CC BY
13УДК 577.12-022.53:539.211:615.2
Irina V. Shugalei, Anastasia S. Borovikova, Alexander P. Voznyakovskii, Mikhail A. Ilyushin
ESTIMATION OF DETONATION NANODIAMONDS ANTIOXIDANT PROPERTIES IN VARIOUS TEST-SYSTEMS
St Petersburg State Institute of Technology (Technical University), Moskovsky Pr., 26, St Petersburg, 190013, Russia Lebedev Research Institute for synthetic rubber, 1 Gapsalskaya str. St. Petersburg, 198035, Russia e-mail: shugalei@mail.ru
Nanodiamons of detonation synthesis (DND) were shown to exhibit antioxidant activity both in vitro and in vivo. DND being introduced into laboratory animals per os lower protein peroxidation in red cells, inhibit peroxidation of lipids and proteins in serum. DND also protect laboratory animals from oxidative stress induced with the help of NaNO2. The results of the testing form the experimental basis to recommend DND as potential antioxidant for correcting oxidative damage of different origin.
Key words: nanodiamonds of detonation synthesis, oxidative damage, antioxidant, prooxidant, peroxy damage of lip-ids, peroxy damage of proteins
И.В. Шугалей1, А.С. Боровикова2, А.П. Возняковский3, М.А. Илюшин4
ОЦЕНКА
АНТИОКСИДАНЬНЫХ СВОЙСТВ
ДЕТОНАЦИОННЫХ НАНОАЛМАЗОВ В РАЗЛИЧНЫХ ТЕСТ-СИСТЕМАХ
Санкт-Петербургский государственный технологический институт (технический университет), Московский пр. 26, Санкт-Петербург, 190013, Россия
Научно-исследовательский институт синтетического каучука им. акад. С.В. Лебедева», Гапсальская 1, Санкт-Петербург, 198035, Россия e-mail: shugalei@mail.ru
Показано, что детонационные наноалмазы (ДНА) проявляют антиоксидантную активность in vitro и in vivo. При перо-ральном введении лабораторным животным ДНА снижают уровень перекисного окисления белков в эритроцитах, инги-бируют липопероксидацию и перекисное окисление белков в плазме. В случае введения животным прооксиданта - NaNO2 -ДНА эффективно защищают животных от химически индуцированного окислительного стресса. Результаты тестирования позволяют рекомендовать ДНА в качестве потенциальных антиоксидантов для коррекции оксидативных повреждений.
Ключевые слова: детонационные наноалмазы, оксида-тивное повреждение, антиоксидант, прооксидант, пере-кисное окисление липидов, перекисное окисление белков
DOI 10.15217Zissn1998984-9.2016.33.46
Вопросы оксидативного стресса являются ключевыми в развитии многих тяжелых заболеваний: рака, токсикозов, в том числе вызванных неблагоприятной экологической обстановкой, многих инфекционных заболеваний, сопровождают течение травматических состояний, сахарного диабета, сердечно-сосудистых заболеваний и других патологических состояний [1-5]. Коррекция оксидативных повреждений осуществляется с использованием антиоксидантов и поиск таких препаратов активно осуществляется в течение последних трех десятилетий [6]. В качестве антиоксидантов используются как природные так и синтетические соединения. В последнее время пристальное внимание уделяется углеродным наноматериалам как потенциальным антиоксидантам [7-9]. Развитие исследований по оценке антиоксидантных свойств углеродных наноматериалов осуществляется в рамках новых научных дисциплин, таких как бионанотехнология, наномедицина, нанохимия, нанобиология. Особый
интерес среди углеродных материалов, обладающих разнообразными биологическими свойствами, вызывают наноалмазы детонационного синтеза (ДНА), так как они высоко гидрофильны и малотоксичны [7, 10]. Для данных материалов разработаны способы целенаправленной модификации поверхности, что позволяет прогнозировать изменение их химических и биологических свойств [7, 10, 11]. До настоящего времени систематических исследований антиоксидантных свойств наноалмазов детонационного синтеза не проводилось.
Для того чтобы грамотно оценить антиоксидантную активность ДНА, нужно провести тестирование данного материала на различных уровнях, таких как молекулярный, клеточный и организменный.
Оценка антиоксидантной активности ДНА на молекулярном уровне
Для оценки антиоксидантной активности на молекулярном уровне в качестве объекта исследования использовали фосфолипиды яичного желтка, которые представлены в основном лецитином ^Н)
1 Шугалей Ирина Владимировна, д-р хим. наук, профессор, каф. микробиологического синтеза СПбГТИ(ТУ), e-mail: shugalei@mail.ru Irina V. Shugaly, Dr Sci. (Chem.), Professor, Department of Technologyof Microbiological Synthesis SPSIT(TU)
2 Боровикова Анастасия Сергеевна, магистрант каф. технологии микробиологического синтеза, СПбГТИ (ТУ) Anastasia S. Borovikova, undergraduate student, Department of Technologyof Microbiological Synthesis SPSIT(TU)
3 Возняковский Александр Петрович, д-р хим. наук; зав. сектором. НИИСК им. Акад С.В. Лебедева, e-mail: voznap@mail.ru Alexander P. Voznyakovskii, Dr. Sci. (Chem.), Head of lab. Lebedev Research Institute for synthetic rubber
4 Илюшин Михаил Алексеевич, ж-р хим наук, профессор, каф. химии и технологии органических соединений азота, e-mail: explaser1945@yandex.ru Mikhail A. Ilyushin, Dr. Sci. (Chem.), Professor, Departmentof chemistry and technology of organic compounds of nitrogen SPSIT(TU)
Дата поступления - 19 января 2016 года
и структурно организованы в форме липосом (рисунок).
Рисунок. Строение липосомы
Хорошо известно, что липиды активно окисляются под действием активных форм кислорода (АФК) [12-14]. Для того, чтобы оценить антиоксидант-ную активность наноалмазов, в суспензии липосом инициировалось перекисное окисление липидов (ПОЛ) под воздействием реактива Фентона (смеси растворимой соли двухвалентного железа и перекиси водорода):
¥е+2 + Н202 = ОН + ОН~ + Fe
+з
Образующийся гидроксидный радикал является наиболее активной АФК и атакует молекулу лецитина, инициируя цепной процесс ПОЛ, схема которого представлена ниже [12].
Цепная реакция перекисного окисления липидов
Если ДНА, либо другой потенциальный антиоксидант, проявляют антиоксидантную активность, то при воздействии потенциального антиоксиданта в системе скорость ПОЛ снижается. Для того, чтобы оценить изменение скорости, необходимо визуализировать процесс. Для этого мы использовали регистрацию свечения в присутствии фотосенсибилизатора -люминола (Ш2) [15].
Схема перекисного окисления липидов в присутствии люминола
Чем больше в системе генерируется АФК, тем интенсивнее свечение, то есть тем интенсивнее протекает перекисное окисление. Если в систему добавить потенциальный антиоксидант, то скорость ПОЛ снижается и свечение становится менее интенсивным. Результаты исследований представлены в таблицах 1, 2 и 3.
Таблица 1. Влияние концентрации ДНА на интенсивность хемилюминесценции в суспензии липосом, обработанной реактивом Фентона (фосфатный буфер; рН = 7,0; [FeSO4] = 5,7-10-6 моль/л;
[Н2О2] = 2,110-5 моль/л, [1Н2] = 110-7 моль/л)
Концентрация ДНА, % мас. Пиковая интенсивность хемилюминесценции
В отсутствие Дна В присутствии ДНА Гашение хемилюминесценции, %
0,0013 180±10 210±20 0
0,0026 230±30 0
0,0065 240±20 0
0,0091 170±10 8
0,013 142±2 21
0,0156 141±3 22
0,0195 107±5 45
Таблица 2. Влияние концентрации сульфата железа (II) на интенсивность хемилюминесценции обработанной реактивом Фентона (фосфатный буфер; рН = 7,0; [Н2О2] = 7.310-5 моль/л, [ДНА]
= 0,0159 % мас.; [Ш2] = 110-7 моль/л)
105, моль/л Пиковая интенсивность хемилюминесценции
В отсутстие ДНА В присутствии ДНА Гашение хемилюминесценции, %
55 236±9 209±9 15
27 249±7 160±6 33
14 188±3 134±4 27
11 157±4 125±5 27
5,5 109±2 80±2 18
2,7 83±2 76±1 16
Таблица 3. Влияние рН на интенсивность хемилюминесценции обработанной реактивом Фентона (¡FeSO4] = 5,710-6; [НгОг] = 2,310-5 моль/л; ¡ДНА] = 0,0127 % мас.; [Ш2] = 110-7 моль/л)
Пиковая интенсивность хемилюминесценции
рН В отсутстие ДНА В присутствии ДНА Гашение хемилюминесценции, %
5,9 200±20 220±10 0
6,4 410±20 520±50 0
6,9 810±50 550±40 40
7,0 460±40 290±20 38
7,5 690±40 620±20 14
8,0 710±50 530±30 25
8,5 1900±200 1500±100 22
Анализ данных таблиц 1-3 показывает, что ДНА проявляют антиоксидантный эффект при значениях рН близких к физиологическим значениям при их содержании более 0.01 мас. % в реакционной среде, содержащей фосфолипиды. Таким образом, за счет торможения перекисного окисления липидов ДНА должны проявлять эффект стабилизирующий клеточную мембрану, так как процессы ПОЛ являются ведущими в процессе ее разрушения.
Оценка антиоксидантной активности ДНА на клеточном уровне
В качестве тест-объекта для оценки антиоксидантных свойств ДНА использовались эритроциты. Результаты, полученные в ходе исследований с использованием суспензии липосом, получили логичное продолжение в исследованиях с использованием эритроцитов, так как липидная составляющая мембраны эритроцита представлена фосфолипидами, которые подвергаются процессу перекисного окисления. Оценка антиоксидантного действия проводилась по интенсивности гемолиза эритроцитов. Снижение интенсивности гемолиза при введении антиоксиданта в суспензию эритроцитов, в том числе и суспензии ДНА, свидетельствует о стабилизации эритроцитарной мембраны и снижении интенсивности ПОЛ, то есть подтверждает антиоксидантные свойства введенного в суспензию клеток препарата. Интенсивность гемолиза оценивали по количеству гемоглобина, вышедшего из эритроцитов при разрушении клеточной мембраны. На первом этапе оценивали влияние ДНА на эритроциты в отсутствие окисляющих агентов.
Влияние ДНА на гемолиз эритроцитов мы проводили с использованием двух фракций потенциального антиоксиданта, различающихся размером используемых частиц.
Первая фракция содержала ДНА размером от 4 до 20 нм. Результаты испытаний данной фракции представлены в таблице 4.
Таблица 4. Влияние мелкоразмерной фракции ДНА на гемолиз эритроцитов
Концентрация ДНА, мкг/мл 0 0,1 1 10 50 100 1000
Оптическая плотность раствора D (Л = 560 нм) 0,150 0,130 0,114 0,175 0,160 0,190 0,205
Вторая фракция содержала ДНА размером от 40 до 100 нм. Результаты испытаний крупноразмерной фракции представлены в таблице 5.
Таблица 5. Влияние крупноразмерной фракции ДНА на гемолиз эритроцитов.
Концентрация ДНА, мкг/мл 0 0,1 1 10 50 100 1000
Оптическая плотность раствора D (Л = 560 нм) 0,150 0,104 0,110 0,090 0,100 0,095 0,117
Видно, что в зависимости от концентрации, наноалмазы могут проявлять как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства в суспензии нативных эритроцитов. В данной серии экспериментов (таблицы 4, 5) наблюдается торможение спонтанного гемолиза эритроцитов при определенных условиях.
Представляло интерес проанализировать возможность снижения интенсивности гемолиза эритроцитов, вызванного воздействием агента, целенаправленно генерирующего АФК и инициирующего ПОЛ в эритроцитарной мембране. В качестве такого агента использовали реактив Фентона, традиционно применяемый для инициирования процессов ПОЛ. В случае антиоксидантного эффекта, проявляемого ДНА, при их введении в систему, содержащую реактив Фентона и эритроциты, интенсивность гемолиза эритроцитов должна снижаться. В данной серии экспериментов нами использовалась мелкоразмерная фракция ДНА, так как наблюдаемый эффект снижения интенсивности гемолиза при очень высоких концентрациях ДНА (таблица 5) трудно трактовать однозначно.
Возможно, при высоких концентрациях наноалмазов крупноразмерной фракции эффект разрушения эритроцитарной мембраны снижается не за счет прямой антиоксидантной активности, а за счет сорбции вторичных АФК на частицах ДНА, что приводит к дополнительному обрыву цепей в процессе ПОЛ.
Нами исследовалось влияние ДНА на интенсивность гемолиза эритроцитов под действием реактива Фентона в условиях переменной концентрации одного из его компонентов - сульфата железа (II)-и постоянной концентрации перекиси водорода, составляющей 1,140-5 моль/л. ДНА вводили в систему в концентрации, которая обеспечивала максимальное подавление гемолиза в отсутствие прооксидантов -1 мкг/мл (таблица 4).
Полученные результаты по подавлению гемолиза эритроцитов в присутствии реактива Фентона под действием ДНА представлены в таблице 6.
Таблица 6. Влияние концентрации сульфата железа (II) при постоянной концентрации пероксида водорода в системе Фентона на процесс гемолиза эритроцитов (физиологический раствор; [Н2О2] = 1,1105 моль/л; [ДНА] = 1 мкг/мл)
([FeS04]105, Оптическая плотность раствора, D (Л = 560 нм)
моль/л В отсутствие ДНА В присутствии ДНА
35 0,370 0,400
27 0,210 0,200
14 0,165 0,110
11 0,150 0,100
5,5 0,100 0,070
2,7 0,009 0,045
Анализ данных таблицы 6 показывает, что, действительно, ДНА снижают интенсивность гемолиза эритроцитов, вызванного воздействием реактива Фентона, то есть проявляют защитное антиоксидантное действие. Однако достоверный эффект наблюдается при малых концентрациях феррокатиона (менее 1,4-10-4 моль/л).
Оценка антиоксидантной активности ДНА на организменном уровне
Для подтверждения реальности использования ДНА в качестве антиоксиданта необходимо подтвердить их антиоксидантное действие в опытах in vivo. Это позволит оценить антиоксидантную активность на организмен-ном уровне.
Аэробное существование предполагает активную генерацию АФК в ходе процессов жизнедеятельности. В здоровом организме поддерживается сравнительно невысокий стационарный уровень АФК. Различные виды стресса нарушают равновесие между продукцией и утилизацией АФК [18-20]. Механизмы таких нарушений достаточно сложны, однако выход генерации АФК из-под контроля (резкое повышение концентрации) требует коррекции специальными препаратами - антиоксиданта-ми [21, 22]. Успешность такой коррекции под действием препарата свидетельствует об антиоксидантной активности тестируемого вещества. Такое тестирование и было проведено для суспензии ДНА. Предпосылками для проведения тестирования in vivo послужили результаты первичного тестирования с использованием суспензии липосом и эритроцитов, которые показали перспективность использования ДНА в качестве антиоксидантных препаратов.
Наиболее достоверно оценить антиоксидантные свойства in vivo можно по изменениям уровня перекисного окисления липидов (ПОЛ) и перекисного окисления белков (ПОБ) при введении исследуемого препарата лабораторным животным [23, 24]. При этом антиоксидантную активность можно оценивать по влиянию на процессы ПОЛ и ПОБ как у интактных животных, так и у животных, получающих препарат, стимулирующий пероксидацию (прооксидант).
На начальном этапе нами проводилось исследование влияние ДНА на процессы ПОЛ и ПОБ на животных, не получающих прооксиданты. Для оценки эффекта лабораторные животные подвергались воздействию ДНА, которые животные получали перорально в течение 7 дней в виде водной суспензии (0,05 %) вместо питьевой воды. По окончанию данного срока животные (белые мыши) подвергались декапитации. У животных забирали кровь и определяли уровень ПОЛ и ПОБ в плазме крови и эритроцитах (таблицы 7, 8). Затем провели сравнение результатов с животными, не получающими препарат (интактными).
Таблица 7. Влияние ДНА на процессы ПОЛ и ПОБ в эритроцитах лабораторных животных (опыт in vivo)
ПОЛ ПОБ
Группа животных МДА*, нано-моль % к контролю ДНФгидра-зон*, мкмоль % к контролю
Интактные животные 5,2±0,3 - 0,07±0,01 -
Животные, получавшие ДНА 14,8±0,5 285 0,39±0,007 56
Концентрацию МДА определяли
спектрофотометрическим методом.
Уровень ПОБ оценивался по накоплению карбонильных фрагментов, образующихся в результате деструкции полипептидной цепи в соответствии со схемой [8, 25].
Количество образовавшихся карбонильных фрагментов определяли в виде соответствующих 2,4-динитрофенилгидразонов. Концентрацию МДА также определяли спектрофотометрическим методом. Результаты представлены в таблице 8
Таблица 8. Влияние ДНА на процессы ПОЛ и ПОБ в плазме крови лабораторных животных (опыт in vivo).
Примечание: *- расчеты велись на 1 г гемоглобина
Уровень ПОЛ оценивался по конечному продукту пероксидации - малоновому диальдегиду (МДА), образование которого происходит в результате липопероксидации в соответствии со схемой [12, 14].
Группа животных ПОЛ ПОБ
МДА*, нано-моль % к кон- ДНФгидра-зон*, мкмоль % к кон-
тролю тролю
Интактные животные 3,28±0,07 - 0,21±0,04 -
Животные, получающие ДНА 2,03±0,05 62 0,055±0,007 26
Схема образования малонового диальдегида в результате липопероксидации
Примечание: *- расчеты велись на 1 мл плазмы
Как видно из данных таблиц 7 и 8, действие ДНА как антиоксиданта неоднозначно. ДНА проявляет выраженный ингибирующий эффект по отношению к ПОБ в эритроцитах, а также по отношению к ПОЛ и ПОБ в плазме крови. Однако ПОЛ в эритроцитах существенно активизируется под действием ДНА. Возможно, стимулирующий эффект связан с гемолизом эритроцитов под
действием ДНА, который имеет место в определенном концентрационном диапазоне в случае использования мелкоразмерной фракции, которая и использовалась в качестве добавки в питьевую воду, потреблявшуюся опытной группой лабораторных животных.
В процессе гемолиза имеет место выход гемоглобина в среду, что затем приводит к реализации железо-зависимого ПОЛ.
Наиболее приближенным к условиям перспективного применения ДНА как терапевтического антиоксиданта является исследование его ингибирующего действия на ПОЛ и ПОБ in vivo в случае воздействия на лабораторных животных веществ, стимулирующих пероксидацию. В качестве токсического препарата, вызывающего оксидативный стресс, был выбран нитрит натрия, так как хорошо известно, что данный препарат окисляет гемоглобин по цепному механизму через промежуточное образование АФК [25].
В случае in vivo нитрит натрия изменяет уровень АФК и активность антиоксидантных ферментов [26]. Таким образом, в данной серии опытов сравнивался уровень ПОЛ и ПОБ в группах интактных животных и животных, получавших только ДНА либо только нитрит натрия с группой животных, одновременно получавших прооксидантный препарат (нитрит натрия) и тестируемый антиоксидант ДНА. Опытные животные получали внутрибрюшинно нитрит натрия в дозе 20 мг/кг веса в течение 7 дней и 0,05 % суспензию ДНА перорально с питьевой водой в течение того же времени. Результаты эксперимента сведены в таблицу 9.
Таблица 9. Влияние нитрита натрия и ДНА на уровень ПОЛ и ПОБ в эритроцитах лабораторных животных (опыт in vivo)
ПОЛ ПОБ
Группа животных МДА*, на-номоль % к контролю ДНФгидра-зон*, мкмоль % к контролю
Животные, получавшие NaNO2 (в/бр) 10,6±0,7 204 0,13±0,04 186
Животные, получавшие ДНА (перорально) 14,8±0,7 285 0,059±0,05 84
Животные, параллельно получавщие NaNO2 (в/бр) и ДНА (перорально) 7,3±0,4 140 0,09±0,03 129
Интактные животные 5,2±0,3 - 0,07±0,02 -
Примечание: *- расчеты велись на 1 г гемоглобина
Данными, представленными в таблице 9, подтверждается выраженное прооксидантное действие нитрита натрия, которое, однако, существенно отличается по отношению к липидам и белкам. По отношению к липидам прооксидантный эффект существенно выше, чем по отношению к белкам.
Эффект, проявляемый ДНА, соответствует данным, полученным в предшествующих экспериментах in vitro (таблица 7).
Из данных таблицы 9 видно, что ДНА способны гасить прооксидантное действие нитрита натрия. Снижение прооксидантного действия по отношению к липидам составляет 64 %, а по отношению к белкам -57 %.
Хотя введение ДНА снижает прооксидантный эффект токсиканта - нитрита натрия, однако, при этом уровень ПОЛ остается повышенным (на 40 %), по сравнению с интактными животными. Очевидно, это связано с тем, что ДНА проявляют прооксидантный эффект в суспензии эритроцитов (таблица 7).
Полученные значения уровня ПОБ близки к значениям, определенным для интактной группы. Однако, уровень ПОБ остается несколько выше для интактной
группы, чем для группы, получавшей лишь ДНА, что можно объяснить умеренным антиоксидантным эффектом ДНА по отношению к белкам в отсутствии токсиканта.
Антиоксидантный эффект ДНА проявляют не только по отношению к липидам и белкам эритроцитов, но и к липидам и белкам плазмы крови.
Как видно из данных таблицы 10, прооксидантный эффект нитрита натрия ярко выражен и по отношению к компонентам плазмы крови. Введение ДНА лабораторным животным снижает уровень ПОЛ и ПОБ в плазме крови. Однако, торможение пероксидации липидов в плазме является весьма умеренным - 30 %, в отличие от эритроцитов.
Антиоксидантный эффект по отношению к белкам является ярко выраженным. При перораль-ном введении прооксиданта - нитрита натрия и ДНА наблюдается двукратное снижение уровня ПОБ в плазме крови по сравнению с группой животных, получавших только прооксидант - нитрит натрия.
Таблица 10. Влияние нитрита натрия и ДНА на уровень ПОЛ и ПОБ в плазме крови лабораторных животных (опыт in vivo)
Группа животных ПОЛ ПОБ
МДА*, на-номоль % к контролю ДНФгидра-зон*, мкмоль % к контролю
Животные, получавшие NaNO2 (в/бр) 5,15±0,08 157 0,56±0,05 267
Животные, получавшие ДНА (перорально) 2,03±0,06 57 0,055±0,03 26
Животные, получавшие параллельно NaNO2 (в/бр) и ДНА (перорально) 4,13±0,09 126 0,31±0,05 148
Интактные животные 3,28±0,07 - 0,21±0,03 -
Примечание: *- расчеты велись на 1 мл плазмы
Вероятно, это определяется тем, что для нитрита натрия в качестве основной мишени выступают эритроциты [26]. Однако, как показывает последняя серия экспериментов, антиоксидантный эффект ДНА in vivo является неоспоримым, что подтверждает перспективность использования данного препарата для коррекции последствий оксидативного стресса.
Экспериментальная часть
Липосомы для эксперимента готовили из сухого яичного лецитина по модифицированной методике [27]. Для этого 1,0 г лецитина диспергировали в 250 мл дистиллированной воды и подвергали озвучиванию с помощью ультразвукового дезинтегратора ванного типа (Bran-sonic мощностью 50 Вт) в стеклянной ячейке на воздухе. Перед озвучиванием и через каждую минуту озвучивания суспензию охлаждали до 5-8 °С. Суммарное время озвучивания составляло 15 мин.
Исследование перекисного окисления липидов методом хемилюминесценции осуществляли аналогично [15]. В работе использовали хемилюминометр ХЛ-003. При исследовании влияния ДНА на клетку использовали готовую эритроцитарную массу, которую трижды отмывали физиологическим раствором в режиме центрифугирования с охлаждением при 6000 об/мин в течение 15 мин. В дальнейшей работе использовали отмытые эритроциты. Непосредственно для эксперимента в 10 мл физиологического раствора вносили 0,1 мл суспензии эритроцитов, расчетное количество суспензии ДНА и по необходимости компоненты реактива Фентона для получения заданной концентрации. Через 15 мин инкубации рабочую смесь подвергали центрифугированию в режиме 600 об/мин. в течении 15 мин при охлаждении до 5 °С. Надосадочную жидкость
после центрифугирования декантировали и подвергали фотометрированию при 560 нм.
Тестирование in vivo проводили с использованием беспородных белых мышей. в соответствии с правилами гуманного обращения с животными в биологических экспериментах на основании Приказа Минздравсоцразвития России от 23.08.2010 №708н «Об утверждении правил лабораторной практики» и Положения комиссии по биоэтике ФГБУН ИТ ФМБА России. Животные содержались в аттестованном виварии. Клетки с животными были помещены в отдельные комнаты. Световой режим: 12 час - свет, 12 час - темнота. Температура воздуха поддерживалась в пределах 2022 °С, относительная влажность - 50-70 %. Температура и влажность воздуха регистрировались ежедневно. Был установлен режим проветривания, обеспечивающий воздухообмен, соответствующий 15 объемам помещения в час, концентрацию CO2 в воздухе помещения не более 0,15 объемных %, аммиака - не более 0,001 мг/л.
Лабораторные животные опытной группы получали ДНА в виде 0,05 % водной суспензии, которой заменялась питьевая вода в поилках. Контрольная группа обеспечивалась обычной питьевой водой. Указанный режим поступления препарата обеспечивался в течение 7 дней. Затем животных опытной и контрольной групп (по 20 животных в каждой группе) декапитировали, забирали кровь, которую обрабатывали стандартным способом, отделяя плазму от эритроцитов. Уровень малонового диальдегида (МДА) в плазме и эритроцитах определяли как описано в [26]. Уровень перекисного окисления белков (ПОБ) в плазме и эритроцитах определяли, как описано в [28].
Введение нитрита натрия лабораторным животным осуществлялось внутрибрюшинно в виде раствора в бидистиллированной воде объемом 0,1 мл в дозе 20 мг/кг массы тела животного. Введение осуществлялось ежедневно, однократно в утренние часы. При этом животные, получавшие нитрит натрия, были разбиты на две подгруппы (по 15 животных в каждой). Одна из подгрупп получала для питья обычную воду, а у другой подгруппы в поилках питьевая вода была заменена на 0,05 % водную суспензию ДНА. Также постановка эксперимента включала параллельное наблюдение за двумя контрольными группами (по 15 животных в каждой), не получавшими нитрит натрия. Указанный режим содержания обеспечивался в течение 7 дней. По окончании данного периода животных декапитировали, забирали кровь, обрабатывали взятый материал стандартным образом. В плазме и эритроцитах определяли по указанным выше методикам уровень ПОЛ и ПОБ. Все полученные результаты подвергали статистической обработке [29].
Выводы
Показано, что детонационные наноалмазы проявляют антиоксидантные свойства in vitro (подтверждено с использованием суспензии липосом и суспензии эритроцитов);
Установлено, что в зависимости от концентрации, детонационные наноалмазы могут проявлять как антиоксидантные, так и прооксидантные свойства;
Показано, что действие детонационных наноалмазов in vivo неоднозначно, данный препарат тормозит перекисное окисление белков эритроцитов, но стимулирует перекисное окисление липидов;
Установлено, что детонационные наноалмазы тормозят стимулируемые прооксидантом (нитритом натрия) процессы перекисного окисления липидов и перекисного окисления белков, что подтверждает их антиоксидантные свойства и в перспективе позволит рассматривать возможность их клинического применения.
Литература
1. Львов С.Н., Хорунжий В.В., Александрович Ю.С., Шугалей И.В. Характеристика процессов свободно-радикального окисления у детей с отравлениями различными химическими веществами // Матер. науч-но-практ. конф. «Сохранение репродуктивного потенциала подростков». СПб.: СПбГПМА, 2001, С. 108-109.
2. Шугалей И.В., Львов С.Н., Баев В.И., Хорунжий
B.В., Целинский И.В., Лукогорская С.А. Характеристика процессов свободнорадикального окисления при экстремальных воздействиях // Матер. научно-практ. конф. «Чернобыль - 15 лет спустя». СПб: СПбГУ, 2001. С. 62-63.
3. Илюшина Т.М., Хмельницкая Е.М., Шугалей И.В., Судариков А.М., Львов С.Н. Некоторые особенности течения пероксидных процессов при различных патологиях у детей // Матер. научной конф. XI Вишняковские чтения. Вузовская наука - образованию и промышленности. Бокситогорск, 28 марта 2008 г. СПб.: ЛГУ им. А.С. Пушкина, 2008. С. 297-302.
4. Шугалей И.В., Илюшина Т.М., Хмельницкая Е.М., Судариков А.М. Некоторые патологические состояния, сопровождающиеся нарушениями процессов с участием активных форм кислорода // Матер. научной конф. XI Вишняковские чтения. Вузовская наука - образованию и промышленности. г. Бокситогорск, 28 марта 2008 г. СПб.: ЛГУ им. А.С. Пушкина, 2008. С. 349-353.
5. Шугалей И.В., Судариков А.М., Илюшин М.А. Некоторые аспекты процесса липопероксидации и его роль в развитии патологии сердечно-сосудистой системы // Матер. научной конф. XVI Вишняковские чтения. Проблемы и перспективы развития высшего профессионального образования в регионе на современном этапе. г. Бокситогорск 29 марта 2013 г. СПб: ЛГУ им. А.С. Пушкина, 2013. C. 191-195
6. Илюшина Т.М., Хмельницкая Е.М., Шугалей И.В., Судариков А.М., Львов С.Н. Клиническое применение антиоксидантов. Материалы научной конференции XI Вишняковские чтения. Вузовская наука - образованию и промышленности. г. Бокситогорск, 28 марта 2008 г. СПб.: ЛГУ им. А.С. Пушкина, 2008. С.288-296.
7. Шугалей И.В., Возняковский А.П., Гарабаджиу А.В., Целинский И.В., Судариков А.М., Илюшин М.А. Биологическая активность детонационных наноалмазов и перспективы их медико-биологического использования // Журн. общей химии. 2013. Т. 83. Вып. 5. С. 709-744.
8. Шугалей И.В., Возняковский А.П., Илюшин М.А., Гарабаджиу А.В. Изучение влияния детонационных наноалмазов на процесс пероксидного повреждения аце-тилхолинэстеразы эритроцитов. Породоразрушающий и металлообрабатывающий инструмент - техника и технология его изготовления и применения: сб. науч. тр. Киев, 2013. Вып. 16. С. 351-357.
9. Шугалей И.В., Илюшин М.А., Возняковский А.П., Соколова В.В., Иванова А.А., Капитонеко З.В. Ультрадисперсные алмазы как антиоксидантные препараты. Породоразрушающий и металлообрабатывающий инструмент - техника и технология его изготовления и применения. сб. науч. тр. Киев, 2009. Вып. 12. С. 320-326.
10. Шугалей И.В., Судариков А.М., Возняковский А.П., Целинский И.В., Гарабаджиу А.В., Илюшин М.А. Химия поверхности детонационных наноалмазов как основа создания продукции биомедицинского назначения. СПб.: ЛГУ им. А.С. Пушкина, 2012. 152 с.
11. Верещагин А.Л. Сакович Г.В., Петрова Л.А., Новоселов В.В., Брыляков П.М. Исследование химического состава поверхности ультрадисперсного алмаза детонационного синтеза // Докл. АН СССР. 1990. Т. 315. № 1.
C. 104-105.
12. Владимиров Ю.А., Арчаков А.И. Перекисное окисление липидов в биологических мембранах М.: Наука, 1972. 252 с.
13. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление липидов и физические свойства липидного
слоя биологических мембран // Биофизика. 1987. Т. 32. Вып. 5. С. 830-844.
14. Бурлакова Е.Б., Храпова Н.Г. Перекисное окисление липидов мембран и природные антиоксиданты // Успехи химии. 1985. Т. 54. №. 9. С. 1540-1558.
15. Владимиров Ю.А., Проскурина Е.В., Гумайлов Д.Ю. Хемилюминесценция как метод обнаружения и исследования свободных радикалов в биологических системах // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. 2009. Вып. 1. С. 13-20.
16. Circu M.L., Aw T.Y. Reactive Oxygen Species, Cellular Redox Systems and Apoptosis // Free Rad. Biol. Med. 2010. V. 48. P. 749-762.
17. Ланкин В.З., Тихазе А.К., Беленков Ю.Н. Сво-боднорадикальные процессы в норме и при патологических состояниях. М.: РКНПК МЗ РФ, 2001. 78 с.
18. Нamilton C.A., Miller W.H., Al-Benno S., Broswan M.J., Drummond R.D., Mcbride M.W., Domoniczak A.F. Strategies to Reduce oxidative Stress in Cardiovascular Disease // Clinical Science. 2004. V. 106. P. 219-234.
19. Reuter S., Gupta S.C., Chaturvedi M.M., Aggarwal B.B. Oxidative Stress, Inflammation and Cancer: How are they Linked? // Free Rad. Biol. аnd Med. 2010. V. 49. P. 1603-1616.
20. Шугалей И.В., Львов С.Н., Баев В.И., Целин-ский И.В., Лукогорская С.А. Влияние генерации и реакционной способности активных форм кислорода на организм человека Адаптация организма к неблагоприятным условиям среды обитания: сб. науч. ст. СПб: СПбГПМА Аспор, 1999, С. 6-11.
21. Verrax J., Taper H., Buc Calderon P. Targeting Cancer Cells by an Antoxidant Based Therapy. // Curr. Mol. Pharmacol. 2008. V. 1. P. 80-9238; Brown N.S., Bicknell R. Hypoxia and Oxidative Stress: its Effects on the Growth
Metastatic Potential and Response to Therapy of Breast Cancer. // Brest Cancer Res. 2001. V. 3. P. 323-327.
22. Dubinina E.E., Konovalov P.V., Kovrugina S.V. Morozova M.G.,, Shugalei I.V. Pro- and Antioxidative systems and corticosteroids in aging people with dementia // J. of Neurochemistry. V. 71, Suppl. 1. 1998. P. 13.
23. Шугалей И.В., Илюшин М.А., Судариков А.М. Особенности метаболизма ксенобиотиков в организме теплокровных. XVI Вишняковские чтения. Проблемы и перспективы развития высшего профессионального образования в регионе на современном этапе. г. Бокситогорск 29 марта 2013 г. СПб: ЛГУ им. А.С. Пушкина, 2013. С.187-191.
24. Chance D., Sies H., Boveris A. Hydroperoxide metabolism in Mammalian Organs // Physiol. Rev. 1979. V. 59. P. 527-605.
25. Шугалей И.В., Гарабаджиу А.В., Целинский И.В.. Химия белка. СПб.: Проспект науки, 2011. 200 с.
26. Шугалей И.В. Кинетика и механизм окисления гемоглобина азотсодержащими окислителями. Поиск средств защиты от метгемоглобинообразующего действия: дис. ... д-р хим. наук. СПб, 1996. 309 с.
27. Антонова Е.А., Парамонов Д.В. Радиацион-но-химическое превращение 2,6-дитретбутил-4-метилфе-нола в водных суспензиях липосом // Вестник МГУ. Сер. 2 Химия. 1999. Т. 40. Вып. 2. С. 283-286.
28. Шугалей И.В., Лукогорская С.А., Гусейнова В.В., Иванова А.А., Дубяго Н.П., Целинский И.В., Юдин И.В. Исследование пероксидного повреждения альбумина методом хемилюминесценции при инициировании процесса реактивом Фентона // Журн. общей химии. 2008. Т. 78. Вып. 6. С. 978-981.
29. Кокунин В.А. Статистическая обработка данных при малом числе опытов // Украинский биохимический журн. 1976. Т. 47. Вып. 6. С. 776-790.
