CC BY
78
УДК 615.832.9.015.2:615.31:[547.95:547.943].015.4:616-018-008.939.15-39].076.9
ПЕРЕКИСНОЕ ОКИСЛЕНИЕ ЛИПИДОВ В ЭРИТРОЦИТАХ КРЫС ПРИ ГИПОТЕРМИИ И ВВЕДЕНИИ ДАЛАРГИНА
© 2009 г. М.Б. Саидов, Э.З. Эмирбеков
Дагестанский государственный университет, 367025, Махачкала, ул. Гаджиева, 43а, [email protected]
Dagestan State University, 367025, Makhachkala, Gadjiev St., 43a, [email protected]
Исследовано состояние процессов перекисного окисления липидов (ПОЛ) в эритроцитах в норме и при гипотермических состояниях, а также при введении даларгина. Обнаружено, что гипотермия независимо от ее глубины интенсифицирует процессы ПОЛ в эритроцитах. Накопление продуктов ПОЛ зависит от уровня гипотермии. Высказано предположение об стресс-индуцированной активации процессов ПОЛ в эритроцитах. Предварительное введение даларгина животным способствует снижению процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов.
Ключевые слова: гипотермия, мембраны, эритроциты, перекисное окисление липидов, даларгин.
Effect of dalargin injection on lipid peroxidation (LP) in erythrocytes at hypothermia was studied. Hypothermia enhances LP in erythrocytes and products ofLP accumulate proportional to degree of hypothermia. It is suggested that hypothermia stimulate LP due to concominant stress. Injection of dalargin before cooling decreases LP in erythrocytes.
Keywords: hypothermia, membrane, erythrocytes, lipid peroxidation, dalargine.
Перекисное окисление липидов (ПОЛ) - это вариант свободнорадикального окисления (СРО), реакциям которого подвержены все без исключения соединения. Однако наиболее чувствительны к свободным радикалам липиды и, в первую очередь, ненасыщенные жирные кислоты как свободные, так и в составе фосфолипидов [1].
Методы искусственной гипотермии широко применяются в медицинской практике для снижения кислородных запросов. Защитный эффект гипотермии -повышение устойчивости организма к воздействию многих неблагоприятных факторов и, прежде всего, тканевой гипоксии, обычно сопутствующей различным видам патологии [2].
Наряду с этим гипотермия оказывает и патологическое действие; ее молекулярные механизмы недостаточно изучены, что сдерживает дальнейшее ее использование.
Действительно, рядом авторов установлено, что низкотемпературное воздействие на организм приводит к интенсификации процессов ПОЛ в различных органах и тканях [3 - 6]. Это может вызвать истощение антиокислительной защиты организма и генерализованную деструкцию мембранного аппарата клеток. Поэтому поиск новых веществ, обладающих ан-тиоксидантными свойствами и стимулирующими работу антиокислительного звена организма, - актуальная задача.
Известно, что опиоидный гексапептид даларгин обладает антистрессорными и антиоксидантными действиями [7, 8], в том числе и при гипотермии [9]. Поэтому для коррекции обнаруженных изменений мы использовали данный препарат.
Цель исследования - интенсивность процессов ПОЛ в мембранах эритроцитов крыс и защитный эффект даларгина при гипотермических состояниях.
Методика исследования
Опыты проводили на беспородных белых крысах-самцах массой 180-200 г, содержащихся в стандартных условиях вивария.
Гипотермию вызывали в холодовых камерах, в рубашке которых циркулировала вода с температурой 4-5 °С. Температуру тела, измеренную ректально, снижали до 30 °С (умеренная гипотермия) и 20 °С (глубокая гипотермия). Снижали равномерно и медленно, так что за 15+20 мин она достигала 30 °С, а за 55+60 мин - 20 °С.
За 30 мин до декапитации (контроль) или за 30 мин до начала снижения температуры тела животным внутрибрюшинно вводили 0,5 мл препарата даларгина в дозе 100 мкг/кг массы. Контрольным животным вводили такой же объем физиологического раствора. Выбранные доза и сроки инъекции являются оптимальными для проявления ряда биохимических и физиологических эффектов даларгина [7].
Кровь для анализов брали из яремной вены под легким эфирным наркозом. В качестве антикоагулянта использовали гепарин (50 ед/мл). Для получения эритроцитов собранную кровь центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин. После отделения плазмы эритроциты трижды промывали физиологическим раствором, каждый раз осаждая их при 3000 об/мин в течение 5 мин. До анализа эритроциты находились на холоду при температуре 4+5 °С.
Интенсивность процессов ПОЛ в эритроцитах оценивали по накоплению одного из промежуточных продуктов ПОЛ - малонового диальдегида (МДА), по реакции с тиобарбитуровой кислотой (ТБК) [10]. Количество ТБК-активных продуктов вычисляли по
формуле: N — АI£ 1У. где /•. - экстинкция пробы: е -молярный коэффициент экстинкции: Ь - толщина кюветы; V - объем суспензии эритроцитов. Содержание МДА выражали в мкмоль/мл эритроцитов.
Перекисную резистентность эритроцитов определяли по методу из [11]. Для этого 0,2 мл суспензии эритроцитов разбавляли до 4 мл 0,145 М раствором №С1, приготовленным на 25 мМ трис-НС1 буфере рН 7,4 (буферно-солевой раствор) и использовали для опытов. Перекисную резистентность эритроцитов определяли в 3 модельных системах:
1. Спонтанный гемолиз: к 0,8 мл суспензии эритроцитов приливали 0,9 мл буферно-солевого раствора.
2. Инициированный перекисью водорода гемолиз: к 0,8 мл суспензии эритроцитов приливали 0,9 мл 1,5 % Н2О2.
3. Инициированный ионами двухвалентного железа гемолиз: к 0,8 мл суспензии эритроцитов приливали 0,6 мл буферно-солевого раствора: 0,1 мл 0,3 мМ раствора сернокислого железа и 0,2 мл 0,5 мМ раствора аскорбата.
Пробы инкубировали 10 мин при 37 °С, а затем центрифугировали при 2000 об/мин в течение 10 мин.
В надосадочной жидкости измеряли содержание гемоглобина по поглощению при длине волны 540 нм. Степень гемолиза эритроцитов выражали в процентах
от пробы с полным гемолизом, которую получали добавлением к 0,8 мл взвеси эритроцитов 0,8 мл бу-ферно-солевого раствора и 0,1 мл 0,1%-го сапонина.
Измеряли интенсивность флуоресценции суспензии эритроцитов при длине волны возбуждения 370 нм и максимуме испускания 470 нм в отсутствии зонда (Е0) и после инкубации с АНС (Б), поверхностный заряд мембран эритроцитов измеряли с помощью отрицательно заряженного зонда-1-анилинонафталин-8-сульфоната (АНС) [12]. Известно, что интенсивность флуоресценции АНС и, соответственно, соотношение Р/Б0 уменьшаются по мере повышения отрицательного поверхностного заряда мембраны за счет снижения связывания зонда с мембраной [12].
Статистическую обработку результатов проводили методом малой выборки по ^критерию Стьюдента [13]. Различия считали достоверными при значениях р<0,05.
Результаты и их обсуждение
Исследование свободнорадикальных процессов показало, что гипотермия стимулирует процессы ПОЛ в эритроцитах. Как видно из таблицы, гипотермия 30 °С приводит к увеличению одного из промежуточных продуктов ПОЛ - МДА в эритроцитах на 48,2 %.
Влияние гипотермии и даларгина на содержание МДА, поверхностный заряд мембран и перекисную резистентность эритроцитов (М±т; п = 8)
Группа МДА, F/Fo Гемолиз, %
мкмоль/мл Спонтанный Индуцированный Н2О2 Индуцированный Fe2+-acKop6aT
Контроль 3,67±0,13 1,80±0,09 1,47±0,08 2,85±0,31 1,76±0,07
Контроль + даларгин 4,21±0,24 1,68±0,04 0,79±0,10 1,91±0,12 1,39±0,08
р1-2<0,001 р1-2<0,001 Р1-2<0,01
Гипотермия 30 °С 5,44±0,21 1,49±0,07 1,78±0,11 3,08±0,24 2,49±0,18
р1-3<0,001 р1-3<0,01
Гипотермия 30 °С + 4,59±0,09 1,66±0,03 1,54±0,09 4,39±0,18 1,91±0,06
даларгин Рз-4<0,01 Рз-4<0,05
Гипотермия 20 °С 4,26±0,23 1,42±0,03 2,31±0,19 3,70±0,31 2,70±0,21
Pl-2<0,01 Р1-2<0,05 р1-5<0,001
р3-5<0,05
Гипотермия 20 °С + 3,79±0,13 1,85±0,02 1,59±0,09 3,72±0,21 1,84±0,11
даларгин P5-6<0,05 P5-6<0,05
При дальнейшем углублении гипотермии (20 °С) содержание МДА в эритроцитах снижается по сравнению с предыдущим этапом гипотермии, но остается повышенным относительно контроля на 16 %.
Таким образом, активация процессов ПОЛ в эритроцитах наблюдается при умеренной гипотермии.
Известно, что начальные этапы гипотермии сопровождаются повышением продукции и секрецией в кровь стрессорных гормонов - катехоламинов и глю-кокортикоидов [14], которые являются активными стимуляторами ПОЛ. Стимуляция ПОЛ этими гормонами осуществляется по схеме: стресс - выброс гормонов - усиление ПОЛ. Вся эта цепь, являющаяся одним из механизмов влияния различных типов стресса на организм, по нашему мнению, реализуется в условиях умеренной гипотермии.
Кроме того, прооксидантную роль при гипотермии могут играть гемовое и негемовое железо, концентрация которых в крови резко повышается по мере снижения температуры тела [15]. Свободные ионы железа, способные участвовать в реакциях Фентона, появляются в крови благодаря ацидозу, возникающему на начальных этапах гипотермии [3].
Снижение содержания МДА в эритроцитах при глубокой гипотермии возможно связано с вовлечением его в реакции образования межмолекулярных сшивок белков и липидов, которые можно расценивать как конечные продукты ПОЛ [16]. Кроме того, есть данные, свидетельствующие о том, что МДА может быть метаболизирован в эритроцитах под действием альдегиддегидрогеназы [17].
При предварительном введении даларгина животным наблюдается тенденция к росту содержания МДА в эритроцитах. При гипотермии 30 °С введение даларгина приводит к достоверному снижению содержания МДА в эритроцитах по сравнению с гипотермией без введения данного препарата. Однако да-ларгин полностью не нормализует уровень МДА в эритроцитах при гипотермии 30 °С.
В условиях глубокой гипотермии даларгин полностью нормализует уровень МДА в эритроцитах.
Таким образом, предварительное введение предотвращает активацию ПОЛ в эритроцитах.
Регуляция свободнорадикальных процессов при гипотермии даларгином, по-видимому, осуществляется через ограничение этим препаратом в крови и тканях уровня стрессорных гормонов, а также вторичного посредника в клетках цАМФ [18].
Немаловажное значение в ограничении свободно-радикальных процессов при кратковременной умеренной гипотермии имеет снижение уровня железа, свободного гемоглобина и среднемолекулярных пептидов в плазме крови на фоне даларгина [15], что устраняет их прооксидантное действие.
Как известно, интенсивность процессов ПОЛ, существенно модифицирующих биологические мембраны, определяется соотношением скорости генерации свободных радикалов кислорода и «емкостью» анти-оксидантной системы [19].
Для оценки этих параметров нами проведены тесты на перекисную резистентность эритроцитов. Обнаружено (таблица), что при гипотермии 30 °С наблюдается возрастание гемолиза, индуцированного всеми системами: спонтанного - на 21 %; индуцированного Н2О2 - 8, индуцированного Fe^-аскорбат - на 41 %. Глубокая гипотермия еще больше увеличивает уровень гемолиза: спонтанного - на 52 %; индуцированного Н2О2 - 29, индуцированный Fe^-аскорбат -на 53 % .
Таким образом, при гипотермии в мембране эритроцитов происходят изменения, делающие их более доступными для перекисных радикалов.
По-видимому, снижение перекисной резистентности эритроцитов является следствием снижения обеспеченности мембран а-токоферолом и изменения упаковки липидного бислоя. Снижение содержания а-токоферола при гипотермии 30 °С для миокарда крыс было обнаружено А.И. Шкестерс с сотр. (1991). Кроме того, активация свободнорадикальных процессов приводит к накоплению в мембранах полярных продуктов ПОЛ, свободных жирных кислот и лизолипи-дов [20]. В частности, показано [21], что при гипотермии в мембранах эритроцитов повышается содержание свободных жирных кислот и лизофосфатидилхо-лина. Последние обладают детергентоподобным действием [22] и могут быть ответственны за нарушение упаковки липидного бислоя мембран эритроцитов при гипотермии.
Использование даларгина показало, что у контрольных животных при введении данного пептида достоверно снижается уровень неиндуцированного и индуцированного прооксидантами гемолиза в услови-
ях низкой температуры тела (умеренная и глубокая гипотермия). Даларгин предотвращает повышение перекисного гемолиза за исключением индуцированного перекисью водорода.
Вышеприведенные данные свидетельствуют о том, что при гипотермии даларгин снижает как интенсивность ПОЛ в эритроцитах, так и их перекисный гемолиз. Можно предположить, что снижение перекисного гемолиза эритроцитов даларгином при гипотермии связано с ограничением процессов ПОЛ, в результате чего сохраняются запасы антиоксидантов в мембране и ограничиваются процессы фосфолипазного гидролиза мембранных липидов.
Выше было отмечено, что активация свободноради-кальных процессов приводит к накоплению в мембранах полярных продуктов ПОЛ - свободных жирных кислот и лизолипидов, что приводит к изменению поверхностного заряда мембран [23]. О такой возможности при гипотермии мы судили по связыванию мембранами флуоресцентного зонда АНС. Из таблицы видно, что при гипотермии снижается интенсивность флуоресценции АНС суспензии эритроцитов. Чем ниже температура, тем меньше флуоресценция АНС.
Уменьшение флуоресценции зонда АНС свидетельствует о повышении отрицательного заряда мембран [12].
Гипотермия инициирует процессы ПОЛ в мембранах эритроцитов. Поэтому можно предположить, что снижение интенсивности флуоресценции АНС при гипотермии, возможно, связано с появлением полярных продуктов ПОЛ в мембране, ответственных за тушение флуоресценции.
При действии фосфолипазы А2 в мембране образуются лизоформы липидов и свободные жирные кислоты. Это ведет к росту отрицательного заряда поверхности мембраны.
Повышение активности эндогенной фосфолипазы А2 и значительное увеличение количества свободных жирных кислот, а также относительного содержания кислых фосфолипидов в мембранах эритроцитов крыс было обнаружено при гипотермии [21].
Таким образом, снижение флуоресценции АНС при гипотермии отражает повышение отрицательного заряда мембраны, связанного с активацией процессов ПОЛ и фосфолиполиза. Предварительное введение даларгина предотвращает снижение связывания АНС с мембранами эритроцитов при гипотермии. Эти результаты свидетельствуют о том, что даларгин препятствует изменению поверхностного заряда мембран эритроцитов, что, возможно, связано с обнаруженным нами предотвращением активации процессов ПОЛ под влиянием этого пептида.
Таким образом, полученные в работе результаты свидетельствуют о том, что гипотермия стимулирует процессы ПОЛ мембран эритроцитов и существенно повышает отрицательный поверхностный заряд мембран. Предварительное введение даларгина предотвращает эти изменения при гипотермии, оказывая мембраностабилизирующее действие.
Литература
1. Владимиров Ю.А. Свободнорадикальное окисление ли-
пидов и физиологические свойства липидного слоя биологических мембран // Биофизика. 1987. Т. 32, вып. 5. С. 830-841.
2. Effect of mild hypothermia on focal cerebral ischemia / T.
Miyazawa [et al.] // Neurol. Res. 2003. Vol. 25. P. 457464.
3. Эмирбеков Э.З., Львова С.П. Механизмы биохимических
изменений при низких температурах тела. Ростов н/Д, 1985. 80 c.
4. Эмирбеков Э.З., Львова С.П., Кличханов Н.К. Биохими-
ческие изменения в крови при искусственной и естественной гипотермии // Проблемы криобиол. 1995. № 1. С. 14-21.
5. Саидов М.Б. Физико-химическая характеристика мембран
эритроцитов крыс при гипотермии и на фоне введения даларгина: дис. ... канд. биол. наук. М., 2002. 109 с.
6. Шустанова Т.А., Бондаренко Т.И., Милютина Н.П. Сво-
боднорадикальные механизмы развития холодового стресса у крыс // Рос. физиол. журн. им. И.М. Сеченова. 2004. Т. 80, № 1. С. 73-81.
7. Лишманов Ю.Б., Маслов Л.Н. Опиоидные нейропепти-
ды, стресс и адаптационная защита сердца. Томск, 1994. 352 с.
8. Кличханов Н.К. Биохимические изменения в мембранах
млекопитающих при зимней спячке и гипотермии: дис. ... д-ра биол. наук. Ростов н/Д, 2005. 254 с.
9. Львова С.П., Горбунова Т.Ф., Абаева Е.М. Влияние ги-
потермии и даларгина на перекисное окисление липи-дов в тканях крыс // Вопр. мед. химии. 1993. Т. 39, №. 3. С. 21-24.
10. Стальная И.Д., Горишвили Т.Д. Метод определения ма-
лонового диальдегида с помощью тиобарбитуровой кислоты // Современные методы в биохимии. М., 1977. С. 66-68.
11. Свободнорадикальное окисление липидов и устойчи-
вость к гемолизу эритроцитов здоровых и больных детей / Ю.А. Юрков [и др.] // Вопр. мед. хим. 1984. Т. 30, № 4. С. 101-106.
12. Владимиров Ю.А., Добрецов Г.Е. Флуоресцентные зонды
в исследовании биологических мембран. М., 1980. 320 с.
13. Лакин Г.Ф. Биометрия. М., 1990. 352 с.
14. Особенности реакции симпато-адреналовой системы
крыс при разных типах охлаждения / Т.В. Козырева [и др.] // Рос. физиол. журн. 1999. Т. 85, № 11. С. 14341439.
15. Кличханов Н.К. Метаболические и структурно-
функциональные изменения в плазме крови и эритроцитах при гипотермии // Научная мысль Кавказа. 2001. Спец. вып. С. 38-50.
16. Girotti A.W. Lipid hydroperoxide generation, turnover and
effector action in biological systems // J. Lipid Res. 1998. Vol. 39. P. 1529-1542.
17. Деградация малонового диальдегида в эритроцитах и её
возрастные, сезонные и суточные изменения / В.В. Банкова [и др.] // Вопр. мед. химии. 1988. № 6. С. 2730.
18. Осадчий О.Е., Покровский В.М. Регуляторные эффекты
опиоиодных пептидов - энкефалинов в контроле деятельности сердечно-сосудистой системы // Усп. физиол. наук. 2000. Т. 31, № 1. С. 18-30.
19. Свободнорадикальное окисление и старение / В.Х. Ха-
винсон [и др.] СПб., 2003. 327 с.
20. Ланкин В.З., Тихадзе А.К., Осис Ю. Г. Моделирование
каскада ферментативных реакций в липосомах, включающих последовательное свободнорадикальное окисление, восстановление и гидролиз полиеновых ацилов фосфолипидов для исследования влияния этих процессов на структурно-динамические параметры мембраны // Биохимия. 2002. Т. 67, вып. 5. С. 679-689.
21. Линчевская А.А., Кондратьева Л.А. Влияние гипотермии
на структурно-функциональные свойства эритроцитов белых крыс // Вопр. мед. химии. 1989. № 6. С. 36-39.
22. Лизис эритроцитов человека, индуцированный алифати-
ческими альдегидами / И.И. Степуро [и др.] // Биол. мембраны. 1990. Т. 7, № 7. С. 742-749.
23. Шкестерс А.П., Утно Л.Я., Гиргенсоне Н.Я. Регуляция
активности СОД во время глубокой гипотермии с одновременным применением водо- и жирорастворимых антиоксидантов // Бюл. эксперим. биол. и мед. 1991. Т. 64, № 6. С. 593-595.
Поступила в редакцию_16 января 2008 г.
