CC BY
46
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ
«НАУКА. ИННОВАЦИИ. ТЕХНОЛОГИИ», №1, 2016
удк 577.161.22 / Бондарь Т.П. [Bondar Т.Р.], 616-092.9 Светлицкий К.С. [Svetlitskiy K.S.],
Светлицкая Ю.С. [Svetlitskaia J.S.], Асеева O.A. [Aseeva O.A.]
ОЦЕНКА БИОХИМИЧЕСКИХ ПОКАЗАТЕЛЕЙ ПОТОМСТВА САМОК КРЫС, В РАЗЛИЧНЫЕ ВОЗРАСТНЫЕ ПЕРИОДЫ, ПОЛУЧАВШИХ ВЫСОКОБЕЛКОВЫЙ, ОБОГАЩЕННЫЙ КАЛЬЦИЕМ И ВИТАМИНОМ D, МОЛОЧНЫЙ ПРОДУКТ
Evalution of biochemical parameters of offspring of female rats at different ages receiving high-protein, fortified with calcium and vitamin D, dairy product
В настоящее время, значимость витамина D для организма человека определяется не только способностью регулировать фосфорно-кальциевый метаболизм, процессы остеогенеза и созревание скелета, но и влиянием на иммунную систему и психомоторное развитие. Целью исследования явилось изучение влияния высокобелкового молочного продукта, обогащенного кальцием и витамином D в разных дозах, на минеральный обмен у лабораторных животных в детском и подростковом возрасте. Проведено биохимическое исследование 72 крыс линии Вистар, в разные периоды постнатального онтогенеза. Минеральный обмен оценивался по содержанию кальцидиола (25(OH)D3), кальция (Ca), неорганического фосфора (Р), кальций-фосфорного соотношения (Са/Р), общего белка (ОБ) и активности щелочной фосфатазы (ЩФ) в сыворотке крови. Установлено, что у крыс, не получавших молочный продукт, имеет место недостаточность витамина D. Показана необходимость выбора оптимальной дозы для целенаправленной профилактики гиповитаминоза D. Показано, что у крыс, получавших молочный продукт, обогащенный кальцием, белком и терапевтической дозой витамина D, метаболические нарушения сопровождались выраженным и затяжным биохимическим синдромом, что не наблюдается в других группах.
Ключевые слова: витамин D, 25(OH)D3, кальций, фосфор, щелочная фосфатаза, общий белок, крысы 1-го, 2-го и 3-его месяца жизни.
Currently, the importance of vitamin D for human body is determined not only by ability to regulate calcium and phosphorus metabolism, processes of osteogenesis and maturation of the skeleton, but also affects the immune system and psychomotor development. The aim of the study was to investigate the effect of high-protein milk product, fortified with calcium and vitamin D in different doses of mineral metabolism in laboratory animals in childhood and adolescence. A biochemical study of 72 Wistar rats in different periods of postnatal ontogenesis. Mineral metabolism was evaluated by content calcidiol, calcium, inorganic phosphorus, calcium-phosphorus ratio, total protein and activity of alkaline phosphatase in serum. It was found that rats
riot treated milk product is insufficient vitamin D. the necessity of selecting the optimal dose for targeted prevention of hypovitaminosis D. It was shown that rats treated with a milk product enriched with calcium, protein and a therapeutic dose of vitamin D, metabolic disorders was accompanied by a pronounced and prolonged biochemical syndrome, which is not observed in the other groups.
Key words: vitamin D, 25(OH)D3, calcium, phosphorus, alkaline phosphatase, total protein, rats of the 1st, 2nd and 3rd month of life.
В настоящее время проблема дефицита витамина D приобретает особое значение, поскольку, по данным Захаровой И.Н. и соавт., гиповитаминоз D имеется почти у 1/2 населения мира [2]. Доказано, что низкий уровень витамина D в сыворотке крови, развивающийся в результате недостаточного потребления витамина D с продуктами питания и/или недостатка солнечного ультрафиолетового излучения, связан с повышенным риском инвапидизации населения из-за развития тяжелых хронических заболеваний [1,2]. Именно поэтому растет интерес к количественной оценке и пониманию механизмов обмена витамина D в организме человека [6].
Большинство экспертов в настоящее время сходятся во мнении, что о дефиците витамина D можно говорить при его концентрации 25(OH)D3 в сыворотке крови менее 20 нг/мл, о недостаточном его содержании - при содержании метаболита в пределах 21-29 нг/мл, а избыточной считается концентрация витамина D в крови выше 150-200 нг/мл [8].
Производство продуктов питания, обогащенных витамином D, началось с 1930-х гг., после чего в США и Европе витамином D стали форти-фицировать многие продукты питания и пищевые добавки [2]. В результате мировых научных исследований по оценке обеспеченности организма витамином D («статуса» витамина D) среди различных возрастных групп населения, обращает на себя внимание широкая распространённость низкой обеспеченности витамином D среди детей и подростков [5]. Дети и подростки подвержены высокому риску формирования низкого стату са витамина D из-за высоких темпов минерализации костной ткани в периоды бурного роста, полового созревания, а также по причине сниженного синтеза витамина D в зимний период года и недостаточного поступления
его с продуктами питания. По мнению большинства исследователей, наиболее информативным показателем для оценки обеспеченности организма витамином Б является определение содержания кальцидиола - 25(ОН) О в сыворотке крови [4].
По данным крупнейших исследований, проведенных в Испании, Финляндии, Франции и Турции, у 80 % детей и подростков была выявлена недостаточность витамина Б. В Англии 11-16 % подростков имели уровень 25(ОН)Б3 менее 10 нг/мл и 40 % - менее 20 нг/мл в течение всего года. В зимнее время процент дефицита витамина Б удваивался. В исследовании ОРТ1Р(ЖО. проведенном в феврале-марте с участием девочек-подростков из четырех европейских стран, расположенных между 51° и 60° северных широт, показана высокая распространенность дефицита витамина Б (менее 10 нг/мл) в диапазоне от 26 % до 51 % и недостаточность витамина Б (менее 19 нг/мл) у 90 % обследованных [1]. Аналогичные данные были получены в исследованиях, проведенных в США, Италии, Объединенных Арабских Эмиратах, Тасмании, Новой Зеландии, Ливане и во многих других странах [7]. На юге РФ, в Ставропольском крае, находящемся на 45 параллели северной широты, у подавляющего большинства новорожденных также выявлено недостаточное содержание витамина Б, причем тяжелый дефицит был выявлен более, чем у 50 % детей, и лишь у 1,7 % детей, выявлен оптимальный уровень витамина Б [3].
Отсутствие единого представления об оптимальных методах профилактики и лечения витамин О-зависимых заболеваний, а также дозах, способах и формах введения витамина Б у детей и подростков, делает наше исследование актуальным.
Целью исследования
явилось изучение влияния высокобелкового молочного продукта, обогащенного кальцием и витамином Б в разных дозах, на минеральный обмен у лабораторных животных в детском и подростковом возрасте.
Материалы и методы.
Исследование выполнялось на крысах линии Вистар, возрастом 1, 2 и 3 месяца. По данным Гелашвили О.О., 1 месяц жизни крысы равен 3-4 годам жизни человека, 2 месяца - 7-8 годам и 3 месяца 12-13 годам соответственно. По мнению многих авторов, именно эти возрастные периоды относятся к критическим периодам постнатального онтогенеза. Было обследовано 72 крысы. Все животные содержались в стационарных условиях вивария, при естественном световом режиме и стандартном рационе питания. На 3-4 сутки после спаривания и установления беременности самок крыс случайным образом распределяли на 3 группы, в зависимости от добавок к стандартному рациону. Первая группа - беременные, не получавшие молочный продукт крысы. Вторая группа - беременные, получавшие молочный продукт, содержащий профилактическую дозу витамина Б (75 МЕ). Третья группа - беременные, получавшие молочный продукт, содержащий терапевтическую дозу витамина Б (750 МЕ). Расчет проводили с учетом массы тела животного (НоПск и соавт, 2011). Потомство отлучали от кормившей их самки в возрасте один месяц. После отлучения животных на протяжении двух месяцев содержали на стандартном рационе с использованием добавок в зависимости от группы. Количество животных в первой группе составило 19, во второй 36 и в третьей 17 животных соответственно. Расчет дозы витамина Б для каждого животного из потомства, проводился индивидуально с учетом массы тела каждого конкретного животного и принадлежности его к той или иной группе. Исследования проводились через 1, 2 и 3 месяца после рождения.
При проведении лабораторного эксперимента мы полностью соблюдали международные принципы Европейской конвенции о защите позвоночных животных, используемые для экспериментальных и других научных целей (Страсбург, 1985); декларации о гуманном отношении к животным, используемым в научных целях, изложенные в современных рекомендациях Европейских независимых комитетов по вопросам этики (Брюссель, 1995,1997); Рекомендации Комитетом по этике, проводящим экспертизу биомедицинских исследований (Женева, 2000); а также «При-
нципам надлежащей лабораторной практики» и приказом Министерства здравоохранения и социального развития РФ от 23 августа 2010 г. № 708н г. Москва «Об утверждении Правил лабораторной практики».
Для проведения эксперимента использовали молоко с повышенным содержанием белка, кальция и обогащенное премиксом витамина D (фирма DSM, тип 100 CWS), вносимого в количестве 0,01 г на 1 кг продукта. Сухой витамин D3b концентрации 100000 МЕ/г, стабилизирован токоферолом; микрокапсулы диспергируемые в холодной воде. Так же, молоко содержит 5,5 % белка, от 200 мг на 100 г кальция, 2,5 % жира и энергетическая ценность его, составляет 43,7 ккал/183 кДж.
Для изучения состояния минерального обмена у лабораторных животных, проводили биохимическое исследование на автоматическом биохимическом анализаторе Cobas cl 11 (Швейцария). В нашей работе оценивали активность щелочной фосфатазы, концентрацию общего белка, кальция, фосфора в сыворотке крови, с последующим расчетом кальций-фосфорного соотношения. Уровень витамина D в крови определяли на иммунохемилюминесцентном анализаторе Liaison XL (Италия).
Статистическую обработку данных проводили с использованием методов параметрического анализа и пакета Microsoft Excel. Достоверность различных средних определялся по критерию Стьюдента (t), для коэффициента вариации, уровень р выбран не менее 0,05.
Результаты и обсуждение.
Для оценки метаболических изменений в сыворотке крови в группах лабораторных животных, выделенных в зависимости от суточного потребления витамина D, содержащегося в высокобелковом молочном продукте, провели статистическую обработку полученных данных, в результате были установлены некоторые закономерности.
Особую группу риска по развитию дефицита витамина D представляют дети и подростки из-за относительно больших потребностей в витамине, вызванных высокими темпами роста и минерализации скелета. Известно, что наиболее точным и специфическим показателем
обеспеченности организма витамином D является уровень в крови его основной циркулирующей (транспортной) формы 25(OH)D3. Уровень 25(OH)D3b сыворотке ниже 20 нг/мл (дефицит) был выявлен во всех возрастных периодах у крыс, рожденных от матерей, не получавших молочный продукт. Оптимальный уровень витамина D (более 30 нг/мл) определен у животных, рожденных от матерей, получавших молочный продукт, обогащенный белком, кальцием и профилактической дозой витамина D.
После прекращения грудного вскармливания и перехода на самостоятельное питание (на 2 и 3 месяце жизни) уровень витамина D в сыворотке крови снизился, но остался в пределах нормы. А после использования молочного продукта, обогащенного кальцием, белком и терапевтической дозой витамина D, установлена токсическая концентрация витамина D в сыворотке крови (более 150 нг/мл).
Биохимическое исследование крови лабораторных животных проводили через 1, 2 и 3 месяца после рождения. Для проведения наглядного сравнения полученных данных, результаты биохимического исследования сыворотки крови у животных первой группы были приняты за 100 %, рассчитали относительное содержание аналогичных показателей во второй и третьей группе крыс. Данные биохимических показателей крыс в возрасте 1 месяц представлены на рисунке 1.
При сравнении данных показателей животных первой группы с животными второй и третьей группы установлены статистически значимые различия. У животных третьей группы наблюдались признаки рахита, такие как: выраженная гипокальциемия (0,31 ± 0,02 нг/мл, р < 0,001), гипофосфатемия (0,44 ± 0,02 нг/мл, р < 0,001), увеличение активности щелочной фосфатазы (470 ± 3,4 ЕД/л, р < 0,001). У крыс второй группы также наблюдалось снижение уровня Са до 0,04 + 0,01 нг/мл и Р до 0,03 ± 0,001 нг/мл. У наблюдаемого контингента происходило напряжение системы экстренной регуляции минерального гомеостаза, которое осуществлялось в ущерб костной ткани, за счет усиленной резорбции костей и развития рахита.
Рис.1. Сравнительная характеристика биохимических показате-
лей у крыс в возрасте 1 месяц, в зависимости от питания.
Примечание: * - достоверность различия в группах (р < 0,05).
На рисунке 2 представлены данные биохимических показателей крыс в возрасте 2 месяца. В двухмесячном возрасте у всех животных отмечалось повышение уровня Са и Р. Однако у крыс, получавших высокобелковый, обогащенный кальцием и профилактической дозой витамина Б молочный продукт, сохраняется гипофосфатемия (0,45±0,002 нг/мл) с увеличением активности ЩФ (366,6+1,4 ЕД/л), а все остальные показатели находятся в пределах нормы. А у животных третьей группы по-прежнему остается высоким уровень ЩФ (380,7±1,5 ЕД/л).
%
Са*
Рис. 2. Сравнительная характеристика биохимических показате-
лей у крыс в возрасте 2 месяца, в зависимости от питания.
Примечание: * — достоверность различия в группах (р < 0,05).
%
Са*
Рис. 3.
Примечание: *-
Сравнительная характеристика биохимических показателей у крыс в возрасте 3 месяца, в зависимости от питания.
достоверность различия в группах (р < 0,05).
На рисунке 3 представлены данные биохимических показателей крыс в возрасте 3 месяца.
К третьему месяцу жизни у крыс с проявлениями рахита, получавших обогащенный белком, кальцием и терапевтической дозой витамина О молочный продукт, отмечалось резкое снижение уровня фосфора в крови, а активность ЩФ сохранялась на высоком уровне. У трехмесячных крыс третьей группы средняя концентрация неорганического фосфора составила 0,09 ± 0,05 нг/мл, что в среднем на 0,96 ммоль/л ниже средних значений первой группы животных (р < 0,001). А активность ЩФ составила 338,3 ± 2,0 ЕД/л, что примерно в 2 раза выше показателей первой и второй групп животных, что может указывать на прогрессирование рахита.
Заключение.
При исследовании биохимических показателей минерального обмена было отмечено, что у крыс, получавших молочный продукт, обогащенный кальцием, белком и терапевтической дозой витамина Б, рахит сопровождался выраженным и затяжным биохимическим синдромом.
На первом месяце жизни гипофосфатемия и гипокальциемия отмечалась у второй и третьей группы животных. Однако высокая активность щелочной фосфатазы превалировала в третьей группе, что подтверждало активность и остроту протекающего рахитического процесса в данный период.
У двухмесячных животных во всех группах наблюдалась тенденция к повышению уровня кальция, фосфора и активности щелочной фосфатазы, за исключением третьей группы животных, у которых этот показатель снизился.
Однако на третьем месяце после рождения у крыс, получавших высокобелковый, обогащенный кальцием и терапевтической дозой витамина Б молочный продукт, отмечалась умеренная гипокальциемия, а также выраженная гипофосфатемия с повышенной активностью щелочной фосфатазы, что указывает на выраженные и затяжные нарушения фосфорно-кальциевого обмена.
БИБЛИОГРАФИЧЕСКИЙ
список
1. Захарова, И.Н. Недостаточность и дефицит витамина D: что нового?/И.Н. Захарова, Ю.А. Дмитриева, С.В. Яблочкова, [и др.]// Вопросы современной педиатрии. - 2014. - № 1. - С. 134-140.
2. Захарова, И.Н. Известные и неизвестные эффекты витамина D / И.Н. Захарова, Ю.А. Дмитриева, С.В. Яблочкова // Вопросы современной педиатрии. - 2013. - Т. 12, № 2. - С. 20-25.
3. Климов, Л.Я. Обеспеченность витамином D новорожденных детей Ставропольского края / Л.Я. Климов, С.В. Долбня, В.А. Курьянинова, [и др.] // Медицинский вестник Северного Кавказа. - 2015. - Т. 10, № 2. - С. 159-163.
4. Holick, M.F. Vitamin D status: measurement, interpretation, and clinical application / M.F. Holick//Ann. Epidemiol. -2009. - Vol. 19, № 2. - P. 73-78.
5. Holick, M.F. Evaluation, treatment, and prevention of vitamin D deficiency: an Endocrine Society clinical practice guideline / M.F. Holick, N.C. Binkley, H.A. Bischoff-Ferrari, [et al.] // J. Clin. Endocrinol. Metab.-2011.-Vol. 96, № 7. - P. 1911-1930.
6. Holick, M.F. Vitamin D deficiency: A worldwide problem with health consequences / M.F. Holick, T.C. Chen // Am. J. Clin. Nutr. - 2008. -Vol. 87. - P. 1080-1086.
7. Muhairi, S.J.. Vitamin D deficiency among healthy adolescents in A! Ain, United Arab Emirates / S.J. Muhairi, A.E. Mehairi, A.A. Khouri, [et al.] // BMC Public Health. - 2013. - Vol. 13.-P. 13-33.
8. Vieth, R.F. The urgent need to recommend an intake of vitamin D that is effective / R.F. Vieth, H.A. Bischoff-Ferrari, B.J. Boucher, [et al.] //Am. J Clin. Nutr. - 2007. - Vol. 85. - P. 649-650.
