CC BY
82
УДК 612.014.464:616.15.001.6
ОЦЕНКА ЭФФЕКТА РАЗЛИЧНЫХ ДОЗ ОЗОНА НА ПРОЦЕССЫ ЛИПОПЕРОКСИДАЦИИ И КИСЛОРОДООБЕСПЕЧЕНИЕ КРОВИ IN VITRO
С.П. Перетягин1-3, К.Н. Конторшикова2, А.А. Мартусевич1,
'ФГБУ «Нижегородский научно-исследовательский институт травматологии и ортопедии»,
2ГБОУ ВПО «Нижегородская государственная медицинская академия», 3 Ассоциация Российских озонотерапевтов
Перетягин Сергей Петрович - e-mail: psp-aro@mail.ru
Цель работы - уточнить наличие дозозависимого действия озона на физико-химические параметры крови in vitro. Гепаринизированную кровь собак (п-22) озонировали (концентрация
озона 10, 20, 50, 100 и 200 мкг/л) в течение 5-7 минут при скорости потока 1 л/мин. Контролировали ряд показателей до воздействия, сразу по его завершении и через 90 минут после него. Оценивали активность перекисного окисления липидов по накоплению диеновых коныюгатов,
содержанию малонового диальдегида и оснований Шиффа. Парциальное давление кислорода в крови определяли на анализаторе ABL 77. Уровень связанного и растворенного в крови
кислорода, общее его содержание рассчитывали по общепринятым формулам. Результаты экспериментов свидетельствуют о наличии дозозависимого действия озона на показатели гомеостаза крови. Так, низкие концентрации озона (10 и 20 мкг/л) не вызывают сдвига липопероксидации. На более высоких дозах (с концентрации 50 мкг/л) интенсивность образования конечных продуктов ПОЛ существенно и стабильно нарастает. Установлено, что дозозависимость эффекта озона характерна не только для процессов липопероксидации, но и для степени оксигенации крови.
Ключевые слова: озон, липопероксидация, оксигенация крови, дозозависимость.
The aim of this work is investigation of ozone dose-dependent action on some physical and chemical blood parameters in vitro. We ozonized heparin-contained blood of 22 mongrels (ozone concentration 10, 20, 50, 100 and 200 mcg/l; barbotage time - 5-7 min; air flow speed - 1 l/min). Number of blood homeostasis parameters was controlled before, after the ozonation and at 90 min after it. We tested lipoperoxy-daton activity by level of dien conjugetes, malone aldehyde and Schiff bases. Oxygen partial pressure in the blood was estimated with gas analyzer ABL-77. Bounded and soluble oxygen level and its total volume were calculated with known formulas. Results of our experiments indicate the presence of ozone dose-dependent action on blood homeostasis parameters. Low ozone doses (10 and 20 mcg/l) do not cause to the changes of lipoperoxydation processes. Higher ozone doses (from 50 mcg/l) lead to clear and stabilized activation of lipoperoxydation terminal products formation. It is stated, that ozone dose-dependent effect realized in blood oxygenation level too.
Key words: ozone, lipoperoxydation, blood oxygenation, dose-dependent effect.
Введение
Широкое применение технологий озонотерапии в клинической практике обуславливает необходимость раскрытия механизмов взаимодействия озона с органическими субстратами крови [1-4]. Модельные эксперименты in vitro позволяют выявить основные точки приложения эффектов озона в диапазоне различных доз как на молекулярноклеточном уровне, так и в цельной крови [5-9], а также сопоставить первичные изменения с аналогичным воздействием на уровне целостного организма [2, 3]. Кроме того, подобный методический подход предполагает возможность сравнения механизмов действия озона с другими известными методами лечения (ультрафиолетовое облучение, гипер-барическая оксигенация) [5, 10].
Цель исследования: уточнить наличие дозозависимого действия озона на физико-химические параметры крови in vitro.
Материалы и методы
Эксперименты проводили с гепаринизированной кровью интактных животных (22 собаки). В экспериментах кровь объемом 50 мл озонировали в течение 5-7 минут при скорости потока 1 л/мин. (озонатор «Медозонс БМ-03»). Использовали озоно-кислородную смесь с концентрацией озона 10, 20, 50, 100 и 200 мкг/л.
Содержание животных, экспериментальные вмешательства осуществляли согласно приказу Минздрава СССР № 775 от 12.08.1977 г. «О мерах по дальнейшему совершенствованию организационных форм работы с использованием экспериментальных животных» [11].
Оценивали активность перекисного окисления липидов (ПОЛ) по накоплению диеновых конъюгатов (ДК), которые определяли по характерному УФ-спектру поглощения при длине волны 233 нм [12, 13]; содержанию вторичных продуктов - малонового диальдегида (МДА) (ТБК-активные продукты), который выявляется в реакции с 2-тиобарбитуровой кислотой, образуя окрашенный триметиновый комплекс с максимумом поглощения при длине волны 532 нм) [14, 15]; по уровню оснований Шиффа (ОШ), которые определяли по их флуоресценции [9].
Парциальное давление кислорода в крови определяли на анализаторе ABL 77. Величины связанного и растворенного в крови кислорода, общее его содержание рассчитывали по общепринятым формулам [10].
Полученные данные были обработаны с помощью программ Statistica 6.0 и Microsoft Excel с использованием методов одномерной статистики. Достоверность различий средних определяли по t-критерию Стьюдента. Различия считали достоверными при уровне значимости p<0,05.
Результаты и их обсуждение
Для изучения влияния различных концентраций озона на уровень ПОЛ крови при ее обработке озоно-кислородной смесью было исследовано содержание молекулярных продуктов липопероксидации до воздействия озоном, после 5-минутной обработки крови озоном и через 90 минут после воздействия. Результаты исследования представлены на рисунках 1-3.
Выявлено, что при обработке крови озоном в концентрации 10 мкг/л уровень ДК достоверно снижался на 34% (р<0,05), однако через 90 мин. их содержание возвращалось к исходному уровню (рис. 1). Индекс ОШ/ДК сразу после воздействия на биосреду увеличивался в 1,7 раза. Этот кратковременный подъем ОШ/ДК был обусловлен, по-видимому, быстрым (в течение процедуры барботажа) окислением ДК, присутствовавших в биосреде на момент воздействия, а не озон-индуцированным усилением ПОЛ. Следовательно, малые концентрации озона не приводят к значимому смещению уровня ПОЛ.
120
“ 100
«
10 мкг/л 20 мкг/л 5 0 мкг/л 100 мкг/л 200 мкг/л
РИС. 1.
Концентрация диеновых конъюгатов в крови при различных режимах озонирования (в %; за 100% принят уровень показателя в крови до озонирования).
1S0
10 мкг/л 20 мкг/л 50 мкг/л ЮОмкгАтт 200 мкг/л
РИС. 2.
Уровень оснований Шиффа в крови при различных режимах озонирования (в %; за 100% принят уровень показателя в крови до озонирования).
Увеличение концентрации озона до 20 и 50 мкг/л сопровождалось однотипной динамикой содержания продуктов ПОЛ. Так, количество ДК через 5 мин. снижалось на 46% и 37% соответственно (р<0,05) с сохраняющейся тенденцией к уменьшению через 90 мин. (рис. 1). Подобное изменение концентрации ДК прослеживалось и при концентрациях озона 100 и 200 мкг/л. Через 90 минут после воздействия наблюдали значимое увеличение уровня ОШ в 1,3-1,4 раза (р<0,05) (рис. 2). Как следствие этого, отношение ОШ/ДК также возрастало, через 90 мин. превышая исходный уро-
вень в 1,4-1,5 раза (р<0,05). По нашему мнению, выявленные изменения связаны, с одной стороны, с непосредственным окислением ДК озоном, с другой - с более медленным образованием вторичных продуктов озонолиза. Последнее обстоятельство связано с формированием гидроперекисей, отличающихся от аутогенных короткоцепочечностью и гидрофильностью, в результате чего они способны быстро проникать в мембрану, формируя с аминогруппами белков и фосфолипидов флуоресцирующие основания [6].
Обработка крови более высокими концентрациями озона (100-200 мкг/л) при сохранении тенденции изменений ПОЛ со стороны ДК и ОШ (снижение концентрации ДК менее выражено (р>0,05), содержание ОШ через 90 мин. нарастало (р<0,05); отношение ОШ/ДК было выше исходного) отличалась более значимым увеличением содержания ТБК-активных продуктов. Так, непосредственно после барботажа крови озоном в концентрациях 100 и 200 мкг/л регистрировали увеличение их уровня в 1,4 и 1,6 раза, а через 90 мин. - в 1,6 и 1,7 раза соответственно (р<0,05). Наблюдаемая динамика содержания карбонильных соединений (ТБК-активные продукты), являющихся одним из важнейших показателей активации процессов ПОЛ для сложных систем, подтверждает участие озона в инициации липопероксидации (рис. 3). В соответствии с полученными данными, достаточно выраженная активация процесса (по вторичным продуктам) обнаруживается, начиная с концентраций 100 мкг/л и выше.
Ї□ через 5 мин ■ через 90 мин
10 мкг/л 20 мкг/л 50 мкг/л 100 мкг/л 200 мкг/л
рис. з.
Содержание ТБК-активных продуктов в крови при различных режимах озонирования (в %; за 100% принят уровень показателя в крови до озонирования).
Исследования уровня МДА (по его реакции с ТБК) показали, что при концентрации озона 100 мкг/л и выше в системе накапливаются вторичные продукты ПОЛ. По данным литературы [16], статистически значимое увеличение содержания ТБК-активных продуктов, наблюдаемое при дозах озона 100 мкг/л, можно объяснить появлением дополнительных субстратов окислительного повреждения мембран и содержимого «старых» эритроцитов с выходом в плазму субстратов для окисления, сопровождающимся активацией процессов за счет повторных атак активными формами кислорода, в частности озоном. Этот факт подтверждается тем, что в реакцию с ТБК, кроме МДА, вступают многие соединения (ароматические альдегиды, аминокислоты, карбогидраты), в то время как МДА вступает в реакции с аминокислотами, пептидами, гликогеном и другими низко- и высокомолекулярными клеточными метаболитами, содержащими сульфги-дридные и аминогруппы [5, 7, 14, 17].
Характерным для инициации липопероксидации с участием озона является существенное уменьшение концентрации первичных молекулярных продуктов - ДК, которые, по нашему мнению, окисляются озоном в местах двойных связей, что приводит к остановке естественного хода каскада реакций ПОЛ (рис. 1).
Установлено, что обработка крови озоно-кислородной смесью с различными концентрациями озона сопровождалась существенным увеличением уровня содержания кислорода (рис. 4). В контрольных пробах (после обработки кислородом) был отмечен значительный прирост рО2 по сравнению с интактной кровью (в 3,2 раза, р<0,05). В отличие от оксигенации, озонирование крови способствовало более выраженному увеличению уровня напряжения кислорода (рО2).
В диапазоне исследуемых концентраций выявлена разная степень растворимости озона (рис. 5), при этом прирост растворенного кислорода в плазме крови составил от 38 до 62% по сравнению с оксигенированной кровью. Причем, если для связанного кислорода лимитирующим фактором было содержание гемоглобина, который достигал предельной степени насыщения кислородом уже в контрольных пробах, то для уровня рО2 определяющим была величина действующей концентрации озона. Следует отметить, что концентрацию озона 100 мкг/л также можно считать предельной для дальнейшего увеличения степени растворимости озона в
плазме, т. к. большая концентрация озона (200 мкг/л) при контакте с кровью не способствовала дальнейшему росту концентрации растворенного O2 в крови.
Известна хорошая растворимость озона в водных средах и органических растворителях [17, 18], что обеспечило в наших экспериментах возможность создания значительных концентраций кислородосодержащих соединений в плазме крови. Это позволяет распространить закон Генри для растворимости различных газов в крови применительно к озону. Наблюдаемое явление - способность «вымывания» углекислого газа из крови с одновременным сдвигом рН в щелочную сторону - повышает сродство гемоглобина к кислороду, при этом кривая диссоциации гемоглобина сдвигается влево. Высокая степень оксигенации гемоглобина приводит к вытеснению H2CO3 из гидрокарбоната в эритроцитах [19], его разложению до СО2 и H2O и выведению в плазму, где в присутствии значительных концентраций кислорода СО2 «вымывается» во время обработки крови газовой смесью.
Сдвигу реакции крови в щелочную сторону способствует также взаимодействие озона с другой, не менее важной буферной системой - белковой, которая обеспечивает 42% вклада в буферную емкость крови [20].
Заключение
Результаты проведенных экспериментов свидетельствуют о наличии дозозависимого действия озона на показатели гомеостаза крови. Установлено, что минимальные концентрации озона (10 и 20 мкг/л) не вызывают сдвига липопероксидации относительно исходного равновесного состояния. На более высоких дозах озона (начиная с концентрации 50 мкг/л) интенсивность образования конечных продуктов ПОЛ (ОШ) существенно и стабильно нарастает (на 30% и выше), сохраняясь на повышенных значениях и через 90 минут после воздействия газовой смесью.
Обработка образцов крови высокими концентрациями озона (100 и 200 мкг/л) стимулирует скорость его взаимодействия с гидроксил-ионом ОН-. Этот процесс может явиться одним из молекулярных механизмов реализации эффектов данных концентраций озона, способствующих нарушениями протекания физиологической липопероксидации, связанным с обрывом естественных цепей ПОЛ в биологических системах. Несмотря на то, что указанная особенность взаимодействия озона с липидами характерна для всего диапазона исследуемых доз озона, способствующих снижению содержания первичных продуктов ПОЛ в биосреде, но значимая выраженность указанного процесса специфична для концентрации озона 100 и 200 мкг/л.
Дозозависимость эффекта озона выявлена не только для процессов липопероксидации, но и для степени оксигенации крови. Так, на фоне действия озона был отмечен достоверно более высокий уровень парциального давления кислорода и содержания растворенного кислорода в плазме крови. При этом в условиях in vitro кислородная емкость крови при воздействии озона зависит от его физикохимических констант [18], а также определяется более высокой скоростью разложения озона в присутствии органических субстратов [17]. Возникающие при этом активные формы кислорода (синглетный, атомарный кислород и др. [9, 21-23]) обуславливают высокое парциальное давление кислорода в крови [3, 17, 18].
РИС. 4.
Парциальное давление кислорода в крови при различных видах озонирования.
РИС. 5.
Концентрация растворенного и связанного кислорода в крови при различных видах озонирования.
ЛИТЕРАТУРА
1. Бояринов Г.А., Соколов В.В. Озонированное искусственное кровообращение. Н.Новгород: Покровка, 1999. 336 с.
2.Конторщикова К.Н. Биохимические основы эффективности озонотера-пии. В кн.: Озон в биологии и медицине. Тез. докл. II Всерос. науч.-практ. конф. с междунар. участием. Нижний Новгород. 1995. С. 8.
3.Перетягин С.П. Патофизиологическое обоснование озонотерапии постге-моррагического периода: автореферат диссертации на соискание ученой степени доктора медицинских наук. Казань. 1991. 29 с.
4. Перетягин С.П., Стручков А.А., Мартусевич А.К. и др. Применение озона как средства детоксикации в раннем периоде ожоговой болезни. Скорая медицинская помощь 2011. № 12 (3). С. 39-43.
5.Казимирко В.К. с соавт. Свободнорадикальное окисление и антиоксидантная терапия. К.: Морион, 2004. 160 с.
6.Калер Г.В., Мельникова Л.Н., Матус К.К., Конев С.В. Взаимодействие озона с мембранами эритроцитов. Биологические мембраны. 1989. № 6 (11). С. 1164- 1169.
7. Костюк В.А., Потапович А.И. Биорадикалы и биоантиоксиданты. Минск: БГУ, 2004. 174 с.
8. Новицкий В.В., Рязанцева Н.В., Степовая Е.А. Физиология и патофизиология эритроцита. Томск: Изд-во Том. ун-та, 2004. 202 с.
9.Fletcher B.L., Dillard C.L., Tappel A.L. Fluorescent products of lipid peroxidation of mitohondria and microsomes. Analyt. Biochem. 1973. № 52 (1). P. 1-9.
10. Бураковский В.И., Бокерия Л.А. Гипербарическая оксигенация в сердечно-сосудистой хирургии. М. 1974. 336 с.
11. Перетягин С.П., Мартусевич А.К., Гришина А.А. и др. Лабораторные животные в экспериментальной медицине. Нижний Новгород: ФГУ «ННИИТО» МЗСР РФ, 2011. 300 с.
12. Гаврилов В.В. Мишкорудная М.И. Спектрофотометрическое определение содержания гидроперекисей липидов в плазме крови. Лабораторное дело. 1983. № 3. С. 33-36.
13. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Свободнорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. М.: РНПКПК МЗ РФ, 2001. 78 с.
14. Арутюнян А.В., Дубинина Е.Е., Зыбина Н.Н. Методы оценки свободнорадикального окисления и антиоксидантной системы организма. С.-Пб.: ИКФ «Фолиант», 2000. 104 с.
15. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах. М.: Наука, 1972. 252 с.
16. Биленко М.В. Ишемические и реперфузионные повреждения органов. М.: Медицина, 1989. 368 с.
17. Галстян Г.А., Тюпало Н.Ф., Разумовский С.Д. Озон и его реакции с ароматическими соединениями в жидкой фазе. Луганск: СТИ, 2004. С. 20.
18. Александров Ю.А., Тарукин В.И., Переплетников M.JI. Растворимость озона в жидкостях. Журнал химической физики. 1983. № 57 (10). С. 2315.
19. Лосев Н.И., Войнов В.А. Физико-химический гомеостаз организма. Гомеостаз. М.: Медицина, 1981. С. 186.
20. Мусил Я., Новикова О., Кунц К. Современная биохимия в схемах. М.: Мир, 1984. 216 с.
21. Buddi R. et al. Evidence of oxidative stress in human corneal diseases. J. Histochem. Cytochem. 2002. № 50 (3). P. 341-351.
22. Krasnovsky A.A., Jr. Singlet Molecular Oxygen in Photobiochemical Systems: IR Phosphorescence Studies. Membr. Cell Biol. 1998. № 12 (5). P. 665-690.
23. Schweitzer C., Schmidt R. Physical Mechanisms of Generation and Deactivation of Singlet Oxygen. Chem. Reviews. 2003. № 103 (5). P. 1685-1757.
