CC BY
56
ISSN 2072-0920
NOVYE TEHNOLOGII (МАЖОР). 2020. 3(53)
СЕЛЬСКОХОЗЯЙСТВЕННЫЕ НАУКИ
ОТБОР НА ЗАСУХОУСТОЙЧИВОСТЬ СОМАТИЧЕСКИХ КЛОНОВ РАСТЕНИЙ ЧАЯ (CAMELLIA SINENSIS (L.) О. KUNTZE) В КУЛЬТУРЕ IN VITRO
Гвасалия Майя Валериановна, кандидат биологических наук, старший научный сотрудник отдела биотехнологии
Федеральное государственное бюджетное учреждение науки (Федерального исследовательского центра субтропического научного центра РАН), Сочи, Россия E-mail: m.v.gvasaliya@mail.ru
В статье представлены материалы исследований по отбору in vitro толерантных к засухе соматических клонов чая (Sc-4, Se-15, Sc-27, Sc-33), полученных unOyiniueii геммогенеза из каллу спой ткани. Осмотический стресс был смоделирован путем добавления в питательную среду полиэтиленгликоля (PEG-30,0 г/л). Изменения физиологических параметров при водном дефиците изучали по показателям относительной электропроводности и стабильности клеточных мембран, с использованием кондуктометра ST300C. Добавление PEG в питательную среду вызывало повышение электропроводности у всех изученных соматических клонов чая, за исключением Sc-27, у которого этот показатель был ниже по сравнению с контролем.
Стабильность клеточных мембран у Sc-27 была выше по сравнению с контролем. Эти данные свидетельствуют о низком уровне повреждения растительных тканей. Проведенный ПЦР анализ показал, что ген дегидрин 2 (DHN2), который является одним из главных генетических маркеров ответа растений на засуху, экспрессировался существенно выше у сомаклона Sc-27. По всем изученным параметрам соматический клон чая Sc-27 предварительно может быть отобран как засухоустойчивый генотип и использован в дальнейшей селекционной программе.
Ключевые слова: сомаклоны чая (Camellia sinensis (L.) Kuntze), осмотический стресс, полнэтиленглнколь (PEG), относительная электропроводность, стабильность клеточных мембран, экспрессия генов, ген дегидрин 2 (DHN2).
Для цитирования: Гвасалия М.В. Отбор на засухоустойчивость соматических клонов растений чая (CAMELLIA SINENSIS (L.) О. KUNTZE) в культуре IN VITRO // Новые технологии. 2020. Вып. 3(53). С. 117-124. DOI: 10.24411/ 2072-0920-2020-10313.
УДК 633.72+581.1:57
DOI: 10.24411/2072-0920-2020-10313
Гвасалия М.В.
<сс)
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2020. 3(53)
Gvasaliya M.V.
SELECTION FOR DRY RESISTANCE OF SOMATIC CLONES OF TEA PLANTS (iCAMELLIA SINENSIS (L.) O. KUNTZE) IN IN VITRO CULTURE
Gvasaliya Maya Valerianovna, Candidate of Biology, a senior researcher of the Department of Biotechnology
Federal State Budgetary Institution of Science (Federal Research Center of the Subtropical Scientific Center of the Russian Academy of Sciences), Sochi, Russia E-mail: m.v.gvasaliya@mail.ru
The article presents research materials on the selection of in vitro drought tolerant somatic tea clones (Sc-4, Sc-15, Sc-27, Sc-33) obtained by induction of hemogenesis from callus tissue. Osmotic stress was modeled by adding polyethylene glycol (PEG-30.0 g/l) to the growth medium. Changes in physiological parameters during water deficiency were studied by the relative electrical conductivity and stability of cell membranes using a ST300C conductometer.
The addition of PEG to the nutrient medium caused an increase in electrical conductivity in all studied somatic tea clones, with the exception of Sc-27, in which this indicator was lower compared to the control one.
The stability of cell membranes in Sc-27 was higher compared to the control one. These data indicate a low level of damage to plant tissue. PCR analysis showed that the dehydrin 2 (DHN2) gene, one of the main genetic markers of drought response of plants, was expressed significantly higher in somaclone Sc-27. For all the parameters studied the Sc-27 somatic tea clone can be preliminarily selected as a drought tolerant genotype and can be used in a further breeding program.
Key words: tea somaclones (Camellia sinensis (L.) Kuntze), osmotic stress, polyethylene glycol (PEG), relative conductivity, stability of cell membranes, gene expression, dehydrin 2 gene (DHN2).
For citation: Gvasaliya M.V. Selection for dry resistance of somatic clones of tea plants (iCamellia Sinensis L.) O. Kuntze) in in vitro culture // Novye Tehnologii (Majkop). 2020. Issue 3(53). P. 117-124. DOI: 10.24411/2072-0920-2020-10313.
Климатические изменения, связанные с глобальным потеплением, отрицательно влияют на устойчивость растений к абиотическим факторам окружающей среды. Влажные субтропики России отличаются неблагоприятным режимом влаго-обеспеченности и основным лимитирующим фактором здесь для возделывания культуры чая являются частые и продолжительные летние засухи [1, 2]. При дефиците влаги прекращается рост флешей, наблюдается массовое образование глухих непродуктивных побегов, активизируются генеративные процессы. Все это приводит
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2020. 3(53)
к сокращению сборов чайного листа и наступлению летнего периода покоя, что, в конечном счете, отрицательно сказывается на урожайности и качестве сырья. При наличии высокого адаптивного потенциала сорта, фазу летнего покоя, который обычно наблюдается в июне, можно свести к минимуму и снизить его последствия [3, 4, 5].
Использование биотехнологических подходов в селекции чая позволит повысить эффективность исследований при создании новых засухоустойчивых генотипов. В этом смысле, перспективным методом является клеточная селекция, которая направлена на отбор в культуре in vitro генотипов чая, с заранее заданными признаками [6, 7, 8, 9, 10].
Для моделирования действия осмотического стресса in vitro в питательную среду обычно вводится определенный селективный фактор, который представлен осмотически активными веществами, понижающими водный потенциал: маннитом, полиэтиленгликолем {PEG), абсцизовой кислотой (АБК), аналогами пролина [11, 12, 13, 14]. В нашей работе в результате скрининга будут получены новые генотипы растений, которые послужат ценным исходным материалом для дальнейших селекционных исследований.
Методы исследований
В качестве объектов исследований были выбраны соматические клоны растений чая (Sc-4, Sc-15, Sc-27, Sc-33), которые в течение 9 лет находились на субкультивировании in vitro и были получены индукцией геммогенеза из каллусной ткани. Манипуляции с пересадкой проводились в асептических условиях в ламинар-боксах. Базовой питательной средой служила модифицированная минеральная основа по прописи Мурасиге - Скуга (MC), с добавлением регуляторов роста: 6 - БАП - 3 мг/л + ГКз - 1,0 мл/л + мезоинозит - 100 мг/л. Культивировались сомаклоны в фитостат-ной, при соблюдении: фотопериода 16/8 час., температуры 25±1,0°С, влажности -70 %, освещенности 4000-5000 Лк (лампы О SRAM L 36 W/765).
В целях отбора сомаклонов чая по признаку устойчивости к водному дефициту в питательные среды был добавлен полиэтиленгликоль {PEG, с молекулярной массой 6000 - 30 г/л). Изучали относительную электропроводность и стабильность клеточных мембран с использованием кондуктометра.
Электропроводность измеряли портативным кондуктометром ST300C, датчик STCON3, с поверкой (Ohaus).
Проводили 4 замера показаний через 0, 60, 120 минут после погружения листьев, а также после кипячения растительной пробы в течение 60 минут. Относительную электропроводность раствора рассчитывали по формуле: REC = Ll/L2*100%, где LI- электропроводность через 0 мин, L2 - электропроводность в остывшем растворе после кипячения на водяной бане, в течение 1 часа при 100°С.
119
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2020. 3(53)
Лабораторные исследования проводили в 3-х аналитических повторностях. Выделение РНК из свежих листьев проводили с использованием наборов реагентов Лира (Биолабмикс, Новосибирск). Качество РНК оценивали методом электрофореза в 1 % агарозном геле, концентрацию РНК определяли на приборе BioDrop ja Lite (Serva). РНК разводили и обрабатывали ДНКазой. Для подтверждения отсутствия примесей геномной ДНК применяли метод qRT-PCR. Обратную транскрипцию проводили с использованием набора реагентов M-MuLV-RH (Биолабмикс, Новосибирск). Количественный анализ экспрессии генов методом ПЦР в реальном времени осуществляли на приборе LightCycler96 (Roche). ПЦР смесь готовили на основе наборов реагентов БиоМастер HS-qPCR SYBR Blue(2x), объем смеси 12,5 мкл, в которую входило по 0,5 мкл каждого праймера.
В исследовании использовали ген дегидрин 2 - DHN2 (главного генетического маркера ответа растений на засуху). Последовательность праймеров - F: CTTATG-GCACCGGCACTAC; R: TTCCTCCTCCCTCCTTGAC. В качестве референсного гена служил Actin с последовательностью праймеров - F: CCATCACCAGAATCCAAGAC; R: GAACCCGAAGGCGAATAGG.
Были созданы стандартные условия для проведения ПЦР анализа: температура отжига праймеров 40°С, 35 циклов амплификации, анализ экспрессии проводили в трех биологических повторностях, данные обрабатывали с помощью программного обеспечения LightCycler96. Относительный уровень экспрессии гена рассчитывали по алгоритму: 2" ч, где: ДДСс] = (Cqgene of interest С(\internal control) treatment ene of interest
internal control) control
Результаты исследований
Проведенные исследования показали, что при изучении физиологических параметров сомаклонов чая, наиболее доступным и информативным является кондук-тометрический метод, который может быть применен для отбора засухоустойчивых генотипов в культуре in vitro.
Использовалась селективная среда с полиэтиленгликолем (PEG) в концентрации (30 г/л). При добавлении PEG в питательную среду был индуцирован осмотический стресс, который регистрировался по повышению электропроводности тканей. Из четырех исследуемых сомаклонов у Sc-27 добавление PEG не приводило к увеличению электропроводности тканей листа по сравнению с контролем.
Стабильность клеточных мембран также у Sc-27 с PEG была выше по сравнению контролем. У всех остальных сомаклонов в варианте с PEG происходило увеличение электропроводности и снижение стабильности клеточных мембран, что свидетельствует о повреждении тканей, которое было вызвано действием осмотического стресса (рис. 1-2).
ISSN 2072-0920
NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2020. 3(53)
4к
4-PEG 115к 115-PEG i27k 127-PEG 33K
33-PEG
Рис. 1. Относительная электропроводность листьев сомаклонов чая (Sc-4, 15, 27, 33) при индукции осмотического стресса (с PEG) в сравнении с контролем (без PEG).
95,00
■ 4к
94.00 т
93,00 - т | 1 J "4-pEG
92,00- i I . I I "15K
91,00 fa ■ ■ ■ I Ш15-PEG
z J_______I III -
,C> Ф ,0 ^ ,6 ■ 27-PEG
<)V s? oV V # V
v4 л* ЗЗк
Рис. 2. Стабильность клеточных мембран листьев сомаклонов чая (Sc-4, 15, 27, 33) при индукции осмотического стресса (с PEG) в сравнении с контролем (без PEG).
Проведенный ПЦР анализ показал, что при водном дефиците, вызванном добавлением PEG в питательную среду, ген дегидрин 2 (DHN2), который является одним из главных генетических маркеров ответа растений на засуху, экспрессировался существенно выше у сомаклона Sc-27 (рис. 3).
Полученные показатели согласуются с данными по электропроводности тканей и стабильности клеточных мембран. Таким образом, можно предположить, что сомаклон Sc-27 (рис. 4) отличается высокой адаптивностью к водному дефициту, однако это требует дополнительного изучения и работа в этом направлении продолжается.
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (МАЖОР). 2020. 3(53)
60,00 DHN 2, ПЭГ
50,00 40,00 30,00 20.00 10,00 0,00
Sc4 Seil Sc 15 Sc27 Sc33
Рис. 3. Анализ уровня экспрессии гена дегидрин 2 у сомаклонов чая (Sc-4, 15, 27, 33) при водном дефиците, вызванном добавлением PEG
А В
Рис. 4. Соматический клон чая Sc-27 (А - в культуре in vitro; В - адаптированный к условиям ex vitro)
Проведенные исследования позволили установить, что при индукции осмотического стресса путем добавления PEG в питательную среду, у сомаклона Sc-27 не происходило увеличения электропроводности тканей листа по сравнению с контролем, а значит и не было повреждения тканей. Среди изученных сомаклонов, только Sc-27 в большей степени продемонстрировал стабильность клеточных мембран при водном дефиците. Проведенный ПЦР анализ показал, что ген дегидрин 2 (DHN2y экспрессировался существенно выше у сомаклона Sc-27, что может характеризовать его как более засухоустойчивый генотип.
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (МАЖОР). 2020. 3(53)
Литература:
1. Рындин А.В., Туов М.Т. Культивирование чая в субтропиках России // Наука Кубани. 2006. №4. С. 28-32.
2. Туов М.Т. Биология, селекция и современный сортимент чая в России // Субтропическое и декоративное садоводство. 2012. №46. С. 114-122.
3. Туов М.Т. Селекция, интродукция и сортоизучение чая в субтропиках России // Субтропические культуры. 2010. №1-4. С. 38-42.
4. Туов М.Т., Рындин А.В. Итоги изучения перспективных гибридов чая в субтропиках Российской Федерации // Субтропическое и декоративное садоводство 2011. №44. С.101-109.
5. Гвасалия М.В. Спонтанные и индуцированные сорта и формы чая (Camellia sinensis (L.) Kuntze) во влажных субтропиках России и Абхазии, перспективы их размножения и сохранения в культуре in vitro: дис. ... канд. биол. наук. Краснодар, 2015. 159 с.
6 Игнатова С.А. Клеточные технологии в растениеводстве, генетике и селекции возделываемых растений: задачи, возможности, разработки систем in vitro. Одесса: Астропринт, 2011. 224 с.
7. Karunatne Seetha, Sunil Santha, Kovoor A. An in vitro assay for drought tolerant coconut ger plasmi // Euphytica. 1991. №53(1). P. 25-30
8. Егорова H.A., Ставцева И.В. Биотехнологические приемы получения форм шалфея, устойчивых к осмотическому стрессу in vitro II Экосистемы, их оптимизация и охрана. 2013. №8. С. 93-100.
9. Кунах В.А. Эволюция клеточных популяций in vitro: особенности, механизмы, движущие силы и следствия // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: сборник тезисов X международной конференции. Казань, 2013. 47 с.
10. Тимофеева О.А. Биотехнологические подходы к созданию новых форм растений: учебное пособие. Казань, 2006. С. 46-48.
11. In vitro selection and characterization of drought tolerant somaclones of tropical maize (Zea mays L.) / Matheka J.M. [et al] // Biotechnology. 2008. №7(4). P. 641-650.
12. Dobranszki J., Iszaly-Toth J., Hudak I. Effect of osmotic stress on in vitro shoot culture of peas (Pimm sativum) / Tabori K M. [et al] // Acta. Hort. (ISHS). 2009. №812. P. 231-236.
13. Влияние стрессов на генетическую изменчивость культивируемых тканей растений / Долгих Ю.И. [и др.] // Биология клеток растений in vitro и биотехнология: сборник тезисов X международной конференции. Казань, 2013. 64 с.
14. Developing stress tolerant plants through in vitro selection - An overview of the recent progress / Rai M.K. [et al] // Environ. Exp. Bot. 2011. №71. P. 89-98
ISSN 2072-0920 NOVYE TEHNOLOGII (MAJKOP). 2020. 3(53)
Literature:
1. Ryndin A.V., Tuov M.T. The cultivation of tea in the subtropics of Russia // Science of the Kuban. 2006. No. 4. P. 28-32.
2. Tuov M.T. Biology, selection and modern assortment of tea in Russia // Subtropical and ornamental gardening. 2012. No. 46. P. 114-122.
3. Tuov M.T. Selection, introduction and variety study of tea in the subtropics of Russia// Subtropical cultures. 2010. No. 1-4. P. 38-42.
4. Tuov M.T., Ryndin A.V. Results of the study of promising tea hybrids in the subtropics of the Russian Federation // Subtropical and ornamental gardening. 2011. No. 44. P.101-109.
5. Gvasaliya M.V. Spontaneous and induced varieties and forms of tea (Camellia sinensis (L.) Kuntze) in the moist subtropics of Russia and Abkhazia, prospects for their propagation and preservation in vitro culture: dis. ... Cand. of Biology. Krasnodar, 2015. 159 p.
6. Ignatova S.A. Cell technologies in crop production, genetics and breeding of cultivated plants: tasks, opportunities, development of in vitro systems. Odessa: Astroprint, 2011. 224 p.
7. Karunatne Seetha, Sunil Santha, Kovoor A. An in vitro assay for drought tolerant coconut ger plasmi // Euphytica. 1991. No. 53(1). R. 25-30.
8. Egorova N.A., Stavtseva I.V. Biotechnological methods for obtaining forms of sage resistant to osmotic stress in vitro II Ecosystems, their optimization and protection. 2013. No. 8. P. 93-100.
9. Kunakh V.A. In vitro evolution of cell populations: features, mechanisms, driving forces, and consequences // In vitro plant cell Biology and Biotechnology: abstract of the Xth International Conference. Kazan, 2013. 47 p.
10. Timofeeva O.A. Biotechnological approaches to the creation of new forms of plants: a training manual. Kazan, 2006. P. 46-48.
11 .In vitro selection and characterization of drought tolerant somaclones of tropical maize (Zea mays L.) / Matheka J.M. [et al] // Biotechnology. 2008. No. 7 (4). P. 641-650.
12. Dobranszki J., Iszaly-Toth J., Hudak I. Effect of osmotic stress on in vitro shoot culture of peas (Visum sativum) / Tabori K M. [et al] // Acta. Hort. (ISHS). 2009. No. 812. P. 231-236.
13. The effect of stress on the genetic variation of cultivated plant tissues / Dolgikh Yu.I. [et al.] // Biology of in vitro plant cells and biotechnology: collection of abstracts of the X international conference. Kazan, 2013. 64 p.
14. Developing stress tolerant plants through in vitro selection - An overview of the recent progress / Rai M.K. [et al] // Environ. Exp. Bot. 2011. No. 71. P. 89-98.
