CC BY
25
Ярных Татьяна Григорьевна, доктор фармацевтических наук, профессор, кафедра технологии лекарств Национальный фармацевтический университет, ул. Пушкинская, 53, г. Харьков, Украина, 61002
Чушенко Валентина Николаевна, кандидат фармацевтических наук, доцент, кафедра технологии лекарств, Национальный фармацевтический университет, ул. Пушкинская, 53, г. Харьков, Украина, 61002 E-mail: chushenkov@rambler.ru
Пушок Снежана Николаевна, Национальный фармацевтический университет, ул. Пушкинская, 53, г. Харьков, Украина, 61002 E-mail: skiter.snezhana@mail.ru
УДК: 615.322: 615.072: 582.951.4 DOI: 10.15587/2313-8416.2015.56940
ОСОБЛИВОСТ1 ВИЗНАЧЕННЯ ТРОПАНОВИХ АЛКАЛО1Д1В У ЛИСТ1 ДУРМАНУ ЗВИЧАЙНОГО
© В. А. Мщенко, Ю. С. Прокопенко
Питання пошуку, до^дження фармакологiчноi axmuenocmi та стандартизаци лкарсько'1 рослинно'1' си-ровини для втчизняно'1' фармацевтично'1' науки i практики е актуальним та своечасним. З 2000 року одним з пунктiв Плану дш is забезпечення ттеграцИ Украши до Свропейського союзу е розробка Державно '1' Фармакопе'1' Украши, що гармонизована з Свропейською Фармакопеею (€Ф).
Мета: Здшснення порiвняльного аналiзу сировини за методиками визначення вмiсту тропанових алка-ло'1^в, описаних у монографи СФ «Stramonium leaf» та фармакопейтй статтi ГФ XI «Листья дурмана».
Методи: Для здшснення експериментального до^дження були заготовлен зразки листя дурману у 2010-2012 рр. у ргзних областях Украши. Iдентифiкацiю тропанових алкало'1^в у сировинi здшснювали методом тонкошарово'1' хроматографа (ТШХ) та за допомогою якiсноi реакци Вiталi-Морена. За методикою iдентифiкацii за СФ для обробки пластин використовували реактив Драгендорфа з подальшим обприскуванням пластинки розчином натрiю нтриту. Юльюсне визначення вмiсту суми алкало'1^в проводили методом алкалiметрii зi встановленням точки еквiвалентностi за допомогою тдикатору. Результати: Проаналiзовано показники якостi листя дурману та 1'х нормування, що визначаються мо-нографiею СФ «Stramonium leaf» та фармакопейною статтею ГФ XI «Листья дурмана», встановлено певнi вiдмiнностi щодо регламентованих показниюв якостi сировини. Здшснено порiвняльний анализ сировини за методиками визначення вмiсту тропанових алкало'1^в, описаних у даних нормативних документах. При яюсному визначеннi алкало'1^в у сировинi методом ТШХ тсля обробки пластин розчином натрт нтриту спостер^али забарвлення зон, що вiдповiдали гiосцiамiну, у червоно-коричневий колiр. Зони, що вiдповiдали скополамту, характеризувались менш iнтенсивним забарвленням. За результатами кшьюсного визначення було встановлено, що вмкт суми алкало'1^в в усiх анал1зованих зразках листя дурману звичайного знаходився у межах норм, регламентованих СФ та ГФ XI - не менше 0,25 % у пере-рахунку на атротн.
Висновки: Проаналiзувавши методики юльюсного визначення тропанових алкалоiдiв у листi дурману, наведен у монографи СФ «Stramonium leaf» та фармакопейтй статтi ГФ XI «Листья дурмана», встановлено певш вiдмiнностi у Их пробопiдготовцi, проте обидвi методики дозволяють визначити вмiст суми алкалоiдiв у зразках листя дурману звичайного. Отримаш дан експериментального до^дження е актуальними та були використан при розробц монографи ДФУ «Дурману листя»
Ключовi слова: стандартизацiя, монографiя, лкарська рослинна сировина, дурман звичайний, алкало'1'ди групи тропану
The questions of the search, pharmacological activity and standardization of natural extracts are appropriate and important for national pharmaceutical science and practice. Since 2000, one of the key points of the Action Plan to ensure the integration of Ukraine into the European Union is development of the State Pharmacopoeia of Ukraine harmonized with the European Pharmacopoeia (PhEur).
Aim: A comparative analysis of herbal material according to the methods for tropane group alkaloids determination, as described in the PhEur and in the 11th Edition of USSR Pharmacopoeia Monographs «Stramo-nium leaf».
Methods: Datura leaves samples have been harvested during 2010-2012 in different regions of Ukraine for experimental research. Identification of tropane group alkaloids was carried out by the method of thin-layer chro-matography (TLC) and by Vitali-Morin colour reaction. According to the PhEur method, firstly Dragendorff reagent and then Sodium nitrite solutions were used for the TLC plates spraying. Alkaloids assay was carried out by alkalimetry method with indicator determination of equivalence point.
Results: Datura leaves qualitative features, defined by PhEur and the 11th Edition of USSR Pharmacopoeia Monographs «Stramonium leaf», as well as their rationing have been analyzed. Certain differences concerning regulated quality parameters of herbal material have been determined. A comparative analysis of the natural extracts by described in the given normative documents methods for determination of tropane group alkaloids content has been done. After spraying the TLC plates with Sodium nitrite solution, red-brown zones corresponding Hyoscyamine were determined. Hyoscine zones were characterized by less intense color. As a result of quantitative determination it was determined that the alkaloids content in analyzed Datura leaves samples was within the limits regulated by the PhEur and the 11th Edition of USSR Pharmacopoeia - more than 0,25 % calculated as atropine.
Conclusion: Having analyzed the assay methods, described in the PhEur and the 11th Edition of USSR Pharmacopoeia Monographs «Stramonium leaf», applied for the determination of tropane group alkaloids in Datura leaves, certain differences in tests preparation were determined. Nevertheless, both of the methods allow determination of tropane group alkaloids content in Datura leaves samples. The obtained experimental data are relevant and were considered when developing the State Pharmacopoeia of Ukraine Monograph «Stramonium leaf» Keywords: standardization, monograph, natural extracts, Datura stramonium, tropane group of alkaloids
1. Вступ
Зростаюча потреба у фгготерапевтичних лжарських засобах приводить до збшьшення обсяпв загопвт лжарсько! рослинно! сировини, що посту-пово може привести до зменшення природних запаав рослинних ресурав та його нерацюнального викори-стання. Тому для вгтчизняно! фармацевтично! науки i практики питания пошуку, дослщження фармако-лопчно! активносп та стандартизаци лжарсько! рослинно! сировини е актуальним та своечасним. На сьогодтшнш день одним з найважливших завдань е створення едино! державно! законодавчо! бази з контролю якосп лжарсько! рослинно! сировини. З 2000 року одним з пункпв Плану дш iз забезпечення штеграцд Укра!ни до £вропейського союзу е розроб-ка Державно! Фармакопе! Укра!ни, що гармошзована з £вропейською Фармакопеею [1].
2. Постановка проблеми у загальному ви-гляд^ актуальшсть теми та li зв'язок i3 важливи-ми науковими чи практичними питаннями
Актуальним завданням сучасно! фармацевтично! науки е розробка та введення монографш на лжарську рослинну сировину вщповщно до вимог Свропейсько! Фармакопе! [2]. На сьогодшшнш день рослини родини пасльонових активно дослщжуються та застосовуються як у народнш, так i офщшнш ме-дицинi. У фармацевтичнiй галузi кра!н свiту пред-ставники пасльонових е офщшальними та застосовуються рослини родiв Atropa - беладона лiкарська (Atropa belladonna L.), Datura - дурман звичайний (Datura stramonium L.), Hyoscyamus - блекота чорна (Hyoscyamus niger L.), Capsicum - перець однорiчний (Capsicum annuum L.), Solanum - пасльон солодко-пркий (Solanum dulcamara L.). В залежносп вiд дози, рослини, що мютять тропановi алкало!ди, здатнi по-рiзному впливати на центральну нервову систему людини [3]. Враховуючи вищенаведене, встановлен-ня об'ективних параметрiв стандартизацi! рослин родини пасльонових, зокрема, дурману звичайного, що дозволяють контролювати як1сть дано! сировини,
е вельми актуальним завданням як у теоретичному, так i у практичному плаш.
3. Аналiз останнiх дослщжень i публiкацiй, в яких започатковано розв'язання дано! проблеми
Ведомо, що рвд Дурман родини Пасльонових нараховуе близько 13 видiв, розповсюджених у помiрних та степових зонах [1-3]. Як лжарську рослинну сировину традицшно використовують дурман звичайний (Datura stramonium L.). Офiцiнальною си-ровиною в Укра!ш та iнших кра!нах е листя дурману [4-6]. Яшсть листя дурману регламентуеться вимо-гами фармакопейно! статтi ГФ XI «Листья дурмана» та монографiею £Ф «Stramonium leaf», яш мають певнi ввдмшносл щодо показник1в якостi сировини, методик !х визначення та нормування [4, 7].
4. Видшення мевир1шеми\ рашше частин загально! проблеми, якiй присвячена стаття
У статп представленi результати порiвняль-ного аналiзу лiкарсько! рослинно! сировини листя дурману звичайного за вмютом тропанових алка-ло!дiв з використанням методик, описаних у моно-графi! £Ф «Stramonium leaf» та статп ГФ XI «Листья дурмана».
5. Формулювання цiлей статтi
Метою нашо! роботи було здiйснення порiв-няльного аналiзу сировини за методиками визначення вмюту тропанових алкало!дiв, описаних у моно-графi!' £Ф «Stramonium leaf» та фармакопейнш статтi ГФ XI «Листья дурмана».
6. Виклад основного матерiалу дослiдження з обгрунтуванням отриманих результатiв
Для здiйснення поставленого завдання були заготовленi зразки листя дурману у 2010-2012 рр. у рiзних областях Укра!ни.
У монографп £Ф та фармакопейнiй статтi ГФ XI описаний один вид сировини - Datura stramonium L. При цьому спостержаються вщмшносл при
регламентованш загот1вл1 ЛРС: у вщповвдносп до вимог £Ф, збирають листя дурману або верх1вки па-гошв рослини, як1 можуть мютити сумш Î3 листя з квитами або зрщка з плодами. Стаття ГФ XI регла-ментуе загопвлю листя дурману у перюд ввд початку цвтння до закшчення плодоносшня.
За вимогами ГФ XI, щентифшащю листя дурману проводять лише за макро- та мжроскошчними ознаками, проте у примищ до статл в якост! реко-мендацл вказано, що при вмюп алкалощв б1льше шж 0,25 % для приготування препарапв листя дурману слад брати у меншш шлькост! [7]. Тобто вден-тифжащя алкалощв у сировиш взагал1 не регламен-туеться.
У монографп £Ф «Stramonium leaf» щенти-фжацш алкалощв в сировиш проводять методом ТШХ та за допомогою яшсно! реакцп за нижченаве-деними методиками [4].
Для здшснення вдентифжацп за реакшею Вггал^Морена алкало!ди екстрагували з листя дурману звичайного розчином арчано! кислоти, попм додавали розчин ашаку до лужно! реакцп та екстрагували хлороформом. Сухий залишок шсля випа-рювання хлороформу обробляли ниратною кислотою, в результат! чого ввдбувалось азотитрування фешльного фрагменту тропово! кислоти. Отриманий розчин випарювали до суху, в результат! чого утво-рювався жовтий осад, що складався з 4'-н!троатроп!н нирату та 4'-н!тро-атропам!ну. П!сля додавання лугу (калш г!дроксиду розчин) ц! сполуки утворювали ф!олетов! ан!онн! комплекси.
При яшсному визначенн! алкало!д!в у сировиш методом ТШХ випробовуваний розчин готують шляхом екстракци спочатку арчаною кислотою, пот!м, п!сля додавання ашаку концентрованого, - шляхом екстракцй' еф!ром, в!льним в1д пероксид!в. Отриман! шари еф!ру висушують над натр!ю сульфатом без-водним, ф!льтрують, випарюють до суху на водянш бан!. Одержаний залишок розчиняють у 0,5 мл метанолу. Хроматографують у систем! розчиннишв: розчин ам!аку концентрований - вода - ацетон (3:7:90).
Розчин пор!вняння готують з розчишв стан-дартних речовин атроп!ну та скополашну [4]. При чому !х к!льк!сне сп!вв!дношення у розчин! пор!в-няння в!дпов1дае к!льк!сному сп!вв1дношенню алка-ло!д!в у лист! дурману звичайного. Такий п!дх1д доз-воляе не пльки проводити 1дентиф!кац!ю алкало!д!в у сировиш, а ще визначити ri види сировини, що морфолог!чно та анатом!чно схож1 з листям дурману звичайного, проте в1др!зняються б!льшим вмютом атроп!ну чи скополам!ну [8]. Це узгоджуеться з тим, що у монографп вказуеться гранично низький вмют алкало!д!в та не дозволяеться використовувати сировину !з завищеним вмютом цих б!олог!чно активних сполук [5, 8].
За методикою щентифжацп за £Ф для оброб-ки пластин використовували реактив Драгендорфа з подальшим обприскуванням пластинки розчином натрш н!триту. Для цього, п!сля проходження системою розчиннишв в!дстан! 10 см ввд л!н!! старту, пластинку висушували при температур! в!д 100 до 105 °С протягом 15 хв, охолоджували та обробляли
реактивом Драгендорфа Р2. П!сля цього пластинку знову висушували та обробляли розчином натрш нириту до зникнення жовтого забарвлення пластинки. Пластинку переглядали через 15 хв шсля оброб-ки (рис. 1).
1 2 3
Рис. 1. Схема хроматограми випробовуваних розчишв з листя дурману шсля обробки пластинки розчином натрш нириту
При проведенш даного випробування на вс!х дослвджуваних зразках сировини було встановлено, що на хроматограмах спостер!галась наявн!сть плям на р!вш зон розчин!в пор!вняння: скополам!ну (А) та г!осц!ам!ну (Б). Шсля обробки пластин розчином натрш нприту спостерпали забарвлення зон, що вщповвдали г!осц!ам!ну, у червоно-коричневий кол1р. Зони, що в!дпов1дали скополам!ну, характеризува-лись менш !нтенсивним забарвленням. На шдстав! !нтенсивност! забарвлення плям, що розташоваш на р!вн! атроп!ну, можна встановити завищену к!льк!сть даного алкало!ду, яка не повинна спостер!гатись у сировиш
Зпдно з методикою щентифжацп алкало!д!в за £Ф також визначаються належн! умови та терм!ни зберпання листя дурману звичайного, що впливають на як!сть сировини, як! встановлюеться шляхом контролю появи додаткових плям на хроматограф випробовуваного розчину. Для цього на хроматограму наносять випробовуваний розчин та розчин пор!вняння у сшввщношенш 10 мкл (рис. 1, 1) та 20 мкл (рис. 1, 3) ввдповщно. Це доз-воляе визначити найменший небажаний вм!ст для супутн!х алкалощв та !нших продукт!в, що могли утворитись у результат! порушення умов зберпання сировини [9-11].
Аналопчна методика вдентифжацп описана у монографп £Ф «Belladonna leaf» [8]. Зпдно до лгге-ратурних джерел, експериментальним шляхом було встановлено, що у старих листях беладони та листях беладони, що були висушен! неналежним способом, визначаються так! продукта розпаду, як тропанол та апоатроп!н. Ц! сполуки визначаються на хромато-грам! при нанесенш випробовуваного розчину у шль-кост! в!д 10 мкл. У методиш зазначаеться про мож-ливу появу додаткових зон у середнш частин! хрома-тограми при нанесенш 20 мкл випробовуваного роз-
чину (апоатротн) або б™ лшп старту на хромато-граш 10 мкл випробовуваного розчину (тропанол).
Оскiльки вимоги до розробки методiв контролю якостi лжарсько1 рослинно! сировини передбача-ють як1сне та шлькюне визначення основних дiючих речовин, одним з етатв нашого дослщження було визначення к1льк1сного вмiсту дшчих речовин (алкалощв) у лисп дурману звичайного.
В обох фармакопеях регламентований вмiст суми алкалощв у перерахунку на гiосцiамiн стано-вить 0,25 %. Кшьшсне визначення суми алкалощв у листi дурману зпдно з вимогами £Ф та ГФ XI проводить методом алкалiметрil iз встановленням точки еквiвалентностi за допомогою iндикатору. Методики к1льк1сного визначення алкалощв у лисп дурману за £Ф та ГФ XI схож1, проте вiдрiзняються мiж собою пробопщотовкою.
За методикою £Ф для видшення алкалощв сировину спочатку зволожують сумшшю амiаку та дiетилового ефiру та залишають для мацерацп на 4 год. Шсля цього сировину переносять у перколятор та шльшсно перколюють алкало1ди сумiшшю хлороформу та дiетилового ефiру у спiввiдношеннi 1:3 ввдповвдно. Повноту екстракци перевiряють шляхом обробки сухого залишку алiквоти реактивом Нессле-ра. При к1льк1сному визначенш за методикою ГФ XI алкало1ди екстрагують з сировини сумiшшю дiетило-
вого еф1ру та розчину ам1аку при струшуванш протя-гом 1 год. Еф1рну витяжку швидко в1дф1льтровують, промивають водою та ввдбирають ал1квоту еф1ру у дшильну лшку для подальшого екстрагування алкалощв розчином хлористоводнево! кислоти. Повноту екстракци алкалощв за ГФ XI встановлюють за допомогою реактиву Майера. За методикою £Ф отрима-ний перколят також тддають обробщ арчаною кислотою, але тсля концентрування еф1рно! витяжки.
Дал методики практично не мають вщшнно-стей: кислотш витяжки пвдлужують розчином ашаку та основи алкалощв, що утворились в результат цього, екстрагують хлороформом. Хлороформ тсля висушування над натрш сульфатом безводним упа-рюють, залишок розчиняють у атквоп кислоти. За методикою £Ф сухий залишок розчиняють у 0,01 М розчиш арчано! кислоти, згвдно до методики ГФ XI, сухий залишок розчиняють у 0,02 М хлористовод-невш кислота Дал розчини титрують 0,02 М розчином натрш пдроксиду.
Анал1зуючи одержат результати, можна зро-бити висновок, що вмют суми алкалощв в уах анал1зованих зразках листя дурману звичайного знаходиться у межах норм, регламентованих моно-граф1ею £Ф «Stramonium leaf» та статп ГФ XI «Дурмана листья», який складае не менше 0,25 % у перерахунку на атрошн (рис. 2).
0,275
0,27
0,265
0,26
0,255
0,25
0,245
0,24
№1 №2 №3 №4 №5
Зразок листя дурману
№6
№7
■ сф
□ ГФ XI
Рис. 2. Результати шлькюного визначення вм1сту суми алкалощв у зразках листя дурману звичайного
7. Висновки
Таким чином, методика щентифжацп алкалощв у лисп дурману методом ТШХ дозволяе не тшьки вдентифшувати сировину, а ще й здшснити контроль недопустимих вид1в сировини та належ-них умов збертання сировини. Проанал1зувавши методики кшьшсного визначення тропанових алкалощв у лисп дурману, встановлено певш вщшн-носп у !х пробошдготовщ, проте обидв1 методики дозволяють визначити вм1ст суми алкалощв у зразках листя дурману звичайного. За результатами пор1вняльного анал1зу кшьшсного визначення алкалощв встановлено, що ва зразки листя дурману вщповщали встановленим нормування. Най -
бшьшим був вм1ст алкалощв у зразку № 1 i скла-дав 0,27 %, вмiст алкалощв у зразках № 4 та № 6 був встановлений на рiвнi 0,26 %, найменшим вмютом характеризувались зразки № 2, № 3, № 5 та № 7 (0,25 %).
Отримаш експериментальш дат з як1сного та кшьшсного визначення алкалощв в листi дурману звичайного використаш при розробцi монографи ДФУ «Дурману листя».
Лiтература
1. Котов, А. Г. Правила викладання та порядок розробки монографш на лжарську рослинну сировину [Текст] / А. Г. Котов // Управлшня, економжа та забезпечення якосп в фармаци. - 2012. - № 1. - С. 4-10.
2. Котов, А. Г. Дослщження з розробки та введення монографш на лiкарську рослинну сировину до Державно! Фармакопе! Укра!ни [Текст] / А. Г. Котов // Фармаком. -2009. - № 1. - С. 5-19.
3. Siderits, R. Complete Herbal [Text] / R. Siderits. -London: The English Physitian, 2004. - 255 р.
4. Державна Фармакопея Укра!ни [Текст]. - Держ. п-во «Науково-експертинй фармакопейний центр»; 1-е вид. -Харкв: Р1РЕГ, 2001. - 556 с.
5. European Pharmacopoeia. 7th ed. [Text]. - Strasbourg: European Department for the Quality of Medicines, 2009. - 5092 р.
6. Schollkraut G. Deutsches Arzneibuch [Text] / G. Shollkraut. - Stuttgart: Govi-Verlag GmbH, 1992. - 286 р.
7. Государственная фармакопея СССР. Вып. 2. Общие методы анализа. Лекарственное растительное сырье [Текст]. - МЗ СССР; 11-е изд., доп. - М.: Медицина, 1989. -400 с.
8. Котова, Е. Е. Питання введення до Державно! Фармакопе! Укра!ни монографп «Беладони листя» [Текст] / Е. Е. Котова, А. Г. Котов, Н. I. Тихоненко // Фармаком. -2008. - № 1. - С. 8-15.
9. Guide for the elaboration of monographs on herbal drugs and herbal drag preparations [Text]. - European Directorate for the Quality of Medicines, Strasbourg Cedex, France, 2007. - 22 p.
10. Guideline on good agricultural and collection practice (GACP) for starting materials of herbal origin [Text]. -European Medicines Agency, Evaluation of Medicines for Human Use. - London: EMEA, 2006. - 11 p.
11. Гризодуб, А. И. Проблемы введения монографий на лекарственное растительное сырье в Государственную Фармакопею Украины [Текст] / А. И. Гризодуб, Г. В. Георгиевский, Т. М. Тихоненко, В. П. Георгиевский // Фармаком. - 2004. - № 4. - С. 3-17.
References
1. Kotov, A. G. (2012). Rules of presentation and procedure of development of monographs for herbal drugs. Management, Economics and Quality Assurance in Pharmacy, 1, 4-10.
2. Kotov, A. G. (2009). Study of development and introduction of monographs on herbal drugs into the State Pharmacopoeia of Ukraine. Pharmacom, 1, 5-19.
3. Siderits, R. (2004). Complete Herbal. London: The English Physitian, 255.
4. The State Pharmacopoeia of Ukraine. Ukrainian scientific Pharmacopoeial center for quality of medicines. 1st Ed. (2001). Kharkiv: RIREG, 556.
5. European Pharmacopoeia 7th ed. (2009). Strasbourg: European Department for the Quality of Medicines, 5092.
6. Schollkraut, G. (1992). Deutsches Arzneibuch. Stuttgart: Govi-Verlag GmbH, 286.
7. The State Pharmacopoeia of USSR. Issue 2. General methods of analysis. Herbal products. USSR Ministry of Health. 11th Ed. completed (1989). Moscow: Medicine, 400.
8. Kotova, E. E., Kotov, A. G., Tikhonenko, N. I. (2008). Matters of introduction into SPU of the monograph «Belladonna leaf». Pharmacom, 1, 8-15.
9. Guide for the elaboration of monographs on herbal drugs and herbal drag preparations (2007). European Directorate for the Quality of Medicines, Strasbourg Cedex, France, 22.
10. Guideline on good agricultural and collection practice (GACP) for starting materials of herbal origin (2006). European Medicines Agency, Evaluation of Medicines for Human Use. London: EMEA, 11.
11. Grisodub, A. I., Georgiyevsky, G. V., Tikhonenko, T. M., Georgiyevsky, V. P. (2004). Matters of introduction of monographs on herbal drags in the State Pharmacopoeia of Ukraine. Pharmacom, 4, 3-17.
Рекомендовано до публгкацИ д-р фарм. наук Владимирова I. М.
Дата надходження рукопису 12.11.2015
Мщенко Володимир Анатолшович, кандидат фармацевтичних наук, старший викладач, кафедра якосп, стандартизацп та сертифжацп лЫв, Нацюнальний фармацевтичний ушверситет, вул. Пушшнська, 53, м. Харшв, Укра!на, 61002 E-mail: mivlan68@gmail.com
Прокопенко Юлiя СерпУвна, кандидат фармацевтичних наук, доцент, кафедра якосп, стандартизацп та сертифжацп лЫв, Нацюнальний фармацевтичний ушверситет, вул. Пушшнська, 53, м. Харшв, Укра!на, 61002
E-mail: yuliya.prok@gmail.com
