CC BY
12
ФИЗИКО-ХИМИЧЕСКАЯ И ОБЩАЯ БИОЛОГИЯ / PHYSICAL-CHEMICAL AND GENERAL BIOLOGY
Оригинальная статья / Original article
УДК 664.162.036.4:577.15
DOI: 10.21285/2227-2925-2017-7-4-51 -57
ОЦЕНКА ЭФФЕКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТАТИВНОГО ГИДРОЛИЗА
ПЛОДОВЫХ ОБОЛОЧЕК ОВСА С ПОДПИТКОЙ
ПРИ ВЫСОКИХ НАЧАЛЬНЫХ КОНЦЕНТРАЦИЯХ СУБСТРАТА
© Е.И. Макарова, В.В. Будаева
Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН, Российская Федерация, 659322, Россия, г. Бийск, ул. Социалистическая, 1.
Цель работы - исследование ферментативного гидролиза продукта химической обработки плодовых оболочек овса при различных концентрациях субстрата, а также возможности увеличения эффективности гидролиза при высокой начальной концентрации субстрата различными вариантами подпитки. Процесс ферментативного гидролиза продукта химической обработки плодовых оболочек овса проводился при различных начальных концентрациях субстрата, а также с различными вариантами подпитки, в первом случае - ферментов, во втором - субстрата. Определены зависимости текущей концентрации и выхода РВ от начальной концентрации субстрата в диапазоне 45-200 г/л. Показана возможность увеличения выхода редуцирующих веществ в обоих случаях подпитки. Установлено, что увеличение начальной концентрации субстрата от 45 г/л до 20о г/л приводит к увеличению конечной концентрации РВ на 81 г/л, при этом выход РВ снижается на 33%; подпитка ферментных препаратов или субстрата при ферментативном гидролизе с максимальной концентрацией субстрата 200 г/л позволяет увеличить степень конверсии субстрата на 10-12%.
Ключевые слова: плодовые оболочки овса, щелочная делигнификация, ферментативный гидролиз, подпитка, ферментные препараты, субстрат.
Формат цитирования: Макарова Е.И., Будаева В.В. Оценка эффективности ферментативного гидролиза плодовых оболочек овса с подпиткой при высоких начальных концентрациях субстрата // Известия вузов. Прикладная химия и биотехнология. 2017. Т. 7, N 4. С. 51-57. DOI: 10.21285/2227-29252017-7-4-51-57
ESTIMATION OF THE EFFICIENCY OF THE OAT BRAN ENZYMATIC HYDROLYSIS WITH FEEDING AT HIGH INITIAL SUBSTRATE CONCENTRATIONS
© E.I. Makarova, V.V. Budaeva
Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences, 1, Sotsialisticheskaya St., Biysk, 6592322, Russian Federation
The aim of the work was to investigate the enzymatic hydrolysis of a chemical treatment product of oat bran at different substrate concentrations, as well as to evaluate the possibility of increasing the efficiency of hydrolysis at high initial substrate concentrations across different feeding variants. The process of enzymatic hydrolysis of a chemically treatment for oat bran products was carried out at various initial substrate concentrations, as well as with various ways of feeding: first - enzymes, second - substrate. The dependences of the current concentration and the yield of reducing substances (RS) from the initial substrate concentration in the range of 45-200 g / l are determined. The possibility of increasing the yield of reducing substances in both cases of feeding is indicated. It was found that an increase in the initial substrate concentration from 45 g /1 to 200 g /1 leads to an increase in the final concentration of RS by 81 g /1, while the RS yield is reduced by 33%; the enrichment of enzyme preparations or substrates in enzymatic hydrolysis with a maximum substrate concentration of 200 g /1 makes it possible to increase the substrate conversion rate by 10-12%. Keywords: oat hulls, alkaline delignification, enzymatic hydrolysis, feeding, enzyme preparations, substrate
For citation: Makarova E.I., Budaeva V.V. Estimation of the efficiency of the oat bran enzymatic hydrolysis with feeding at high initial substrate concentrations. Izvestiya Vuzov. Prikladnaya Khimiya i Biotekhnologiya [Proceedings of Universities. Applied Chemistry and Biotechnology]. 2017, vol. 7, no. 4, pp. 51-57. (in Russian). DOI: 10.21285/2227-2925-2017-7-4-51-57
ВВЕДЕНИЕ
Ферментативный гидролиз является этапом, ограничивающим скорость развития технологии получения биотоплива из лигноцел-люлозной биомассы, вследствие низких концентраций Сахаров в гидролизатах [1]. Известно, что процесс получения этанола из лигно-целлюлозных субстратов может быть экономически целесообразным при концентрации этанола в бражке свыше 4% [2], для достижения которой требуемая концентрация субстрата, содержащего более 60% целлюлозы, должна составлять не менее 15%, при степени его конверсии не менее 90% и выходе этанола 0,5 г/г глюкозы [3]. Однако концентрация лигно-целлюлозных субстратов на уровне 15% и более считается высокой из-за их твердотельной природы. При ферментативном гидролизе с такой концентрацией субстрата снижается скорость реакции и уменьшается степень его конверсии вследствие ингибирования ферментов продуктами реакции, ограниченного тепло- и массопереноса, тепловой дезактивации ферментов и др. [4, 5]. Для избегания таких проблем и увеличения выхода сахаров предлагается ряд решений, среди которых проведение ферментативного гидролиза с подпиткой - добавлением свежих порций ферментов и/или субстрата. Есть мнение, что такой процесс является более эффективным и экологически чистым, снижает стоимость производства и объемы потребляемой энергии при перегонке целевого продукта [6].
Целью работы является исследование ферментативного гидролиза продукта химической обработки плодовых оболочек овса при различных концентрациях субстрата, а также возможность увеличения эффективности гидролиза при высокой начальной концентрации субстрата различными вариантами подпитки.
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ
Субстрат получен на опытном производстве ИПХЭТ СО РАН обработкой плодовых оболочек овса разбавленным раствором гид-роксида натрия в одну стадию. Для ферментативного гидролиза субстрата использовались ферментные препараты «Целлолюкс-А» (ООО ПО «Сиббиофарм», Россия) и «Брюзайм BGX» («Polfa Tarchomin Pharmaceutical», Польша). «Целлолюкс-А» стандартизирован по целлю-лазе, «Брюзайм BGX» - по гемицеллюлазе и обладает высокой целлюлазной активностью.
Массовые доли (м.д.) основных компонен-
тов в субстрате определялись по стандартным
методикам анализа продуктов переработки
1
растительного сырья .
Гидролиз при различных начальных концентрациях субстрата проводился в диапазоне 45-200 г/л. Навеска субстрата вносилась в колбу Эрленмейера, заливалось 0,15 л ацетатного буфера с растворенными в нем ферментными препаратами. Фермент-субстратное соотношение 1:50. Параметры процесса: температура 45±2 °С, рН 4,6 ± 0,3, перемешивание на горизонтальной перемешивающей платформе с частотой колебаний 150 мин-1. Продолжительность гидролиза 88 ч.
Гидролиз с подпиткой проводился в тех же условиях при концентрации субстрата 200 г/л. В первом случае исследовался гидролиз с подпиткой ферментов - при этом вся навеска ферментных препаратов делилась на 3 части, первая вносилась в начале процесса, вторая и третья - через 24 и 64 ч соответственно. Во втором случае исследовалось влияние подпитки субстрата на эффективность ферментативного гидролиза. При этом вся навеска субстрата 30 г делилась на равные части, которые вносились в колбу через определенные промежутки времени: через каждые 8 ч (начальная концентрация субстрата 25 г/л, через 16 ч 50 г/л и через 32 ч 67 г/л до достижения концентрации 200 г/л.
В процессе гидролиза проводился отбор проб, их фильтрование и определение концентрации редуцирующих веществ (РВ) в фильтрате на спектрофотометре UNICO UV-2804 (США) с использованием реактива на основе 3,5-динитросалициловой кислоты [7]. Абсолютная погрешность определения концентраций РВ 0,02 г/л в диапазоне 0,2-2,0 г/л.
По окончанию гидролиза рассчитывался выход РВ на массу субстрата по формуле
„ = ^ • 0,9 • юо;
тс
где ПрВ- выход РВ от массы субстрата, %; Ск -
1Оболенская А.В., Ельницкая З.П., Леонович А.А. Лабораторные работы по химии древесины и целлюлозы. М.: Экология, 1991. 320 с. Obolenskaya A.V., El'nitskaya Z.P., Leonovich A.A. Laboratornye raboty po khimii drevesiny i tsellyulozy [Laboratory Works on Wood and Cellulose Chemistry: Textbook for Higher Educational Institutions]. Moscow: Ekologiya Publ., 1991, 320 р.
конечная концентрация РВ в гидролизате, г/л; Vг - объем ацетатного буфера, л; 0,9 - коэффициент, обусловленный присоединением молекулы воды к ангидроглюкозным остаткам соответствующих мономерных звеньев в результате ферментативного гидролиза; mc -масса субстрата для ферментации, г.
ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
Согласно результатам анализа, химический состав субстрата представлен по большей части гидролизуемыми компонентами -целлюлозой (88,0%) и пентозанами (4,5%). Меньшая доля относится к негидролизуемым примесям - кислотонерастворимому лигнину (6,7%) и золе (0,6%).
На первом этапе исследовался ферментативный гидролиз субстрата при начальных концентрациях 45-200 г/л. На рис. 1 приведены результаты экспериментов в виде зависимостей конечной концентрации и выхода РВ от начальной концентрации субстрата. Установлено, что при увеличении концентрации субстрата от 45 г/л до 150 г/л конечная концентрация РВ увеличивается от 42 г/л до 106 г/л,
увеличение концентрации субстрата до 200 г/л не приводит к дальнейшему росту концентрации РВ в гидролизате. При этом происходит снижение выхода РВ от 83 до 48%, которое объясняется частичным ингибированием ферментов продуктами реакции при высоких концентрациях субстрата, а также необратимой сорбцией ферментов на избытке субстрата и выводом катализатора из реакционной среды. Проведение ферментативного гидролиза с последовательным внесением свежих порций ферментных препаратов и субстрата, возможно, позволит увеличить концентрацию и выход РВ.
Вторым этапом работы было исследование гидролиза при концентрации субстрата 200 г/л с подпиткой ферментными препаратами. Рассчитанное количество ферментных препаратов делилось на три части, которые вносились в 0, 24 и 64 ч гидролиза. На рис. 2 представлены результаты сравнения ферментативного гидролиза с единовременным внесением ферментных препаратов и с их подпиткой в виде зависимостей концентрации РВ от продолжительности гидролиза.
Рис. 1. Зависимость конечной концентрации РВ (▲) и выхода РВ (•) от начальной концентрации субстрата
Fig. 1. Final concentration (▲) and yield of reducing sugars (•) at different initial
concentration of substrate
Значения начальной скорости в первые 16 ч гидролиза в двух случаях очень близки, что может быть связано с наличием в системах «свежих» ферментов. Однако, согласно рис. 2, через 16 ч скорость гидролиза в режиме с подпиткой уменьшается, что объясняется меньшей начальной концентрацией ферментных препаратов в сравнении с режимом без подпитки. Добавление новой порции ферментов через 24 и 64 ч приводит к резкому увеличению скорости гидролиза и в итоге большей конечной концентрации РВ и их выхода. Скорость образования РВ для процесса с единовременным внесением ферментов сначала уменьшается, а через 64 ч гидролиза и вовсе выходит на плато, что связано с ингибирова-нием ферментов по описанным выше причинам. Прирост концентрации РВ для процесса с подпиткой ферментных препаратов не останавливается даже через 88 ч гидролиза. Таким образом, было установлено, что проведение ферментативного гидролиза при начальной концентрации субстрата 200 г/л с внесением свежих порций ферментных препаратов приводит к увеличению конечной концентрации РВ
через 88 ч на 23 г/л и выхода РВ на 10%.
Третьим этапом было исследование ферментативного гидролиза с подпиткой субстрата. На рис. 3 представлены результаты эксперимента в виде зависимости концентрации РВ от продолжительности гидролиза.
Для эксперимента с внесением всей навески субстрата в начале гидролиза наблюдается максимальная скорость гидролиза, однако через 64 ч гидролиза кривая выходит на плато при значении концентрации РВ 106 г/л. В экспериментах с подпиткой субстрата наблюдается меньшая скорость гидролиза и небольшие участки с замедлением реакции, где кривая выходит на плато, но при добавлении свежей порции субстрата начинается дальнейший рост концентрации РВ. Схожий характер кривых и максимальная концентрация РВ наблюдается для экспериментов с подпиткой субстрата через 8 и 16 ч - 128 и 133 г/л соответственно. Добавление свежих порций субстрата через 32 ч не дало увеличения конечной концентрации РВ (104 г/л), однако характер кривой свидетельствует о возможности ее дальнейшего роста.
Рис. 2. Зависимость концентрации РВ от продолжительности гидролиза субстрата при начальной концентрации 200 г/л в процессах с различными режимами внесения
ферментных препаратов
Fig. 2. Time course of reducing sugars during hydrolysis (initial substrate concentration 200 g/L)
at different modes of enzymes introduction
Рис. 3. Зависимость концентрации РВ от продолжительности гидролиза субстрата в процессах с единовременным внесением субстрата и с его подпиткой
Fig. 3. Time course of reducing sugars during hydrolysis at different modes of substrate introduction
Значения выходов РВ, полученные в экспериментах с подпиткой и без нее представлены в таблице. Минимальными значениями выхода РВ характеризуются эксперименты с единовременным внесением субстрата (48%) и при подпитке субстрата через 32 ч (47%). Если в первом случае низкий выход РВ объясняется ингибированием ферментных препаратов, то во втором он связан с недостаточной продолжительностью процесса и, как следствие, неполным гидролизом добавленной через 64 ч порции субстрата. Подпитка свежими порциями ферментными препаратами или субстрата
(каждые 8 или 16 ч), как и предполагалось, позволила увеличить значение конечного выхода РВ на 10-12%.
В литературе встречается описание ферментативного гидролиза целлюлозных субстратов с различными вариантами подпитки. Так в работе [1] описан ферментативный гидролиз древесины после предварительной обработки при концентрации 200 г/л и установлено, что добавление субстрата по частям (через 24, 56 и 80 ч) приводит к большей конверсии целлюлозы в сравнении с периодическим процессом, а именно происходит увеличение ко-
Результаты ферментативного гидролиза субстрата с концентрацией 200 г/л
Results of enzymatic hydrolysis of 200 g/L concentration substrate
Условия Концентрация РВ, г/л Выход РВ, %
Без подпитки 106,0 48
Подпитка ферментных препаратов через 24 и 64 ч 129,0 58
Подпитка субстрата каждые 8 ч 128,2 58
Подпитка субстрата каждые 16 ч 132,7 60
Подпитка субстрата каждые 32 ч 103,7 47
нечной концентрации сахаров от 80,8 г/л до 127,0 г/л, а их выхода с 36 до 57%.
Несмотря на большую эффективность подпитки при гидролизе субстрата из древесины (выход РВ увеличился на 21%) по сравнению с результатами гидролиза субстрата из плодовых оболочек овса (выход РВ увеличился на 10%), конечная концентрация Рв в двух случаях практически одинаковая - 127 и 128133 г/л соответственно. Данный факт может свидетельствовать об остановке процесса вследствие наступления равновесного состояния. Для дальнейшего увеличения степени конверсии субстратов целесообразно проведение одновременных процессов гидролиза и
1. Gupta R., Kumar S., Gomes J., Kuhad R.C. Kinetic study of batch and fed-batch enzymatic saccharification of pretreated substrate and subsequent fermentation to ethanol // Biotechnology for Biofuels. 2012. N 5:16. P. 1-10.
2. Fan Z., South C., Lyford K., Munsie J., Walsum P., Lynd L.R. Conversion of paper sludge to ethanol in a semicontinuous solids-fed reactor // Bioprocess And Biosystems Engineering. 2003. N 26. P. 93-101.
3. Jorgensen H., Vibe-Pedersen J., Larsen J., Felby C. Liquefaction of lignocellulose at high-solids concentrations // Biotechnology and Bioengineering. 2007. N 96. P. 862-870.
4. Du J., Cao Y., Liu G., Zhao J., Li X., Qu Y. Identifying and overcoming the effect of mass transfer limitation on decreased yield in enzymatic hydrolysis of lignocellulose at high solid concen-
сбраживания, или отвода продуктов из системы и смещения равновесия реакции вправо.
ВЫВОДЫ
При ферментативном гидролизе продукта щелочной делигнификации плодовых оболочек овса показано, что увеличение концентрации субстрата от 45 до 200 г/л приводит к увеличению конечной концентрации РВ с 42 до 106 г/л, при этом выход РВ снижается с 83 до 48%.
Установлено, что проведение гидролиза с подпиткой ферментных препаратов или субстрата через 8 или 16 ч при концентрации субстрата 200 г/л позволяет увеличить выход РВ на 10-12%.
КИЙ СПИСОК
trations // Bioresource Technology. 2017. N 229. Р. 88-95.
5. Denisova M.N., Makarova E.I., Pavlov I.N., Budaeva V.V., Sakovich G.V. Enzymatic hydrolysis of hydrotropic pulp at different substrate concentrations // Applied Biochemistry and Biotechnology. 2016. V. 178, N 6. Р. 1196-1206.
6. Gao Y., Xu J., Yuan Z., Zhang Y., Liu Y., Liang C. Optimization of fed-batch enzymatic hydrolysis from alkali-pretreated sugarcane bagasse for high-concentration sugar production // Bioresource Technology. 2014. N 167. Р. 41-45.
7. Gusakov A.V., Kondratyeva E.G., Sinitsyn A.P. Comparison of two methods for assaying reducing sugars in the determination of carbohy-drase activities // International Journal of Analytical Chemistry. 2011. V. 2011. P. 1-4.
1. Gupta R., Kumar S., Gomes J., Kuhad R.C. Kinetic study of batch and fed-batch enzymatic saccharification of pretreated substrate and subsequent fermentation to ethanol. Biotechnology for Biofuels. 2012, no. 5:16, pp.1-10.
2. Fan Z., South C., Lyford K., Munsie J., Walsum P., Lynd L.R. Conversion of paper sludge to ethanol in a semicontinuous solids-fed reactor. Bioprocess and Biosystems Engineering. 2003, no. 26, pp. 93-101.
3. Jorgensen H., Vibe-Pedersen J., Larsen J., Felby C. Liquefaction of lignocellulose at high-solids concentrations. Biotechnology and Bioengineering. 2007, no. 96, pp. 862-870.
4. Du J., Cao Y., Liu G., Zhao J., Li X., Qu Y. Identifying and overcoming the effect of mass transfer limitation on decreased yield in enzymatic hydrolysis of lignocellulose at high solid concen-
Критерии авторства
Макарова Е.И., Будаева В.В. выполнили экс-
trations. Bioresource Technology. 2017, no. 229, pp. 88-95.
5. Denisova M.N., Makarova E.I., Pavlov I.N., Budaeva V.V., Sakovich G.V. Enzymatic hydrolysis of hydrotropic pulp at different substrate concentrations. Applied Biochemistry and Biotechnology. 2016, vol. 178, no. 6, pp. 1196-1206.
6. Gao Y., Xu J., Yuan Z., Zhang Y., Liu Y., Liang C. Optimization of fed-batch enzymatic hydrolysis from alkali-pretreated sugarcane bagasse for high-concentration sugar production. Bioresource Technology. 2014, no. 167, pp. 41-45.
7. Gusakov A.V., Kondratyeva E.G., Sinitsyn A.P. Comparison of two methods for assaying reducing sugars in the determination of carbohy-drase activities. International Journal of Analytical Chemistry. 2011, vol. 2011, pp. 1-4.
Contribution
Makarova E.I., Budaeva V.V. carried out the
периментальную работу, на основании полученных результатов провели обобщение и написали рукопись. Макарова Е.И., Будаева В.В. имеют на статью равные авторские права и несут равную ответственность за плагиат.
Конфликт интересов
Авторы заявляют об отсутствии конфликта интересов.
СВЕДЕНИЯ ОБ АВТОРАХ Принадлежность к организации
Екатерина И. Макарова
Институт проблем химико-энергетических
технологий СО РАН
К.т.н., н.с. лаборатории биоконверсии
Вера В. Будаева
Институт проблем химико-энергетических технологий СО РАН
К.х.н., доцент, заведующая лабораторией
биоконверсии
Поступила 22.06.2017
experimental work, on the basis of the results summarized the material and wrote the manuscript. Makarova E.I., Budaeva V.V. have equal author's rights and bear equal responsibility for plagiarism.
Conflict of interests
The authors declare no conflict of interests regarding the publication of this article.
AUTHORS' INDEX Affiliations
Ekaterina I. Makarova
Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
Ph.D. (Engineering), Research Scientist Laboratory of Bioconversion [email protected]
Vera V. Budaeva
Institute for Problems of Chemical and Energetic Technologies, Siberian Branch of the Russian Academy of Sciences
Ph.D. (Chemistry), Associate Professor, Head of Laboratory of Bioconversion [email protected]
Received 22.06.2017
