CC BY
84
Биология и экспериментальная медицина
УДК 615.327:553.74].015.4
оценка антимикробных свойств сероводородной минеральной воды курорта «усть-качка»
И. П. Корюкина1, В. В. Сидоров2, Ю. Н. Маслов1,Л. Е.Леонова1, Л. Е. Чернышова1, Г. В. Куранов1, Ю. Ю. Красина1
'Пермская государственная медицинская академия им. ак. Е. А. Вагнера, г. Пермь, 2Курорт «Усть-Качка», Пермский край
В экспериментах in vitro изучена антимикробная активность сероводородной минеральной воды. Использованы музейные культуры Staphylococcus aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris и Candida albicans. Выявлено снижение жизнеспособности бактерий и грибков в сероводородной минеральной воде. Показано, что после контакта с сероводородной минеральной водой у бактериальных и грибковых культур наблюдаются замедление скорости роста, а также повышение уровня чувствительности к антимикробным препаратам. Под влиянием сероводородной минеральной воды у культур Staphylococcus aureus снижается выработка факторов вирулентности: гемолизина и лецитовителлазы. Результаты свидетельствуют о наличии универсального антимикробного механизма действия сероводородной минеральной воды.
Ключевые слова: сероводородная минеральная вода, антимикробная активность, бактериальные и грибковые культуры, повышение антибиотикочувствительности.
Введение
Бальнеолечение является эффективным средством терапии и реабилитации, которое с успехом применяется уже более двух тысячелетий. В то же время остаются недостаточно изученными механизмы воздействия природных бальнеологических факторов, в частности влияние минеральных вод (МВ) на клинически значимые свойства микрофлоры. Традиционно проводимые эксперименты, как правило, ограничиваются оценкой угнетающего действия МВ на некоторые виды бактерий [2, 8]. Более значимыми следует
признать работы, оценивающие снижение у бактериальных культур выработки факторов вирулентности: гемолизинов, дермонекроти-ческого токсина, лецитиназы [6, 7], а также угнетение факторов микробной персистен-ции (антилизоцимной, антикомплементарной и антилактоферриновой активности) под действием МВ [1]. Такие эффекты МВ могут иметь непосредственное клиническое значение, поскольку изменяют баланс микрофлора/макроорганизм в пользу организма человека [3]. К подобным эффектам, имеющим практическое значение для медицины, следует отнести влияние МВ на уровень ле-
карственной устойчивости микробных культур [4].
В связи с вышеизложенным целью настоящего исследования являлась оценка антимикробных свойств сероводородной минеральной воды курорта «Усть-Качка» в экспериментах in vitro.
В задачи работы входили:
1. Изучение выживаемости бактериальных и грибковых культур в сероводородной минеральной воде (далее — СМВ) курорта «Усть-Качка».
2. Выявление воздействия СМВ на скорость роста микроорганизмов.
3. Оценка возможного влияния СМВ на уровень чувствительности микробных культур к антимикробным препаратам.
4. Исследование влияния СМВ на экспрессию факторов вирулентности бактериальных культур.
5. Определение влияния различных режимов использования СМВ на эффекты ее применения.
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ
Сероводородная минеральная вода курорта «Усть-Качка» имеет минерализацию 76 г/л и относится к рассольной хлоридной (С1- — 42 129 мг/л) натриевой (Na+ + K+ — 26 036 мг/л) крепкой сульфидной (H2S + HS- — 301 мг/л), содержащей бром (Вг — до 58 мг/л) и бор в форме борной кислоты (H3BO3 — до 360 мг/л).
Непосредственно перед проведением экспериментов природную СМВ разводили стерильной дистиллированной водой до используемых в бальнеологической практике терапевтических концентраций сероводорода (50, 100 или 150 мг/л).
В работе использовали музейные микробные культуры Staphylococcus aureus ATCC
25923 и ATCC 29213, Escherichia coli ATCC 25922, Proteus vulgaris ССМ 1799 и Candida albicans ATCC 10231.
Изучали следующие показатели антимикробной активности СМВ:
— выживаемость микробных культур в исследуемой воде;
— влияние СМВ на скорость роста микробов на плотных средах;
— влияние СМВ на уровень чувствительности к антибиотикам;
— влияние на выраженность факторов вирулентности.
Использовали известные методики [2, 4, 6, 7, 8]; эксперименты выполняли в трех повторностях.
Выживаемость в СМВ оценивали при минимальной концентрации сероводорода (50 мкг/л), проводя инкубацию культур в исследуемой воде при температуре 37°С с ежечасными высевами. В контроле вместо СМВ использовали физиологический раствор. Во всех остальных экспериментах методика предусматривала предварительное приготовление взвесей суточных тест-культур, их контакт с СМВ различной концентрации в течение 30 минут при температуре 37°С (контрольные взвеси культур в аналогичных условиях контактировали с изотоническим раствором хлористого натрия), отмывку культур от СМВ и стандартизацию взвеси с помощью стандарта мутности ГИСК перед посевами. О скорости роста на плотных средах судили по диаметру колоний, который измеряли с помощью микроскопа МБС-2. При изучении влияния СМВ на уровень чувствительности бактериальных и грибковых культур к антимикробным препаратам использовали дискодиффузионный метод (в том числе в варианте «двойных дисков») [5]. В экспериментах с грамотрицатель-ными бактериями использовали следующие препараты: ампициллин, цефотаксим, гента-
мицин, ципрофлоксацин; с грамположитель-ными бактериями — оксациллин, цефазолин, гентамицин, ципрофлоксацин и линкоми-цин. У грибковой культуры оценивали чувствительность к нистатину, амфотерицину, итраконазолу и клотримазолу. Влияние СМВ на уровень чувствительности к препаратам выражали как отношение диаметра зоны угнетения роста культуры в опыте к аналогичному показателю в контроле и условно обозначали этот показатель как коэффициент влияния.
При изучении влияния СМВ на гемолитическую и лецитовителлазную активность культур стафилококка производили посев на кровяной и желточный агары (не более 10—15 колоний на чашку). После инкубации замеряли диаметр выросших колоний и диаметр зоны гемолиза либо зоны ферментативной активности («радужки») вокруг них. Для сопоставимости результатов также использовали относительный показатель — индекс активности, который вычисляли как отношение диаметра зоны гемолиза или «радужки» к диаметру колонии.
Статистическая обработка полученных данных проведена с использованием параметрических и непараметрических показателей (критерий Стьюдента и критерий Уилкоксона) при помощи компьютерной программы В^а1;. Для сопоставления средних значений показателей (например, опыт/ контроль) также использовали критерий
Стьюдента. При проверке статистических гипотез критический уровень значимости принимали равным 0,05.
Результаты и их обсуждение
Исследование выживаемости культур грамположительных (S. aureus ATCC 29213) и грамотрицательных (E. coli ATCC 25922) бактерий, а также грибковой культуры C. albicans ATCC 10231 показало, что во все сроки пребывания в СМВ начиная с первого часа концентрация тестовых микроорганизмов снижалась существенно быстрее, чем в контрольном растворе хлорида натрия (различия статистически значимы; р<0,05). К 24 часам инкубации в СМВ не оставалось жизнеспособных клеток кишечной палочки и грибков, в то время как в контроле они присутствовали. Сохранение жизнеспособных клеток золотистого стафилококка после 24-часового контакта с СМВ можно связать с более высокой галотолерантностью этого вида.
Использованный нами в экспериментах интегральный показатель скорости роста микробных культур на плотных средах (диаметр колоний) оказался сниженным у культур, контактировавших с СМВ (табл. 1).
Изучаемая вода оказывала также влияние на способность бактериальных культур вырабатывать ферменты и токсины: после кон-
Таблица 1
Средний диаметр колоний микроорганизмов на плотной питательной среде, мм
(М±m)
S. aureus ATCC 292133 S. aureus ATCC 25923 E. coli ATCC 25922 Pr. vulgaris теМ 1799 C. albicans ATCC 10231
Опыт * 1,65±0,02 2,15±0,03 2,65±0,02 2,70±0,03 1,89±0,04
Контроль 1,84±0,02 2,40±0,03 2,86±0,05 2,99±0,03 2,11±0,03
Примечание. * — различия опыт/контроль для всех культур статистически значимы по критериям Стью-дента и Уилкоксона (р<0,05).
такта с СМВ индекс активности был существенно ниже, чем в контроле (табл. 2).
На примере одной из культур стафилококка показана также зависимость антимикробного эффекта СМВ от ее концентрации: более высокая концентрация приводила к большему угнетению способности продуцировать лецитовителлазу и гемолизин. Отметим также, что различия между исходными показателями (т. е. средними значениями диаметров колоний или диаметров зон активности) в опыте и контроле были статистически значимыми при весьма высоком уровне значимости различий: р<0,013 — для критерия Стьюдента; р<0,4б — для критерия Уилкоксона.
Результаты исследований влияния СМВ на уровень лекарственной устойчивости бактериальных и грибковых культур свиде-
тельствовали о статистически значимом повышении уровня чувствительности микробов к препаратам (табл. 3). Этот эффект отмечали как у грамположительных (стафилококки), так и у грамотрицательных бактерий — эшерихии и протея (в таблице в качестве примера приведены показатели культуры Е. соЩ.
Грибковая культура реагировала на контакт с СМВ аналогичным образом, причем уровень повышения чувствительности к ан-тимикотическим препаратам по сравнению с контролем был выше, чем у бактерий (табл. 3). Различия между опытом и контролем были достоверными для всех препаратов. Примечательно, что степень повышения антибиотикочувствительности микробных культур по существу не зависела от особенностей строения микробной клетки или
Таблица 2
Средние показатели индекса активности лецитовителлазы и гемолизина стафилококков
S. аигет АТСС 25923, лецитовителлаза S. аигет АТСС 29213, концентрация Н^ 100 мкг/л
Н2S 100 мкг/л Н2S 150 мкг/л лецито-вителлаза гемолизин
Опыт 2,87 2,42 1,05 1,22
Контроль 3,23 2,98 2,03 1,34
Культура Препарат Средние показатели Уровень значимо- Коэффициент
опыт контроль сти различий влияния
Ампициллин 23,67±0,88 20,33±0,33 0,028 1,16
Цефотаксим 42,67±0,33 39,00±0,48 0,008 1,10
Гентамицин 25,33±0,33 21,67±0,33 0,008 1,17
Ципрофлоксацин 49,67±1,2 40,67±0,33 0,028 1,22
Амфотерицин 16,00±0,58 12,67±0,33 0,01 1,26
а Нистатин 17,00±0,58 13,67±0,3 0,038 1,24
<3 и Итраконазол 12,33±0,33 8,00±1,16 0,039 1,54
Клотримазол 25,33±0,33 21,00±0,58 0,006 1,21
Таблица 3
Влияние СМВ на уровень чувствительности бактериальных и грибковых культур к антимикробным препаратам, средний диаметр зоны угнетения роста, мм (М±m)
механизма влияния того или иного препарата, что свидетельствует об универсальности процесса воздействия изучаемой МВ на микроорганизмы.
Большинство авторов, изучавших влияние МВ на свойства микробных культур, видят причину изменения культуральных, токсигенных, агглютинабельных и других свойств бактерий в нарушении внутриклеточного обмена микробных клеток, которое возникает в результате контакта с биологически активными компонентами МВ, в частности микроэлементами, входящими в их состав. Исследуемая СМВ содержит комплекс компонентов: сероводород, бор и бром. Поэтому можно полагать, что наблюдавшиеся в экспериментах изменения таких показателей, как уровень чувствительности к антимикробным препаратам и активность выработки факторов вирулентности связаны с аналогичным влиянием на жизненно важные внутриклеточные процессы. Выявленные в экспериментах антимикробные эффекты СМВ позволяют с новых позиций оценивать клинические результаты бальнеотерапии, а также открывают перспективы более глубокого изучения механизмов лечебного действия МВ.
Выводы
1. Сероводородная минеральная вода курорта «Усть-Качка», разведенная до терапевтических концентраций, снижает показатели выживаемости бактериальных и грибковых культур.
2. После контакта с сероводородной минеральной водой отмечается замедление темпов роста микроорганизмов.
3. В результате взаимодействия с сероводородной минеральной водой наблюдается повышение уровня чувствительности микробных культур к антимикробным препаратам.
4. После воздействия сероводородной минеральной воды регистрируется снижение выработки факторов вирулентности бактериальными культурами.
5. Антимикробная активность исследуемой воды наблюдается при всех вариантах ее терапевтических концентраций; отмечается прямая зависимость антимикробной активности от концентрации.
Библиографический список
1. Абдрахманов А. Р. Характеристика микрофлоры, выделенной при хронических аднекситах, и влияние бальнеолечения на биологические свойства микроорганизмов в эксперименте и клинике/А. Р. Абдрахманов, О. Л. Карташова, С. Б. Киргизова// Вопр. курортол.— 2004.— № 4.— С. 21—24.
2. Антибактериальные свойства минеральных вод курорта «Анапа»/Л. Е. Пономарев,
B. Г. Назаретян, Т. П. Кроличенков и др.// Вопр. курортол.— 1993.— № 4.— С. 27—28.
3. Аутохтонная микрофлора минеральной воды «Усть-Качкинская» и ее свойства/ Ю. Н Маслов, И. П. Корюкина, В. В. Сидоров и др.//Здоровье и образование: Матер. II Всерос. научно-практ. конф.— Пермь, 2004.— С. 175—178.
4. Маслов Ю. Н. Антимикробные свойства питьевой минеральной воды «Усть-Кач-кинская»/Ю. Н. Маслов//Пермский медицинский журнал.— 2003.— № 3—4.—
C. 91—98.
5. Методические указания по определению чувствительности микроорганизмов к антибактериальным препаратам. МУК 4.2.1890—04.— М.: Федеральный центр Госсанэпиднадзора Минздрава России, 2004.
6. Опыт применения минеральной воды курорта «Варзи-Ятчи» в комплексном лечении и реабилитации нефрологических больных/И. А Казакова, В. В. Трусов, Л. Н. Соловьева и др.//Курортология, физиотерапия, восстановительная медицина
XXI века: Матер. межд. конгресса.— Пермь, 2000.- Т. 1.— С. 64—66.
7. Соковнина С. В. Антимикробная активность минеральной воды «Варзи-Ятчи» и ее применение при дисбиозах слизистых у детей: автореф. дис. ... канд. мед. наук/С. В. Соковнина.— Ижевск, 2002.— 23 с.
8. Соловьева И. Н. Эффективность минеральной воды «Увинская» в лечении детей с атопическим дерматитом: автореф. дис. ... канд. мед. наук/И. Н. Соловьева.— Ижевск, 2002.— 23 с.
I. P. Koryukina, V. V. Sidorov, Yu. N. Maslov, L. E. Leonova, L. E. Chernyshova, G. V. Kuranov, Yu. Yu. Krasina
ASSESSMENT OF ANTIMICROBIAL PROPERTIES OF HYDROSULFURIC MINERAL WATER OF HEALTH RESORT «UST-KACHKA»
Antimicrobial activity of hydrosulfuric mineral water was investigated during in vitro experiments. Museum cultures Staphylococcus
aureus, Escherichia coli, Proteus vulgaris and Candida albicans were used. Bacterial and fungus viability decreased in hydrosulfuric mineral water. Retardation of growth rate as well as elevation of antimicrobial drug sensitivity level in bacterial and fungal cultures after contact with hydrosulfuric mineral water was shown. Under the effect of hydrosulfuric mineral water production of such virulence factors as hemolysin and lecithovitellase decreased in Staphylococcus aureus cultures. Results demonstrated presence of universal antimicrobial mechanism of hydrosulfuric mineral water action.
Keywords: hydrosulfuric mineral water, antimicrobial activity, bacterial and fungus cultures, elevation of antibiotic sensitivity.
Контактная информация: Корюкина Ирина Петровна, доктор мед. наук, профессор, ректор Пермской государственной медицинской академии им. ак. Е. А. Вагнера, 614000, г. Пермь, ул. Петропавловская, 26, тел. 8 (342) 217-10-31
Материал поступил в редакцию 18.05.2011
