CC BY
45
hydrocarbon-oxidizing microorganism in variant with 7 % diesel oil has formed 2,1-2,5-1011 cell/ml, with 10 % - 2,0-2,3-10" cell/ml, on variant with 12 % - 2,0-1011 cell/ml. The determination of the spectrum utilized hydrocarbon (the diesel oil, fuel oil, vacuum gazol, hexane, phenols, toluene) microorganism-destructor checked the method of the remarks. The majority consortium well developed in whitness of all hydrocarbon, except phenols. As a result of studies is chosen 15 consortiums microorganism-destructor, capable to utilize the hydrocarbons in concentration from 5 before 12 %. Cultivation the most efficient consortium B, chosen from cheronozem soil, brought about change the colour of the ambience Voroshilovoy-Dianovoy and shaping clot biomasses of the beige colour by thickness 5 mm. Given consortium consists of three culture, each of which capable to utilize the diesel oil in concentrations before 10 %. Falling into his composition culture-destructors are identified and depositing in Departmental collection useful microorganism agricultural purpose to Russian academy of the agricultural sciences (RCAM): Pseudomonas stutzeri R-1026 under registration number RCAM02107; Achromobacter insolitus A-102 (RCAM02108); Achromobacter xylosoxidans A-10 (RCAM02109). Keywords: hydrocarbon-oxidizing microorganisms, hydrocarbons, recultivation, oil-contaminated soil
УДК 502.662.2+631.472.74:502.7
оценка эффективности аборигенных сообществ
микроорганизмов-деструкторов углеводородов на типичном черноземе республики татарстан
И.А. ДЕГТЯРЕВА, доктор биологических наук, зав. лабораторией
А.Х. ЯППАРОВ, доктор сельскохозяйственных наук, директор
И.А. ЯППАРОВ, кандидат сельскохозяйственных наук, зав. отделом
А.Я. ХИДИЯТУЛЛИНА, научный сотрудник Татарский научно-исследовательский институт агрохимии и почвоведения Российской академии сельскохозяйственных наук Е-таН: [email protected]
Резюме. Из почв Республики Татарстан выделены активные консорциумы микроорганизмов-деструкторов углеводородов А и Б. В условиях вегетационного опыта определена их эффективность на типичном черноземе с яровой пшеницей сорта Экада-66. В вариантах консорциум Б, минеральное удобрение + консорциум Б и яровая пшеница + консорциум Б количество углеводородокисляющих микроорганизмов (УОМ) превышало контроль в 1,4-5,0 раза на протяжении всего эксперимента. При внесении только консорциума А численность УОМ увеличивалась до 60 сут. (в 1,1 раза выше контроля), после чего наблюдалась стабилизация их численности. В вариантах с высоким количеством УОМ отмечено наибольшее снижение углеводородов к 90 сут: при внесении консорциума Б на 59,0%, при выращивании пшеницы и внесении консорциума Б - на 61,4%, в то время как в варианте с сообществом А величина этого показателя составила 44,5%, растение + консорциум А - 58,3%. Наиболее эффективное снижение углеводородов отмечено при совместном использовании консорциума Б с минеральным удобрением - 73,1%. Численность гетеротрофных микроорганизмов до 30 сут. эксперимента в большинстве опытных вариантов была ниже контрольных значений (в 2,1-9,8 раза). В конце эксперимента количество гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов стало практически одинаковым. В загрязненной почве численность микромицетов была в 1,8-8,5 раз ниже, чем в контрольной. Респираторная активность во всех опытных вариантах возрастала, по сравнению с контрольной почвой, в 2,3-6,8 раз, а при использовании исследуемых консорциумов практически сразу увеличилась вдвое. Внесение минерального удобрения как отдельно, так и с консорциумами микроорганизмов способствовало росту базального дыхания в 1,8-6,6 раза. В целом процесс деградации дизельного топлива в почве протекал более эффективно в вариантах с консорциумом Б.
Ключевые слова: углеводороды, почва, загрязнение, угле-водородокисляющие микроорганизмы, ассоциации, рекультивация, типичный чернозем, минеральные удобрения
Биовосстановление нефтезагрязненных почв основано на стимуляции природных процессов деградации, интенсифицировать которые можно двумя основными способами: внесением промышленных биопрепаратов на основе специальных микроорганизмов-деструкторов и использованием активной аборигенной углеводородокисляющей микрофлоры.
Для применения любого биопрепарата, имеющего в своем составе активные формы микроорганизмов, требуется создание и строгое выполнение оригинальной технологии,которую необходимо корректировать в каждой почвенно-климатической зоне. При этом наиболее эффективными считают биопрепараты на основе природных углеводородокисляющих микроорганизмов, включающих различные таксономические и физиологические группы [1].
Интродуцируемые микроорганизмы-деструкторы должны обладать такими свойствами, как высокая метаболическая активность и скорость потребления углеводородов нефти, конкурентная способность по отношению к аборигенной микробиоте и способность к длительному выживанию в изменяющихся условиях окружающей среды [2, 3].
Цель наших исследований - оценка эффективности аборигенных сообществ микроорганизмов-деструкторов углеводородов на типичном черноземе Республики Татарстан.
Условия, материалы и методы. Вегетационный опыт по определению эффективности выделенных сообществ микроорганизмов-деструкторов углеводородов проводили на типичном черноземе при выращивании яровой пшеницы сорта Экада-66 в теплице с естественным освещением в летний период в сосудах на 6 кг. Почву загрязняли дизельным топливом в концентрации 5%. На основании результатов ранее проведенных экспериментов [4] в опыте использовали выделенные активные сообщества микроорганизмов- 33
деструкторов А и Б, способные активно расти в присутствии нефтепродуктов в количестве до 12% от массы почвы и утилизировать различные алифатические и ароматические углеводороды. Титр углеводородоокис-ляющих микроорганизмов (УОМ) - 2,5-1012 кл./мл.
Схема опыта предусматривала следующие варианты: контроль (незагрязненная почва); почва + 5% дизельного топлива (ДТ); почва + ДТ + мочевина; почва + ДТ + растения; почва + ДТ + сообщество А; почва + ДТ + сообщество Б; почва + ДТ + мочевина + сообщество А; почва + ДТ + мочевина + сообщество Б; почва + ДТ + растения + сообщество А; почва + ДТ + растения + сообщество Б.
В ходе эксперимента, который длился 90 сут., осуществляли полив деминерализованной водой, поддерживая влажность почвы на уровне 60% предельной полевой влагоемкости. После прореживания в каждом сосуде оставляли по 15 растений.
Пробы почв отбирали в динамике на 10, 21, 30, 45, 60, 90 сут. Отобранные образцы измельчали, просеивали через 2...3 мм сито и хранили при естественной влажности в холодильнике (10°С) до использования в исследованиях.
Численность различных ризосферных микроорганизмов определяли согласно общепринятым методикам [5, 6] на элективных питательных средах: углеводородокисляющих микроорганизмов - на среде Ворошиловой-Диановой; гетеротрофных бактерий - на мясо-пептонном агаре, микромицетов - на агаризо-ванной среде Чапека. Численность микроорганизмов выражали в количестве колониеобразующих единиц (КОЕ) на 1 г почвы после ее высушивания при температуре 105°С [7]. Респираторную активность почвенного микробного сообщества оценивали путем титрометри-ческого определения количества СО2, выделившегося после поглощения щелочью [8].
Концентрацию углеводородов в почвенных образцах измеряли в соответствии с ПНД Ф 16.1:2.2.22-98 [9]. Для исключения искажения результатов анализов (вследствие экстракции из грунтов всех имеющехся органических веществ) проводили анализ контрольной (холостой) пробы из того же грунта без загрязнения.
Все параметры измеряли не менее чем в трехкратной повторности, а статистическую обработку результатов осуществляли с помощью электронных таблиц Excel и программы Origin 4.1. Достоверность различий полученных результатов оценивали с использованием критерия Стьюдента.
результаты и обсуждение. Численность углево-дородокисляющих микроорганизмов в начале эксперимента составляла 0,9.10,0 млн/г почвы. В течение 45 сут. экспозиции в опытных вариантах без внесения изучаемых сообществ существенных изменений величины этого показателя не отмечено, что, вероятно, обусловлено высокой токсичностью созданной среды. Активный рост микроорганизмов наблюдали только после 45 сут.
Во всех вариантах с добавлением сообщества Б численность УОМ на протяжении всего опыта была выше, чем в контроле, в 1,45,0 раза. На 60 сут. количество УОМ во всех опытных вариантах (с добавлением
исследуемых сообществ и минерального удобрения) увеличивалось на один-два порядка, а затем наступала стабилизация их численности. Максимальное в эксперименте количество этих микроорганизмов отмечено в вариантах с сообществом Б (150 млн/г, или в 2,6 раза больше контроля) и сообществом А совместно с минеральным удобрением (120 млн/г, или в 2,1 раза больше контроля).
Изменение численности УОМ может свидетельствовать и о значительном ускорении процесса биодеградации ДТ в почве. В вариантах с высоким их количеством отмечено наибольшее снижение содержания углеводородов к 90 сут. Так, при внесении сообщества Б величина этого показателя уменьшилась на 59,0%, в варианте с сочетанием такого приема и посева растений - на 61,4%, а в случае использования сообщества А - на 44,5 и 58,3% соответственно (см. табл.).
Наибольшее снижение концентрации углеводородов отмечено при совместном использовании сообщества Б с минеральным удобрением - на 73,1%, в то время как при внесении только мочевины она уменьшилась на 54,3%.
При сравнении двух сообществ наибольшую деструкцию углеводородов демонстрировал консорциум Б.
Численность гетеротрофных микроорганизмов, которая служит одним из диагностических показателей биологической активности почвы, до 30 сут. эксперимента в основном была ниже контрольных значений (в 2,1-9,8 раза). Исключение составил вариант с сообществом Б, где она оказалась выше в 2,1 раза. В дальнейшем отмечено увеличение численности гетеротрофов, что, по-видимому, связано со снижением содержания углеводородов в почве, которое происходило в результате испарения легких фракций и деструкции микроорганизмами. Например, в вариантах с растениями в этот период (30.45 сут.) оно уменьшилось на 39,5.42,6%, а в случае добавления к яровой пшенице сообщества Б - на 45,7.56,4%. Одновременно численность гетеротрофов увеличилась, по сравнению с контролем, в
2.2 и 8,0 раза соответственно. Необходимо отметить, что в варианте с сообществом А минеральное удобрение на 30 сут. стимулировало повышение численности гетеротрофов в
5.3 раза, а растения способствовали росту величины этого показателя при внесении сообщества Б в 4,5 раза.
Необходимо отметить, что в конце эксперимента численность гетеротрофных и углеводородокисляющих микроорганизмов стала практически одинаковой.
Микромицеты представляют собой группу микроорганизмов, универсальных по своему значению для формирования плодородия почвы [10]. В нашем опыте во всех вариантах были обнаружены представители родов Trichoderma, Penicillum, Aspergillus, Rhizopus, Fusarium. В исходной почве количество почвенных
Таблица. Динамика снижения содержания углеводородов в черноземной почве, % к исходному загрязнению
Вариант Сутки
10 30 1 45 | 60 90
Почва + ДТ (5%) 6,4 15,2 23,6 26,2 28,1
Почва + ДТ (5%) + мочевина 15,2 42,1 47,9 50,7 54,3
Почва + ДТ (5%) + яровая пшеница 14,3 23,6 39,5 42,6 44,3
Почва + ДТ (5%) + сообщество А 12,0 29,3 41,0 43,3 44,5
Почва + ДТ (5%) + сообщество Б 20,0 44,5 50,2 53,8 59,0
Почва + ДТ (5%) + мочевина + сообщество А 18,1 42,1 54,0 55,0 58,3
Почва + ДТ (5%) + мочевина + сообщество Б 24,0 50,0 66,0 70,0 73,1
Почва + ДТ (5%) ь яровая пшеница + сообщество А 15,5 28,3 41,4 45,0 50,5
Почва + ДТ (5%) + яровая пшеница + сообщество Б 16,9 40,7 45,7 56,4 61,4
грибов достигало максимальной в опыте величины через 45 сут., после чего наблюдалась стабилизация. Дизельное топливо оказало токсическое воздействие на микромицеты: в загрязненной почве их численность была в 1,8-8,5 раза ниже, чем в контроле, и оставалась на одном уровне в течение всего эксперимента.
Обращает на себя внимание то, что при использовании минерального удобрения как отдельно, так и с исследуемыми сообществами количество этих микроорганизмов было самым низким (5,0...25,0 тыс./г), а в вариантах с растениями разница с контролем оказалась наименьшей. В случае внесения исследуемых сообществ количество почвенных грибов было ниже, чем в контроле, в 1,8-5,7 раза.
Параметры почвенного дыхания позволяют судить об интенсивности микробиологической деятельности. Уровень респираторной активности характеризует способность микробного сообщества минерализовать органическое вещество в почве и часто используется для характеристики его деградации при биоремедиации [11].
Респираторная активность во всех опытных вариантах была выше, чем в контрольной почве, в 2,3-6,8 раза, а при внесении исследуемых сообществ - практически сразу увеличилась вдвое. При этом консорциум Б оказался более эффективен, чем сообщество А, в 1,3-1,5 раза.
Применение минерального удобрения как отдельно, так и вместе с изучаемыми сообществами способство-
вало росту базального дыхания в 1,8-6,6 раза. Посев яровой пшеницы не оказал влияния на величину этого показателя, что, на наш взгляд, связано с конкуренцией макро- и микроорганизмов за источники питания.
Рост базального дыхания в начале эксперимента, вероятно, обусловлен повышением численности микроорганизмов. Последующее же снижение его интенсивности может быть связано с уменьшением концентрации углеводородов, которые служат энергетическим субстратом для почвенной микрофлоры.
Выводы. Анализ динамики численности изученных микроорганизмов и содержания углеводородов свидетельствует об ускорении процесса деградации дизельного топлива в почве и снижении его токсического действия на микробиоту при внесении изучаемых ассоциаций УОМ. При этом наилучший суммарный эффект оказывает сообщество Б , при использовании которого отмечали не только максимальную в опыте численность УОМ и респираторную активность, но и наибольшее снижение количества углеводородов к концу эксперимента.
Полученные результаты свидетельствуют, что важную роль в детоксикации поллютантов играет ризосфера растений, в которой активно развиваются микроорганизмы. Под воздействием небольших концентраций дизельного топлива происходит стимуляция жизнедеятельности ризосферных микроорганизмов в результате процессы деградации поллютанта протекают более интенсивно.
Литература.
1. Куликова И.Ю. Углеводородокисляющая активность штамма Phyllobacterium myrsinacearum // Исследовано в России: электрон. науч. журн. 2006. С. 1673-1681. URL: http://zhurnal.ape.relam.ru/articles/2006/179.pdf.
2. Плешакова Е.В., Голубев С.Н., Турковская О.В. Биодеградация нефтяных углеводородов штаммом Dietzia maris, ее генетические особенности//Известия Саратовского ун-та. 2007. Т.7. вып.1. С. 54-57.
3. Sharma S.L., Pant A. Biodegradation and conversion of alkanes and crude oil by a marine Rhodococcus sp. // Biodegradation. 2000. Vol.1. P. 289-294.
4. Дегтярева И.А., Хидиятуллина А.Я. Оценка влияния природных ассоциаций углеводородокисляющих микроорганизмов на состояние нефтезагрязненной почвы// Ученые записки Казанского ун-та. Т. 153. кн. 3. С. 137-143.
5. Колешко О.И. Экология микроорганизмов почвы: лабораторный практикум. Минск: Высшая школа, 1981. 175 с.
6. Методы почвенной микробиологии и биохимии/под ред. Д.Г. Звягинцева. М.: Изд-во Моск. ун-та, 1991. 304 с.
7. Зенова Г.М., Степанов А.Л., Лихачева Н.А. Практикум по микробиологии почв. М.: Изд-во Моск. ун-та, 2002. 120 с.
8. Microbiological methods for assessing soil quality/ed. By J. Dloem, D.W. Hopkins, A. Benedetti. CABI Publishing, 2006. 307p.
9. Методика выполнения измерений массовой доли нефтепродуктов в почвах и донных отложения методом ИК-спектрометрии. ПНД Ф 16.1:2.2.22-98. М., 1998. 35 с.
10. Киреева Н.А., Маркарова М.Ю., Щемелинина Т. Н. и др. Ферментативная и микробиологическая активность загрязненных нефтью глееподзолистых почв на разных стадиях их восстановления // Вестник Башкирского университета. 2006. Т.11. №4. С. 55-58.
11. Maila M.P., Cloete Т.Е. The use of biological activities to monitor the removal of fuel contaminants — perspective for monitoring hydrocarbon contamination: a review// Int. Biodeterior. Biodegrad. 2005. V. 55. P. 1-8.
ASSESSMENT OF THE EFFECTiVENESS OF THE NATiVE COMMUNiTiES OF MiCROORGANiSMS-DESTRUCTORS OF HYDROCARBONS ON TYPiCAL CHERNOZEM OF THE REPUBLiC
OF TATARSTAN I.A. Degtereva, A.H. Yapparov, I.A. Yapparov, A.Ya. Hidiyatullina
Tatar Research institute of Soil Science and Agricultural Chemistry of the Russian Academy of Agricultural Sciences
Summary. From different soils of Tatarstan highlighted active consortia of microorganisms-destructors hydrocarbons A and B. In the context of the growing experience determined their effectiveness on typical chernozem with spring wheat varieties Ekada-66 . In cases ( a consortium of B, fertilizer + consortium B and spring wheat + consortium B) number of hydrocarbon-oxidizing microorganisms (HOM) exceeded the control in 1,4-5,0 times throughout the experiment . When making only consortium HOM a number increased to 60 days (1.1-fold above control), after which their strength was observed stabilization . In embodiments of the high number of HOM had the highest reduction of hydrocarbons to 90 days: when making consortium B by 59.0% , wheat farming and making consortium B - by 61.4%, while the community and these figures were 44,5% , and in the embodiment a plant + consortium A - 58.3 %>. The most effective reduction of hydrocarbons observed when sharing consortium used with mineral fertilizers - by 73.1%. Number of heterotrophic microorganisms to 30 days. Most experiments on experimental variants was lower than the control values ( 2,1-9,8 times) . At the end of the experiment the number of heterotrophic microorganisms and hydrocarbon was substantially the same. In the contaminated soil was of microscopic fungi in 1,8-8,5 times lower than in the control. Respiratory activity in all experimental variants increased in 2,3-6,8 times in comparison with the control soil, and the use of consortia studied almost immediately doubled . Adding fertilizer both separately and consortia contributed to the growth of the basal respiration in 1,8-6,6 times. Thus, when making a consortium B degradation of diesel fuel in the soil to flow efficiently..
Keywords: hydrocarbons, soil, pollution, hydrocarbon-oxidizing microorganisms, associations, recultivation, typical black soil, fertilizers.
