,69 91,22
4 145,00 0,338 49,01 0,00 0,00 2,73 133,80
5 53,00 0,058 3,07 86,09 264,30 5,22 16,03
Клеточной стенки 1 78,00 0,16 12,48 152,59 1904,30 3,00 37,50
2 33,00 1,10 36,30 2,25 81,67 0,45 16,36
3 77,00 0,10 7,70 60,00 462,00 6,20 47,74
тивностью (табл. 2). Иные результаты получены при хроматографическом разделении экстракта клеточной стенки Lbc. lactis F-16.
Фракции 1, 2, 3 характеризовались подобным содержанием белка (от 6,37 до 8,30 мг/мл). В свою очередь, содержание белка в четырех остальных фракциях было низким (ниже 1 мг/мл). Фракции
5 и 6, несмотря на низкое содержание белка, характеризовались самой высокой (среди фракций всех исследуемых экстрактов) протеолитической активностью и высокой сбраживающей активностью. , Наибольшей сбраживающей активностью отличалась фракция 4 (табл. 2). При разделении экстракта клеточной стенки (штриховые линии) Lbc.
рисунок). Фракция 2, отличающаяся наибольшим содержанием белка, характеризовалась самой низкой протеолитической и сбраживающей активностью (табл. 2).
Результаты, полученные в ходе хроматографического разделения исследуемых экстрактов на геле DEAE-Sephadex, не были вполне удовлетворительными. Лишь внутриклеточные экстракты Sir. Iactis Ti и Lbc. bulgaricus 171 дали фракции, в которых не обнаружили присутствия протсаз. В большинстве полученных фракций отметили присутствие как протсолитичсских ферментов, так и ферментов, сбраживающих лактозу.
Ферменты молочнокислых бактерий сосредоточены в двух структурах клетки: клеточной стенке и внутриклеточной фракции. Ферменты, связанные с клеточной стенкой, выполняют очень важную функцию при производстве сыров. Было установлено, что необходимым условием размножения бактерий, вводимых с закваской, является присутствие в молоке азота в виде свободных аминокислот или низкомолекулярных пептидов, содержащихся в молоке в небольшом количестве |5,10,22 |. Бактерии закваски, благодаря сосредоточенным в клеточной стенке протеазам, а также освобождаемым внутриклеточным протсиназам и пептидазам,устраняют этот дефицит |5 |. Это, в свою очередь, даст возможность размножения соответствующего числа клеток. Ферменты внутриклеточной фракции имеют значительно больший диапазон действия; они разлагают полипептиды до пептидов и свободных аминокислот, а также приводят к дезаминированию, декарбоксилированию и трансаминирова-нию аминокислот |2, 3, 4 |.
Из обеих анализируемых энзиматических систем более важными считают внутриклеточные ферменты, которые отвечают за деградацию белков и пептидов во время созревания сыра 123, 24, 25].
Результаты настоящих исследований подтверждают присутствие протсолитичсских ферментов, а также ферментов, гидролизующих и сбраживающих лактозу, как во внутриклеточной фракции, так и в клеточной стснкс молочнокислых бактерий. Однако применяемый нами метод отделения внутриклеточной фракции от фракции клеточной стенки не отличается высокой точностью, поэтому в экстрактах клеточной стенки могут находиться ферменты, связанные с цитоплазматической мембраной | 7,8]. Этим можно объяснить относительно высокую способность экстрактов клеточной стенки к протсолизу изоэлектрического казеина и высокую сбраживающую активность внутриклеточных экстрактов.
ВЫВОДЫ
1. Протеолитические ферменты и ферменты, сбраживающие лактозу, находятся как во внутри-
*
клеточной фракции, так и в клеточной стенке молочнокислых бактерий.
2. Отмечены различия в ферментативной активности в зависимости от штамма, а также между внутриклеточными экстрактами и экстрактами клеточной стенки. У молочнокислых стрептококков протсолитичсская и сбраживающая активность в среднем выше, чем у молочнокислых палочек. Внутриклеточные экстракты характеризуются более высоким содержанием белка и меньшей протеолитической активностью, чем соответствующие экстракты клеточной стенки.
3. Метод хроматографического разделения на геле ОЕАЕ БсрРи^сх позволяет частично отделить протсазы от ферментов, сбраживающих лактозу.
ЛИТЕРАТУРА
1. AuclairJ., Accolas J.P. Anionic von f-eeuwenhock,
49, 313 (1483).
2. Desmazeaud M.J., Zevaco C. Ann. Biol. Anim.
Biochem. Biophys 17, 723 (1977).
3. Desmazeaud M.J, Zevaco C.: Milchwiss. 34, 606, (1979).
4. Diaczenko P.E., Tiniakow W.G., Tacha S.: Pis/.czewaja Technologia, 3, 73 (1985).
5. Report New Zealand Dairy Research Institute 1985.
6. Vassal L„ Desmazeaud M.J., Gripon J.C.: Proc. Int. Symp. “Use of Enzvmcs in Food Technology”, 315 (1982).
7. Exterkate I .A. Neih. Milk Dairy J.. 29, 303,(1975).
8. Exterkate FA. J.Dairy Res., 46, 473 (1979).
9. Westhoff D.C., Cowman R.A., Speck M,L.: J.Dairy Sci.54, 1253 (1971).
10. Visser S., Slaugen N.J., Hup G., Sladhouders J.:
Ne'th. Milk Dairy J., 37, 191 (1983).
11. Accolas J.P., Hemme D„ Desmazeaud M.J.,
Vassal L., Bouillanne C., Veaux М.: Le Lait LX, 487, (1980).
12. Cowman R.A., Swaisgood H.E., Speck M.L., Bacleriol J.
94, 942 (1967).
13. Gripon J.C., Auberger B„ Lenoir J.: Int. J.Biochem, 1 2,
451 (1980)
14. Libudisz Z., Piatkiewicz A., Jakubowska J.:
Acta Alim. Colon. Ill, 433 (1977).
15. Pialkicwicz A., Libudzisz Z„ Jakubowska J.:
Ada Microbiol, l’olon. 26, 497 (1977):
16. Fcsnak D.. Rvmaszewski J., Kornacki K„ Kramkows-ka A.: Acta Alim. I’olon. Yl, 269 (1980).
17. Rumaszewski J., Zesz, Nauk. ART Olsztyn 13, 3 (1978).
18. Rumaszewski J„ Cichosz G„ Kjjjawski М.: Acta Alim.
Polon. XI, 449 (1985).
19. Lowry O.M., Rosenbrough N.J., Fair A.L., Randall R.J.: J.ISiol. Chem. 193, 265 (1951).
20. Sladhouders J., Hup G„ Exlerkate F.A., Visser S.: Neth.
. Milk. Dairy J. 37, 157 (1983).
21. Pharmacia “Cel filtration in theory and practise” (1970).
22. Soda M.E., Desmazeaud M.J., Can J.Mikrobiol, 28, 1181(19821.
23. Law B.A., Kolstad J.: Antonie von Leeuwenhoek, 49,
225(1983)
24. Lenoir J., I.D.F. Bulletin 171,3 (1984).
25. Oberman i., Libudisz Z. Acta Alim. Polon. IY, 201 (1978).
*
