CC BY
5УДК 579.89, 579.62
ОЦЕНКА АНТИБИТИКОРЕЗИСТЕНТНОСТИ ПРЕДСТАВИТЕЛЕЙ БАКТЕРИАЛЬНОЙ НОРМОФЛОРЫ КИШЕЧНИКА ЛАБОРАТОРНЫХ
ЖИВОТНЫХ
Садуллоева Т.И., студент группы 14Био(ба)Мб, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: sadulloevat@mail.ru
Клименко О.П., студент группы 15Био(ба)Мб, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: cloud456@mail.ru
Мокина Е.С., студент группы 15Био(ба)Мб, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: huinsaegyeou@yandex.ru
Русяева М.Л., студент группы 15Био(ба)Мб, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: rusyeva1998@mail.ru
Королькова Д.С., студент группы 15Био(ба)Мб, Оренбургский государственный университет, Оренбург e-mail: korolkova 1997@mail.ru
Гезольдова А.М., студент группы 16Био(ба)-2, Оренбургский государственный университет, Оренбург
e-mail: gezoldowa.anyuta@yandex.ru
Научный руководитель: Сизенцов А.Н., канд. биол. наук, доцент, доцент кафедры биохимии и микробиологии, Оренбургский государственный университет, Оренбург
В статье представлены данные по исследованию антибиотикорезистентности представителей факультативно-анаэробной нормофлоры кишечника лабораторных.
Ключевые слова: E. faecalis, E. cloacae, E. coli, L. acidophilus, антибиотикорезистентность, диско-диффузионный метод.
Антибиотик и микроорганизм - это две противоборствующие силы. Изобретатели антибиотиков каждый раз придумывают все более изощренные методы уничтожения микроорганизмов, а те в свою очередь, эволюционируя, создают порой уникальные, абсолютно непостижимые механизмы защиты.
Антимикробная химиотерапия проводится с использованием лекарственных средств, действие которых избирательно направлено на подавление жизнедеятельности возбудителей инфекционных заболеваний, таких как бактерии, грибы, простейшие, вирусы. Под избирательным действием понимают активность только против микроорганизмов, при сохранении жизнеспособности клеток хозяина, и действие на определённые виды и роды микроорганизмов.
Основной проблемой последних лет является широкое распространение резистентных форм патогенных микроорганизмов и снижение эффективности ряда антибиотиков.
С современных позиций нормальную микрофлору следует рассматривать как совокупность множества микробиоценозов, характеризующихся определенным составом и занимающих тот или иной биотоп в организме человека. В любом микробиоценозе различают постоянно встречающиеся или характерные виды (автохтонная микрофлора) и добавочные или случайные виды (транзиторная автохтонная микрофлора). Количество характерных видов относительно невелико, зато численно они представлены наиболее
обильно. Недостаток или избыток того или иного субстрата или метаболита служит сигналом для усиления роста или гибели соответствующего звена экологической системы [1].
В процессе эволюции автохтонные микроорганизмы превращались во все более взаимосвязанное целое, но одновременно происходило и разделение функций, то есть их специализация. Анаэробные бактерии образуют в процессе своей жизнедеятельности продукты, используемые аэробной флорой, а последние, в свою очередь, создают условия, благоприятные для существования облигатных анаэробов. Подобная интеграция позволяет кишечной экологической системе выступать как единое целое, согласованно работающее в интересах всей системы организма человека, в которой она локализована [2].
Согласно положению отраслевого стандарта дисбактериоз кишечника - это клинико-лабораторный синдром, возникающий при целом ряде заболеваний и клинических ситуаций, который характеризуется изменением качественного или количественного состава нормофлоры определенного биотопа, а также транслокацией различных ее представителей в несвойственные биотопы, метаболическими и иммунными нарушениями, сопровождающимися клиническими симптомами у людей. Особое внимание заслуживает установленный факт, что некоторые микробные гены, особенно закодированные в плазмиде гены антибиотикорезистентности, могут передаваться между микроорганизмами и представлять серьезную клиническую проблему [3, 4].
На основании изложенного перед нами была поставлена цель исследования: изучить антибиотикорезистентность представителей факультативно-анаэробной нормофлоры лабораторных крыс: E. faecalis, E. cloacae, E. coli, L. acidophilus, с использованием различных методов (с применением тест-систем и диско-диффузионным).
В ходе предварительного исследования из кишечника лабораторных крыс были выделены представители факультативно-анаэробной нормофлоры. Выделение осуществлялось с использованием методов серийного разведения и истончающего штриха, идентификация проводилась на основание макроморфологических свойств роста популяции на накопительных и селективных плотных питательных средах, а также на основании тинкториальных и биохимических свойств микроорганизмов. В ходе выделения и последующей идентификации нами были определены 4 вида микроорганизмов: E. faecalis, E. cloacae, E. coli и L. acidophilus.
Следующий этап исследования был направлен на изучение антибиотикорезистентности выделенных микроорганизмов. Для решения задачи поставленной на данном этапе чувствительность факультативно-анаэробной нормофлора кишечника лабораторных крыс (E. faecalis, E. cloacae, E. coli, L. acidophilus) к антибиотикам оценивалась с применением тест-систем «Bio Merieux» (таблица 1).
В ходе проведенных исследований было установлено, что все исследуемы штаммы микроорганизмов проявили устойчивость к следующим антибиотикам: Penicilline и Ampicilline (входящие в группу пенициллинов); Cefuroxime, Cefotaxime, Ceftazidime, Cefixime (группа цефалоспоринов); Lincomycine (группа линкозамидов); Colistine (полимиксины).
В отношении других антибиотиков у исследуемых микроорганизмов не было зарегистрировано общей картины резистентности, однако следует отметить, что наиболее устойчивым штаммом нормофлоры кишечника является E. coli который проявил выраженную чувствительность лишь в отношении Ticarcilline, Cefoxitine, Cefoperazone (группа Р-лактамных антибиотиков) и Tetracycline (группа тетрациклинов). При этом наиболее чувствительным представителем кишечной микрофлоры является E. cloacae который помимо выше перечисленной общей резистентности выраженная устойчивость проявлялась в отношении Ticarcilline (группа пенициллинов) и Chloramphenikol (левомицетины).
Таблица 1 - Оценка антибиотикорезистентности исследуемых микроорганизмов с
использованием тест-систем «Bio Merieux»
Антибиотики E. coli L. acidophilus E. faecium E. cloacae
Penicilline R R R R
Ampicilline R R R I
Пенициллины Oxacilline R R S I
Amoxicilline R S S S
Ticarcilline S I R R
Mecillinam R S R I
Cefuroxime R R R I
Cefotaxime R I I I
Ceftazidime R I R R
Cefactor I I I S
Цефалоспорины Cefamandole I S I S
Cefotetan R S I S
Cefoxitine S I R S
Cefoperazone S R S I
Cefixime R I R R
Карбопенемы Imipeneme R S R I
Гликопептиды Vancomycine R I I S
Teicoplanine R S S S
Монобактамы Aztreonam I S R I
Тетрациклины Tetracycline S R S S
Линкозамиды Lincomycine R R R R
Макролиды Erythromycine R S R I
Pristinamycine R I R S
Левомицетины Chloramphenikol I S S R
Полимиксины Colistine R R R R
Примечание: R - резистентность, S - чувствительность, I - умеренная резистентность
Следующий этап нашего исследования, направленного на изучение антибиотикорезистентности представителей факультативно-анаэробной нормофлоры кишечника лабораторных животных, был связан с использованием диско-диффузионного метода (таблица 2), преимущество которого по сравнению с тест-системами связано с тем что данную методику можно отнести не только к качественным, но и количественным методам исследований.
Таблица 2 - Оценка антибиотикорезистентности исследуемых микроорганизмов с
использованием диско-диффузионного метода
Антибиотики E. coli L. acidophilus E. faecium E. cloacae
1 2 3 4 5 6
Пенициллины Penicilline R R R R
Ampicilline R R R R
Oxacilline R R R R
Аминогликози ды Streptomycine 32,0±0,58 21,3±0,88 32,0±0,58 19,7±0,33***
Kanamycine 25,0±0,58 19,3±0,33 25,0±0,58 25,0±0,58
Gentamicine 29,7±0,33** R 29,3±0,33** 24,7±0,33***
Netilmicine 26,0±0,58** 22,4±0,58*** 32,3±0,88 25,0±0,58***
Cefuroxime 23,3±0,88 R R 29,3±0,33
1 2 3 4 5 6
Аминогликози ды Cefotaxime 33,0±0,57 R 24,33±0,33*** 28,3±0,33***
Cefamandole 34,3±0,33 22,0±0,57 24,7±0,33 25,67±0,33
Cefasoline 24,7±1,87 21,0±0,58 R 28,7±0,67
Cefoperazone 30,7±0,33 17,7±0,33 R 22,7±0,33
Imipeneme 33,67±0,88 18,0±0,58 28,3±0,88 25,7±0,33***
Гликопептиды Vancomycine R 21,3±0,67 16,7±0,67* 25,0±0,58
Тетрациклины Tetracycline 25±1,15 R 31,33±1,5 23,7±0,33*
Линкозамиды Lincomycine R 14,7±0,33 R 22,0±0,58
Макролиды Erythromycine R 21,0±0,58 R 13,0±0,58*
Pristinamycine R 18,33±0,88 R 15,7±0,33
Полимиксины Colistine R 18,0±0,67 R 17,3±0,67
Данный метод основан на измерении зоны подавления роста микроорганизма на чашке Петри с агаром вокруг диска, содержащего определенное количество антибиотика. По размеру зоны подавления роста все штаммы подразделяют на чувствительные, умереннорезистентные и резистентные к данному антибиотику (рисунок 1) [5].
Рисунок 1 - Зоны подавления роста исследуемого микроорганизма при оценке резистентности микроорганизмов к антибиотикам диско-диффузионным методом
В результате проведенных исследований было установлено, как и в случае с использованием тест систем все исследуемые штаммы микроорганизмов проявили общую резистентность в отношении Penicilline, Ampicilline и Oxacilline (входящие в группу пенициллинов). При этом наиболее чувствительным в отношении антибиотиков является E. cloacae. В то время как L. acidophilus является наиболее устойчивым ко всем исследуемым антибиотикам (наблюдается либо отсутствие зон подавления, либо их значения минимальны по сравнению с аналогичными показателями других исследуемых микроорганизмов).
В результате проведенных исследований было установлено, как и в случае с использованием тест систем все исследуемые штаммы микроорганизмов проявили общую резистентность в отношении Penicilline, Ampicilline и Oxacilline (входящие в группу пенициллинов). При этом наиболее чувствительным в отношении антибиотиков является E. cloacae. В то время как L. acidophilus является наиболее устойчивым ко всем исследуемым антибиотикам (наблюдается либо отсутствие зон подавления, либо их значения минимальны по сравнению с аналогичными показателями других исследуемых микроорганизмов).
Заключительным этапом исследования являлась оценка резистентности исследуемых микроорганизмов к исследуемым антибиотикам методом серийных разведений (таблица 3).
На основании проведенного диско-диффузионного исследования нами были отобраны те антибиотики в отношении которых все исследуемые микроорганизмы проявили
выраженную резистентность Penicilline, Ampicilline и Oxacilline (входящие в группу пенициллинов).
Таблица 3 - Субингибирующие концентрации антибиотиков в отношении представителей факультативно-анаэробной нормофлоры кишечника крыс_
№ п/п Исследуемый микроорганизм Исследуемые антибиотики
Penicilline, мкг/мл Ampicilline, мкг/мл Oxaciline, мкг/мл
1 E. coli 4295,4±1559,3 5200,4±346,1 3651,3±20,0
2 L. acidophilus 8281,4±718,6 6510,1±1302,4 5208,5±1302,3
3 E. faecium 8281,4±718,6 200,0±13,9 3041,0±216,9
4 E. cloacae 4883,2±976,3 6416,3±260,4 4883,9±976,3
Представленные в таблице данные свидетельствуют об относительно высокой резистентности всех исследуемых микроорганизмов, при этом наиболее высокие значения были зарегистрированы в отношении Penicilline у L. acidophilus и E. faecium, Ampicilline - L. acidophilus и E. cloacae, Oxacilline - L. acidophilus и E. cloacae.
Выводы. В ходе проведенных исследований с использованием тест систем было установлено, что наиболее устойчивым штаммом нормофлоры кишечника является E. coli который проявил выраженную чувствительность лишь в отношении Ticarcilline, Cefoxitine, Cefoperazone и Tetracycline. При этом наименее резистентным представителем кишечной микрофлоры является E. cloacae который помимо выше перечисленной общей резистентности выраженная устойчивость проявлялась в отношении Penicilline, Cefuroxime, Cefotaxime, Ceftazidime, Cefixime, Lincomycine, Colistine, Ticarcilline и Chloramphenikol.
Общая резистентность для всех исследуемых штаммов проявлялась в отношении Penicilline и Ampicilline (пенициллины); Cefuroxime, Cefotaxime, Ceftazidime, Cefixime (цефалоспорины); Lincomycine (линкозамиды); Colistine (полимиксины).
В экспериментах с применением диско-диффузиооного метода было установлено, что все исследуемые штаммы микроорганизмов проявили общую резистентность в отношении Penicilline, Ampicilline и Oxacilline. При этом наиболее чувствительным в отношении антибиотиков является E. cloacae, а L. acidophilus напротив наиболее устойчивый, что подтверждается данными полученным при проведении экспериментов с использованием метода серийных разведений.
Литература
1. Шендеров, Б.А. Антимикробные препараты и нормальная микрофлора. Проблемы и возможные пути их решения / Б. А. Шендеров // Антибиотики и химиотерапия. - 1988. -Т. 32. - №12. - С. 921-926.
2. Воробьев, А.А. Бактерии нормальной микрофлоры: биологические свойства и защитные функции / А.А. Воробьев, Е.А. Лыкова // Микробиология. - 1999. - №6. - С. 102105.
3. Ткаченко, А.Г. Адаптивные функции полиаминов Escherichia coli при сублетальных воздействиях антибиотиков / А. Г. Ткаченко, М. С. Шумков, А. В. Ахова // Микробиология. -2009. - Т. 78. - №1. - С. 32-41.
4. Никитин, А.В. Антибиотики и макроорганизм / А. В. Никитин // Антибиотики и химиотерапия. - 2000. - № 12. - С. 31-36.
5. Сизенцов, А.Н. Методы определения антибиотикопродуктивности и антибиотикорезистентности. Методические указания к лабораторному практикуму / А.Н. Сизенцов. - Оренбург. - 2009. - 107 с.
