CC BY
138
6. Lawrence T., Willoughby D. A., Gilroy D. W. Anti-inflammatory lipid mediators and insights into the resolution of inflammation // Nat. Rev. Immunol. - 2002. № 2. - P. 787-795.
7. Narumiya S., Sugimoto Y., Ushikubi F. Prostanoid receptors: structures, properties, and functions // Physiol. Rev. 79, 1999. - P. 11931226.
УДК: 616-085.38; 615.382; 615.281.8
© Ю.В. Толмосов, А.В. Цимбалов, Д.В. Блинов, А.Б. Строганов, В.Н. Мазепа, 2011
Ю.В. Толмосов, А.В. Цимбалов, Д.В. Блинов, А.Б. Строганов, В.Н. Мазепа ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ПРИМЕНЕНИЯ ПРОДУКТОВ ФОТОРАДИОЛИЗА ДЛЯ ИНАКТИВАЦИИ ВИРУСОВ В ПЛАЗМЕ ДОНОРСКОЙ КРОВИ
Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, г. Нижний Новгород
Разработка методов инактивации инфекционных агентов, обеспечивающих минимальный уровень риска передачи гемотрансмиссивных инфекций при введении реципиентам донорской плазмы и препаратов крови является весьма актуальным направлением развития гемотрансфузиологии. Настоящая работа была выполнена с целью оценки влияния продуктов фоторадиолиза на жизнеспособность вирусной культуры в плазме крови. Проведена инактивация плазмы крови, содержащей культуру бактериофага Pseudomonasaeruginosa, при помощи аппарата для ультрафиолетового облучения крови «Надежда-02».
Ключевые слова:фоторадиолиз, инактивация, вирусы, бактериофаг, плазма крови, вирусные гепатиты, вирус иммунодефицита человека.
Yu.V. Tolmosov, А.У. Tsimbalov, D.V. Blinov, А.В. Stroganov, V.N. Mazepa EFFICACY ASSESSMENT OF PHOTORADIOLYSIS IN VIRAL INACTIVATION OF DONATED BLOOD PLASMA
Elaboration of infectious agents inactivation methods, minimizing the risk level of hemotransmissive infections vection in donated blood plasma and blood products transfusion recipients is discussed in the article as a hemotrasfusiology development trend of immediate interest. The present study was performed in order to evaluate the effects of photoradiolytic products on viral culture viability in blood plasma. Inactivation of Pseudomonas aeruginosa bacteriophage culture in blood plasma by means of «Nadezhda-02» ultraviolet radiation unit was carried out.
Key wordsvphotoradiolysis, inactivation, viruses, bacteriophage, blood plasma, viral hepatitis, human immunodeficiency virus.
Переливание компонентов донорской крови и использование лечебных препаратов, полученных из нее, является одним из путей заражения пациентов вирусными гепатитами, ВИЧ и другими особо опасными инфекциями. Тем более, что в последние годы в группу заболеваний, передающихся при гемотрансфузиях, попали ещё более 30 “новых” инфекционных болезней человека. Вероятно, данная группа заболеваний будет продолжать увеличиваться. В этой связи весьма актуальным направлением развития гемотрансфузиологии является разработка методов инактивации инфекционных агентов, обеспечивающих минимальный уровень риска передачи гемо-трансмиссивных инфекций при введении реципиентам донорской плазмы и препаратов крови.
Существуют самые разнообразные способы инактивации вирусных патогенов, основанные на воздействии физических, химических факторов на генетический аппарат вирусов. К физическим способам относится метод постепенной, многостадийной тепловой обработки препаратов крови фибриногена и факторов свертывания крови VIII, IX. Однако тепловые способы инактивации не обеспечивают полноценного обезвреживаниятаких ви-
русных патогенов, как вирус иммунодефицита человека (ВИЧ), гепатит В [1]. Также к физическим методам инактивации вирусов относится использование гамма-облучения. Но гамма-облучение обладает инактивирующим воздействием на функционально активные и необходимые белковые компоненты плазменной фракции [2]. Химические методы инактивации вирусов, такие как применение фенола для этих целей, задерживает высокая токсичность бензольных и им подобных соединений [2]. Наиболее актуальным направлением в сфере борьбы с вирусными патогенами в препаратах донорской крови является применение методов инактивации, основанных на фо-тодинамических реакциях выделения синг-лентного кислорода. Наибольшее распространение в этой сфере получило использование фенотиазиновых красителей (метиленовый синий) и твердофазных фуллеренов [3, 4]. Радиолиз водных сред также ведет к образованию активных форм кислорода [5,6]. Однако использование данного явления в качестве мер по борьбе с вирусами в донорской крови не нашло отражения в научно-практической работе. В связи с этим была определена цель нашего исследования.
Цель исследования: оценка влияния
продуктов фоторадиолиза на жизнеспособность вирусной культуры в плазме крови.
Материал и методы
В проведённом исследовании использовали следующую методику обезвреживания вируса в донорской плазме: проводилиульт-рафиолетовое облучение в диапазоне волн от 185 до 375 нм с максимальной интенсивностью в диапазоне 254 нм донорской плазмы в смеси с физиологическим раствором хлорида натрия в соотношении 3:1 соответственно, содержащим культуру вируса. При этом облучение инактивируемой донорской плазмы проводили проточным способом путем её прокачки насосом со скоростью 2,7-7,2 мл/мин через кювету для ультрафиолетового облучения крови однократного применения. Кювета с толщиной плёнки 50 мкм является передней стенкой камеры отражателя источника облучения. В качестве последнего использовали индукционную всеволновую ртутнуюлампу аппарата для ультрафиолетового облучения крови «Надежда-02».
Данный способ инактивации вирусов основан на реакциях фотолитического радиолиза водных сред, при которых под воздействием ультрафиолетового облучения происходит образование короткоживущих гидроксильных радикалов ОН-, Н02, донором которых является физиологический раствор, находящийся в смеси с облучаемой средой. Необходимость добавления физиологического раствора натрия диктовалась следующим условием: водная среда в крови и её производных находится в связанном состоянии с крупными молекулярными единицами и соответственно не может выступать в качестве донора активных радикалов.
Материалом для исследования была плазма, содержащая культуру бактериофага Р8еЫошопа8аег^то8а. Определение титра жизнеспособного бактериофага после проведения процедуры инактивации проводили по методу Грация. Эксперимент проводили следующим образом: 300 мл плазмы были разделены на 6 аликвот по 50 мл в каждой, в каждую аликвоту вносилось по 5 мл культуры бактериофага таким образом, что его концентрация в них составила 1х107 частиц в 1 мл. Одна аликвота (контрольная) помещалась на время эксперимента в холодильник, пять других аликвот подвергали процедуре инактивации по способу, предложенному авторами, в режимах, описанных ниже. Процедуру инактивации культур бактериофага в крови выполняли в пяти сериях опытов:
• Серия №1 - облучение 50 мл плазмы крови, суспендированной с культурой бактериофага в концентрации 1х107 частиц в 1 мл проводили при следующих условиях: камера отражателя источника излучения заполнена кислородом под давлением 90 мм рт.ст.; скорость пролива плазмы через кювету - 4,6 мл/мин.
• Серия №2 - облучение 50 мл плазмы, суспендированной с культурой бактериофага в концентрации 1х107 частиц в 1 мл с физиологическим раствором хлорида натрия в соотношении 3:1 выполняли при следующих условиях: камера отражателя заполнена инертным газом аргоном под давлением 30 мм рт.ст.; скорость пролива плазмы через кювету - 4,6 мл/мин.
• Серия №3 - облучение 50 мл плазмы суспендированной с культурой бактериофага в концентрации 1х107 частиц в 1 мл с физиологическим раствором хлорида натрия в соотношении 3:1 проводили при следующих условиях: камера отражателя заполнена инертным газом аргоном под давлением 30 мм рт.ст.; скорость пролива плазмы через кювету - 6,2 мл/мин.
• Серия №4 - облучение 50 мл плазмы, суспендированной с культурой бактериофага в концентрации 1х107 частиц в 1 мл с физиологическим раствором хлорида натрия в соотношении 3:1 проводили при следующих условиях: камера отражателя заполнена инертным газом аргоном под давлением 30 мм.рт.ст.; скорость пролива плазмы через кювету - 7,2 мл/мин.
• Серия №5 - облучение 50 мл плазмы крови, суспендированной с культурой бактериофага в концентрации 1х107 частиц в 1 мл проводили при следующих условиях: камера отражателя источника излучения заполнена инертным газом аргоном под давлением 30 мм рт.ст.; скорость пролива плазмы через кювету - 4,6 мл/мин.
После проведения процедур инактивации для каждой из 6 аликвот приготовили серии десятикратных разведений в 10, 100, 1000, 10000, 100000, 1000000 раз в физиологическом растворе. Из разведений в 10000, 100000, 1000000 для всех аликвот по 0,1 мл вносили в 2мл расплавленного 0,7% мясо-пептонного агара, содержащего бактерии Р8еЫошопа8аег^то8а, агар перемешивали и выливали на поверхность 1,8% мясо-пептонного агара в чашке Петри, чашки инкубировались 24 часа при температуре 37оС. Жизнеспособность бактериофага оценивали следующим образом: на фоне сплошного бак-
териального роста жизнеспособные фаговые частицы образуют прозрачные пятна - негативные колонии. Нежизнеспособный, инактивированный бактериофаг негативных колоний не образует.
Результаты и обсуждение
В опыте серии №1 при заданных параметрах облучения инактивации бактериофага не произошло. Отмечалось наличие негативных колоний в контрольном и опытном посевах (рис. 1). Данный результат связан с тем, что жёсткое УФ-излучение 180-280 нм с повышенной энергией фотонов тратится на образование озона из кислорода, которым заполнена камера отражателя.
Рис. 1. Результат посева плазмы на мясо-пептонный агар в опыте серии №1:1 - контрольный посев; 2 - опыт; 3 - негативные колонии бактериофага в контрольном посеве; 4 - негативные колонии в опытном посеве
В опыте серии №2 культура бактериофага Pseudomonas aeruginosa была полностью инактивирована. Об этом свидетельствует отсутствие негативных колоний вируса в опытном посеве при значительном их количестве в контрольном посеве (рис. 2).
Рис. 2. Результат посева плазмы на мясо-пептонный агарв опыте серии №2:1 - контрольный посев; 2 - опыт; 3 - негативные колонии бактериофага в контрольном посеве
В опытах серии №3 также была обнаружена полная инактивация вируса. Это подтверждается отсутствием негативных колоний культуры бактериофага Pseudomonasaerugino-sa в опытном посеве (рис. 3). Положительные результаты опытов в сериях №2 и №3 связаны с наличием свободных гидроксильных групп, донором которых является физиологический раствор, а также с оптимальной скоростью пролива плазмы через кювету. Для подтверждения роли вышеперечисленных факторов в инактивации бактериофага были проведены опыты серий №4 и №5.
Рис. 3. Результат посева плазмы на мясо-пептонный агар в опыте серии №3: 1 - контрольный посев; 2 - опыт; 3 - негативные колонии бактериофага вконтрольном посеве
При проведении опытов серии №4 при заданных параметрах облучения произошла частичная инактивация культуры бактериофага. Обнаружены 3 негативные колонии вирусной культуры в опытном посеве (рис. 4). Данный эффект связан с более высокой скоростью прокачки плазмы через кювету, чем в опытах серий №2 и №3. Обратно пропорционально увеличению скорости пролива плазмы уменьшается и время УФО раствора.
Рис.4. Результат посева плазмы на мясо-пептонный агар в опыте серии №4:1 - контрольный посев; 2 - опыт; 3 - негативные колонии бактериофага в контрольном посеве; 4 - негативные колонии в опытном посеве
При проведении процедуры инактивации без добавления физиологического раствора в облучаемую среду в опытах серии №5 жизнеспособность бактериофага сохранилась (рис. 5).
Рис.5. Результат посева плазмы на мясо-пептонный агар в опыте серии N«5:1 - контрольный посев; 2 - опыт; 3 - негативные колонии бактериофага в контрольном посеве; 4 - негативные колонии в опытном посеве
Данный результат опыта подтверждается наличием негативных колоний культуры бактериофага Pseudomonasaeruginosa в опытных посевах плазмы после проведения процедуры инактивации.
Таким образом, на основании проведен- хлорида натрия, заполнение камеры отража-
ного исследования можно сделать следующие теля источника излучения инертным газом
выводы: аргоном, скорость прокачки плазмы через кю-
во-первых, полная потеря жизнеспособ- вету 4,6-6,2 мл/мин;
ностикультуры бактериофага Pseudomonasae- во-вторых, при отсутствии в облучае-
ruginosa после проведения процедуры инакти- мой среде физиологического раствора как од-
вации методом фоторадиолиза происходит ного из компонентов фотолитической реакции
при следующих условиях: разведение облу- жизнеспособность культуры вируса в донор-
чаемой среды физиологическим раствором ской плазме после облучения сохраняется.
Сведения об авторах статьи:
Толмосов Ю.В. - Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (831) 463-98-52, e-mail: tolmosov31508@mail.ru
Цимбалов А.В. - Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора(831) 463-98-52, e-mail: bio@biotehnik.com
Блинов Д.В. - Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора, e-mail: judo120587@yandex.ru
Строганов А.Б. - Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (831) 463-98-52, e-mail: andrey_stroganov@rambler.ru
Мазепа В.Н. -Нижегородский научно-исследовательский институт эпидемиологии и микробиологии имени академика И.Н. Блохиной Роспотребнадзора (831) 433-76-55, e-mail: micro@sinn.ru
ЛИТЕРАТУРА
1. Способ инактивации вируса иммунодефицита человека и других вирусов в плазме крови человека с сохранением функциональной активности белков плазмы крови // Тимофеев И.В., Вараксин Н.А., Перминова Н.Г, Нечаева Е.А.; Дядин Ю.А., Журко Ф.В.// Патент на изобретение № 2152994, C12N7/04 (20.07.2000).
2. Vyas G.N. Inactivation and removal of blood borne viruses // Transfusion. - 1995, Vol. 35, № 5. - 367-370 p.
3. Пиотровский, Л.Б., Белоусова, И.М., Данилов, О.Б. , Киселев, О.И., Фуллерены: фотодинамические процессы и новые подходы в медицине. - СПб.: Роза мира, 2005. - 75 с.
4. Белоусов, В.П. Водный мицеллярный раствор С60: получение, некоторые свойства и способность к генерации синглет-ного кислорода /В.П. Белоусов, И.М.Белоусова, А.В.Крисько, ТК.Крисько, Т.Д.Муравьева, [и др.].// Журнал общей химии. - 2006. - Т. 76, № 2. - С. 265-272.
5. Пикаев, А.К. Импульсный радиолиз воды и водных растворов /А.К. Пикаев, С.А.Кабакчи, И.Е.Макаров, Б.Г Ершов. М.: Атом-издат, 1995. - С. 19-47.
6. Ершов, Б.Г., А.В. Гордеев. Диффузионно-кинетическая модель радиолиза воды и водных растворов // Современные проблемы физической химии. - М.: Граница. - 2005. - С. 520—542.
7. Жибурт, Е.Б. Вирусинактивация плазмы /Е.Б.Жибурт, Н.ГФилина, М.Н.Губанова // Вестник Национального медикохирургического центра им. Н.И. Пирогова. - 2007. - Т.2, №1. - С.105-110.
8. Жибурт, Е.Б. Модернизация бактериальной безопасности в трансфузиологии /Е.Б. Жибурт, А.В.Караваев, Н.ГФилина, М.Н.Губанова // Трансфузиология. - 2010. - Т. 11, № 4. - С.38-48.
