CC BY
52УДК 615.91 : 004.94
От моделей на животных к альтернативным моделям в токсикологии
Каркищенко Н.Н.
Научный центр биомедицинских технологий РАМН, Москва
аны генетически обусловленные и экспериментальные модели для оценки острой и хронической токсичности фармакологических веществ и ксенобиотиков. Приводятся стандартизованные и альтернативные модели оценки токсичности,
альтернативные батареи тестов и основные стратегии и подходы к компьютерному моделированию токсичности. Оценивается использование в токсикологии мини-свиней как альтернативы собакам, приматам и другим не-грызу-нам.
Ключевые слова: токсикологические in vitro и in vivo тесты, клеточные и компьютерные модели токсичности, токсикокинетика, токсикогеномика, токсико-протеомика.
В токсикологических исследованиях комплексная оценка химических рисков основывается на предположении, что эффект, наблюдаемый на лабораторных животных, будет наблюдаться и у человека. Однако этические нормы и концепции защиты животных, выдвигаемые в последние 20 лет, также как и текущие изменения регулирования охраны окружающей среды делают очевидным необходимость поиска новых подходов [2, 3, 11, 12]. Очевидно, что необходима постепенная замена тестов на животных для оценки безопасности химических средств и продуктов.
Выбор животных-моделей для исследований и особенно оценки токсического воздействия различных факторов физического, химического или биологического генеза является ключевой проблемой при планировании, проведении и анализе результатов. Наиболее важными и приемлемыми являются биомодели БРБ-животных для исследований, полученных с помощью генетических подходов в создании инбредных, гибридных, конгенных, мутантных, трансгенных, нокаутных и иных линий. Экспериментатор должен руководствоваться собственными целями и задачами при выборе той или иной альтер-
нативной модели или биомодели животного [1].
Определяющим принципом при оценке острой токсичности является минимизация количества животных. Прием оценки LD50 в соответствии с Системой глобальной гармонизации, предусматривает лишь интервалы достоверности, ранжирования и классификации субстанции. Базовым же методом является процедура фиксированной дозы, с общепринятым обозначением TG 420 (Test Guideline), для условий перорального введения веществ [2, 10, 12].
В соответствии с тестом TG 420 в исследование включают группы животных, предпочтительно одного пола, обычно самок, получающих дозы препарата, в ступенчатой процедуре. Предпочтительный вид грызунов - крыса. Используются фиксированные дозы по 5, 50, 300 и 2000 мг/кг, а в отдельных случаях может быть исследована доза в 5000 мг/кг. Процедура продолжается до тех пор, пока не будет определена доза, вызывающая отравление [13, 15]. Животные наблюдаются ежедневно в течение 14 дней. Обязательным условием должно быть проведение патоморфологических исследований.
Программа OECD (Organization for Economic Coopera-
tion and Development) обеспечивает механизм развития новых или обновления существующих Руководств по использованию тестов (Test Guideline). OECD TG широко используется мировым научным сообществом и признана авторитетами в странах-членах OECD и не-членах OECD. Совместное совещание Химического Комитета с Рабочей группой по химикатам, пестицидам и биотехнологии выработало политику по дальнейшему улучшению TG. В ее основу положены клеточные и компьютерные технологии.
Ценность альтернативных (клеточных, квантово-механических, компьютерных и т.д.) моделей будет заключаться не только или не столько в их способности замены животных, сколько в получении максимально полной информации о токсичности веществ до их исследования на животных. Современные альтернативные методы компьютерного моделирования позволили разработать программы для прогноза ожидаемой токсичности, а также эффектов воздействия на здоровье человека. Эти компьютерные программы получили обобщенное название модели количественных соотношений между структурой и активностью (Quantitative Structure-Activity
Relationship - QSAR models). Например, модель ТОРКАТ для изучения на крысах перо-ральных препаратов содержит 19 моделей QSAR, данные из этих моделей были получены для обработки экспериментальных данных по летальным дозам (LD50) на основе оценки 4000 химических веществ.
Одной из основных проблем альтернативного моделирования является выбор правильной стратегии тестирования для новых химических веществ, по которым еще нет данных о потенциальной токсичности их молекул. В этом случае возможно наряду с компьютерным моделированием использование нескольких параллельных исследований на клеточных культурах, которые условились обозначать как батарею тестов, которая представляет собой мультиме-тодическое использование серии тестов, проводимых обычно в одно и то же время или в тесной связи друг с другом. Каждый тест внутри последовательности строится для получения дополнительной информации от предыдущего и для измерения различий дополнительного многофакторного токсического эффекта.
В соответствии с рекомендациями Агентства по защите окружающей среды США (Environmental Protection Agency) были предложены альтернативные тесты по оценке острой токсичности на рыбах, икре рыб, in silico. ECVAM валидировала использование эмбриональных стволовых клеток для эмбриотоксич-ности, а также использования культуральных клеток животных и человека. Тест эмбриональных стволовых клеток (EST) валидированный EC-VAM как тест для выявления эмбриотоксичности - определяет критические параметры и наличие развивающейся токсичности [6]. Тест использует стволовые клетки крыс, которые помещены в культу-
ру и обладают способностью к дифференцированию. Тест идеально подходит для немедленного использования как меры уменьшения на скринин-говом уровне программы типа EPA's HPV Challenge - где химические вещества, которые получили положительную оценку в тесте на эмбриоток-сичность, должны быть классифицированы как вероятно развивающие токсичность без продолжения тестирования другими методами.
Предлагаются методы оценки острой системной токсичности in vitro с использованием обычных кератиноцитов человека NHK и клеточных линий фибробластов мышей Balb/c 3T3 для немедленного использования как снижающая мера для вычисления стартовой дозы in vivo [8, 18]. Вследствие этого возможно снижение использования животных на 40% [16]. Этот тест используется нами для скрининга наноинже-нерных соединений [4, 5].
Альтернативные подходы для достижения полной замены животных моделями систем в области токсикокинетики, токсикопротеомики, токсико-геномики и т.д. предполагают расшифровку механизмов генотоксичности и мутагенеза, которые должны помочь в развитии подходящих моделей in vitro. Прогресс будет зависеть от ряда факторов, таких как развитие тестов in vitro в области токсикокинетики и метаболизма, развитие тестов in vitro для исследований годности лекарств, дальнейший прогресс в области токсикоге-номики. Гибкий подход к тестам in vivo, уже сегодня может способствовать снижению количества используемых в тестах животных. Оценка некоторых тестов in vitro и замена исследований подострой токсичности на животных уже происходит [7, 9, 14].
Хотя некоторые тесты in vitro поддержаны в настоящее время в качестве допустимых
для оценки генотоксичности и мутагенеза при воздействии химическими веществами, они имеют ряд ограничений, таких как недостаточная способность, быть похожими на метаболизм человека, токси-кокинетику, супер чувствительность ситуациям in vivo.
Использование линий клеток далеко не всегда соответствует изучаемым целевым органам. По этим причинам разрабатывается новая стратегия тестирования, состоящая из четырех стадий. На стадии 1 оценивается изучаемая субстанция на основе существующих данных и знаний, главным образом, на основе существующей информации об изучаемых химических веществах. На стадии 2 проводится батарея тестов in vitro для определения рисков. Стадия 3 включает моделирование цели системы in vitro, но моделирование проводится в тех ситуациях, когда один или большее число тестов на стадии - 2 дали положительный результат. Стадия 4 включает тесты на животных, когда один или большее число тестов на стадии - 3 дали положительный результат.
Странами-членами OECD в июне 2004 г. предложена процедура фиксированной дозы TG 433 как альтернатива оценки острой ингаляционной токсичности по методу TG 403. Различие между TG 403 и новым тестом TG 433 заключается в том, что процедура фиксированной дозы применяется позже со стратегией аналогичной используемой в TG 420. В комбинации с использованием появления симптомов отравления как точки окончания тестирования вместо летального исхода были достигнуты значительные улучшения, касающиеся минимизации страданий животных и уменьшения использования лабораторных животных в эксперименте.
Современные требования биоэтики и соблюдения принципов 3R определяют целе-
вые направления выбора негрызунов. В наших работах в эксперименте используют светлогорских мини-свиней, полученных в Центре РАМН путем отдаленной гибридизации свиней породы ландрас, вьетнамской породы Й и диких кабанов европейского и азиатского происхождения. В токсикологии мини-свиньи становятся весьма популярными в исследованиях для замещения собак и приматов. Мини-свиньи высоко чувствительны к лекарствам и химическим веществам. Они могут быть использованы в процедурах наблюдения, администрирования, для исследований метаболизма или в фармакологических целях, так как имеют преимущества по сравнению с традиционными видами негрызунов относительно специфического отклика на определенные классы веществ. Они также являются доступными высоко-качественными БРБ линиями животных.
Фармакокинетические исследования легко проводятся на мини-свиньях с повторяющимся забором образцов крови или образцов других видов жидкостей из тела или тканей. Цитохром Р450 - метаболический образец печени - был широко изучен и сравнен с цитохромом человека, а в нашем Центре показана общность функционирования у них К-ацетилтрансферазы и других ферментов.
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ
1. Каркищенко Н.Н. Основы биомоделирования. М., Изд-во ВПК, 2004.
2. Каркищенко Н.Н. Альтернативы биомедицины. Т.1. Основы биомедицины и фармако-моделирования. - М.: Изд-во ВПК, 2007.
3. Каркищенко Н.Н. Альтернативы биомедицины. Т.2. Классика и альтернативы фармакотоксикологии. - М.: Изд-во ВПК, 2007.
4. Каркищенко Н.Н. Нанобезопас-ность: новые подходы к оценке рисков и токсичности наноматериалов // Биомедицина, № 1, 2009, с. 5-27.
5. Каркищенко Н.Н. Наноинженер-ные лекарства: новые биомедицинские инициативы в фармакологии // Биоме-
Светлогорские мини-свиньи свободны от патогенных бактериальных инфекций или вирусных болезней, а также свободны от любых паразитарных болезней. Мини-свиньи могут быть альтернативным видом в тератогенетических и репродуктивных исследованиях, когда традиционные виды, такие как мыши, крысы, кролики, являются неподходящими.
Мини-свиньи как модели в тестах на токсичность фармацевтических и других химических веществ в настоящее время приняты в Японии, ЕС и США [17]. Свиньи и мини-свиньи упоминаются особо как потенциальный вид негрызунов в руководствах Японии и Канады. Мини-свиньи внесены в руководство OECD 409. Содержание мини-свиней требует закрытой барьерной системы. В нашем Центре они выращиваются в определенных условиях, которые дают в результате необходимый иммунологический статус [1, 3].
Разработанные методы на альтернативных или животных моделях используются сегодня на всех исследовательских уровнях, но ни один не может быть назван идеальным для оценки любой цели определения системной токсичности. Необходимы попытки оптимизации моделей in vitro в тех случаях, когда имеется несколько моделей, например, для ЦНС, легких, печени и т.д. В общем случае рекомендует-
Ai^MHa, № 2, 2009, c. 5-27.
6. Genshow E., Spielmann H., Scholz G., Seiler A., Brown N., Piersma A., Brady M., Clemann N.,Huuskonen H., Paillard F., Brmer S., Becker K. (2002) The ECVAM international validation study on in vitro embryotoxicity tests: results of the definitive phase and evaluation of prediction models // ATLA 30, 151-176.
7. ICCVAM (2001). Report of the International Workshop on In Vitro Methods for Assessing Acute Systemic Toxicity, NIH Publication No. 01-4499, 370pp. Research Trianglee Park. NC. USA: NIEHS. Website http://iccvam. niehs.nih.gov/methods/invidocs/finalall. pdf (Accessed 10.2.05).
ся провести дополнительное исследование для обеспечения лучшего понимания, например, патогенезиса процесса. Дополнительные попытки необходимы и для оценки NOEL (No Observable Adverse Effect Level) отсутствия у рассмотренных уровней побочных эффектов in vitro. Требуется большое число исследований и подтверждений оценок применения подходов моделей QSAR для установления хронической токсичности и для включения их в батарею тестов и стратегию рядов. Для валидации существующих и вновь разработанных альтернативных моделей понадобится, по-видимому, не менее 15-20 лет, а достижение полной замены животных в регулярных тестах и стратегиях зависит от уровня исследований, адекватной расстановки приоритетов, попыток установления и координации действий ученых разных стран [19].
Дальнейший прогресс токсикологии будет определяться, в том числе, на основе единой технологической платформы, содержащей гармонизированные с международными стандартами требования к использованию в неклинических исследованиях качественных животных и валидированных альтернативных моделей, соответствует принципам надлежащей лабораторной практики (GLP).
8. Liebsch M., Curren R., Fentem J. (2001). Guidance Document on Using In Vitro Data to Estimate In Vivo Starting Doses for Acute Toxicity. NIH Publication 01-4500. Web site http//iccvam.niehs. nih.gov/methods/invidocs/guidance/ iv_guide.pdf. Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences (Accessed 8.10.02).
9. Nicholson A., Sandler J., Seidle An evaluation of the US High Production Volume (HPV) Chemical-testing Programme: A Study in (Ir)Relevance, Redundancy and Retro Thinking // ATLA 32, Suppl. 1A, 335-341, 2004.
OECD (1987). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 401: Acute
Oral Toxicity (Deleted in 2002), 7pp. Paris, France: Organization for Economic Cooperation and Development.
11. OECD (2000). Environmental Health and Safety Monograph Series on Testing and Assessment No. 19: Guidance Document on the Recognition Assessment and Use of Clinical Signs as Human Endpoints for Experimental Animals Used in Safety Evaluation, 39pp. Paris, France: Organization for Economic Cooperation and Development.
12. OECD (2001). OECD Guidelines for the Testing of Chemicals No. 420: Acute Oral Toxicity - Fixed Dose Procedure, 14pp. Paris, France: Organization for Economic Cooperation and Development.
13. OECD (2001). OECD Guidelines for
the Testing of Chemicals No. 425: Acute Oral Toxicity - Up-and-Down Procedure, 26pp. Paris, France: Organization for Economic Cooperation and Development.
13. OECD Guidelines for the testing of Chemicals. ATLA 33, Suppl. 1, 223-227, 2005.
14. Organization for Economic Cooperation and Development (2002). OECD Guidelines for the testing of Chemicals. Paris, France: OECD.
15. Spielmann H., Genshow E., Liebbsch M., Halle W. (1999) Determination he starting dose for acute oral toxicity (LD50) testing in the Up and Down Procedure (UDP) from cytotoxicity data. ATLA 27, 957-966.
16. Sveden O. 3RD European
congress of toxicologic pathology, 2005, Copengagen, Denmark.
17. US National Toxicology Program Interagency Committee for the Evaluation of Alternative Toxicological Methods (2001). Report of the International Workshop on In Vitro Methods for Assessing Acute Systemic Toxicity, 389pp. NIH Publication 01-4499. Web site http//iccvam.niehs. nih.gov/methods/invidocs/guidance/iv_ guide.htm. Research Triangle Park, NC, USA: National Institute of Environmental Health Sciences (Accessed 8.10.02).
18. Zuang V., Alonso M.A., Botham P.A., Eskes C., Fentem J., Liebsch M., Johannes J.M. van de Sandt Skin Irritation and Corrosion. ATLA 33, Suppl. 1, 35-46, 2005.
Karkishchenko N.N.
From animal models to alternative models in toxicology
Scientific Center for Biomedical Technologies, Russian Academy of Medical Sciences, Moscow
Genetics- based and experimental models are presented for assessment of acute and chronic toxicity of .pharmacologic substances and xenobiotics. Standard and alternative models to assess toxicity, battery of alternative tests and main strategies and approaches to a computerized toxicity modeling are set forth. The use of mini-pigs as alternatives to dogs, apes and other non-rodents in toxicology is assessed.
Материал поступил в редакцию 21.04 2010 г.
УДК 615.9 : 632.95.029.391
Токсикология пестицидов
Изложены основные направления исследований токсикологии пестицидов, заключающиеся в выявлении приоритетных загрязнителей окружающей среды, изучении комбиниро-
ванного действия пестицидов с металлами, установлении особенностей комплексного (ингаляционного и дермаль-ного) поступления пестицидов в организм, оценки риска для человека, оценки новых пре-
Ракитский В.Н.
НИИ гигиены, токсикологии пестицидов и химической безопасности ФГУН ФНЦГ им. Ф.Ф.Эрисмана, Москва
паратов в наноформе, особенностей поведения пестицидов при применении для обработки генетически модифицированных культур.
Ключевые слова: токсикология, пестициды
Пестициды, химические средства защиты во всем мире рассматриваются как лекарства для растений и с токсикологических позиций оцениваются наиболее строго в силу их особенностей: преднамеренность внесения в окружающую среду, непредотвратимость циркуляции в среде обитания, возможность контакта с остаточными количествами пестицидов больших масс населе-
ния, высокая биологическая активность. В связи с этим, во всех странах новые пестициды подлежат обязательной государственной регистрации. При этом регистрационные требования по вопросам безопасности из года в год усложняются путем постоянного совершенствования научно-методических подходов их изучения по различным аспектам гигиены применения, токсикологии,
классификации опасности, оценки риска для работающих и населения и др. (ШТОХ-2003, 2007; ШРЛС-2006; БиИОТОХ 2005, 2006 и др.). Необходимо отметить, что отечественная гигиена и токсикология пестицидов также продолжает активно развиваться, широко обсуждая свои научные результаты не только в нашей стране, но и за рубежом. Хотелось бы остановиться на ос-
