CC BY
73
Овод А. А.
аспирант кафедры микробиологии и иммунологии ФГБОУ ВО Российский Государственный Аграрный Университет - МСХА
имени К.А. Тимирязева, г. Москва, Россия Пушкарева В.И.
доктор биологических наук, ведущий научный сотрудник ФГБУ "ФНИЦ центр эпидемиологии и микробиологии имени почетного
академика Н.Ф.Гамалеи, г. Москва, Россия
ОСОБЕННОСТИ ВЗАИМОДЕЙСТВИЯ ТОКСИН-ПРОДУЦИРУЮЩИХ E.COLI C КЛЕТКАМИ ЗЕЛЕННЫХ КУЛЬТУР Аннотация: Пищевые инфекции с каждым годом становятся все более опасной проблемой для людей, проживающих не только в развивающихся странах, но и в странах с развитой экономикой. Проблема бактериальных кишечных инфекций, в частности, инфекций, ассоциированных с энтерогеморрагическими Escherichia coli (EHEC), носит глобальный характер и для своего решения требует комплексного подхода, включающего, в том числе, экспериментальные исследования в области экологии возбудителей. На моделях вегетирующих растений базилика Ocimum basilicum бактериологическими методами показано длительное существование многочисленных популяций токсин-продуцирующих E. coli O157:H7 внутри растительных тканей. На каллусах листового салата Lactuca sativa изучены стадии формирования биопленок E. coli. Гистологические исследования инфицированных каллусов не выявили выраженного фитопатогенного воздействия на модельные растения.
Ключевые слова: Escherichia coli O157:H7, каллусы овощных культур, биопленки.
Ovod A.A.
graduate student, Department of Microbiology and immunology
Russian State Agrarian University -Moscow Agricultural Academy named after K.A. Timiryazev,
Moscow, Russia Pushkareva V.I. Doctor of biological Sciences, leading researcher
Gamaleya Research Institute of Epidemiology and Microbiology,
Moscow, Russia
THE PECULIARITIES OF INTERACTION OF TOXIN-PRODUCING E. COLI WITH CELLS OF LEAF VEGETABLES Abstract: Food infection is getting increasingly dangerous problem for people living not only in developing countries but also in developed economies. The problem of bacterial intestine infections, particularly of infections associated with enteropathogenic Escherichia coli (EHEC) is global. Its solution requires a complex approach, including experimental studies in the field of bacterial ecology. The model of vegetative Ocimum basilicum plants and bacteriological methods were used to demonstrate the long-term survival of the EHEC populations within plant tissues. Calluses of Lactuca sativa were used to study stages of the formation of E. coli biofilms. The histological studies did not reveal noticeable phytopathological changes in the infected calluses.
Key words: Escherichia coli O157:H7, calluses of vegetable crops, biofilms.
Значение пищевых инфекций с каждым годом все возрастает, что обусловлено перемещением огромного объема пищевой продукции путем межконтинентальных сообщений между государствами, переходом от традиционного питания к так называемому органическому, вегетарианству, фаст-фуду и др [1, c.50]. Особое место в проблеме инфекций пищевого происхождения занимают эшерихиозы - группа острых кишечных заболеваний, вызываемых E.coli и другими эшерихиями.
Кишечная палочка (E. coli) - грамотрициательные палочковидные бактерии; основной и наиболее изученный представитель семейства энтеробактерий, который является симбионтом кишечника животных и людей, выполняя функции нормальной микрофлоры. В природе они встречаются в различных типах почв, водоемах, придонных отложениях,
других объектах окружающей среды, а также в агроценозах и урбоценозах, вовлекаясь в циркуляцию среди теплокровных животных.
Сельскохозяйственные животные признаны основными резервуарами для патогенных эшерихий. Экологические особенности кишечных палочек заключаются в способности к существованию вне связи с организмом теплокровных животных, что позволяет микроорганизмам длительно (до 1,5 года) не только сохраняться, но и размножаться во внешней среде, хорошо адаптируясь к ряду абиотических факторов [4, с.14].
Энтерогеморрагические кишечные палочки (ЕНЕС) являются возбудителями геморрагической диареи (геморрагического колита) и гемолитического уремического синдрома (ГУС). E. coli EHEC способны выделять цитотоксин, вызывающий гибель клеток живых организмов. Также практически все ЕНЕС образуют шигаподобный токсин I типа (веротоксин 1), аналогичный токсину, выделяемому Shigella dysenteriae, а большинство и шигаподобный токсин II типа (веротоксин 2). Эшерихиозы человека, связанные с E.coli, продуцирующими веротоксины/шигатоксины и способными убивать вероклетки (Vero cells), равнозначно трактуются во всем мире - представляют глобальную проблему [10, с.1161].
Детально изучены закономерности и механизмы существования патогенных микроорганизмов в почвенных и водных экосистемах лишь для возбудителей сапронозов: Vibrio cholerae, Listeria monocytogenes, Yersinia enterocolitica, Yersinia pseudotuberculosis, Pseudomonas spp [3].
Существует множество публикаций, описывающих динамику размножения возбудителей пищевых инфекций на листовых салатах и др. овощных культурах, не подвергающихся тепловой обработке, но растения, при этом, рассматриваются скорее как субстраты, чем как живые организмы, обладающие защитными механизмами, иммунитетом [8,9,11-14]. Формирование биопленки на поверхности растений, как один из механизмов взаимодействия патогенов с растительными клетками не рассматривалось,
кроме наших многочисленных исследований на модели изогенных штаммов Listeria monocytogenes [2, c.66, 5, c.44].
В экспериментах были использованы: токсин - продуцирующий (VT1) штамм E. coli ATCC № 43890 (O157:H7) США, выделенный от человека (коллекция ВГНКИ) и К12, используемый в генно-инженерных исследованиях (коллекция лаборатории). Эшерихии культивировали на среде Эндо и сердечно-мозговом бульоне (BHI, Difco, США), либо в почвенной вытяжке, полученной из гумусированной иловато-болотной почвы (оз. Неро). Идентификацию и биохимические свойства изолятов из почвенной вытяжки, растительных тканей оценивали на тест-системах API-Е (Bio-Merieux, Франция). При сомнительных результатах посевов - с помощью полимеразной цепной реакции (ПЦР), в нашей модификации, с парой праймеров ttc-gct-ctg-caa-tag-gta и ttc-ccc-agttca-atg-taa-gat, являющихся специфическими, направляющими амплификацию фрагмента гена шига-токсина 1 (stxl). Стерильные растения базилика (Ocimum basilicum) выращивали до стадии листообразования в цилиндрических сосдуах, а каллусы пекинской капусты и листового салата на среде Мурасиге - Скуга в чашках Петри при влажности воздуха 70%, освещенности 5000 люкс в течение 30-45 суток. Масса посадочного инокулюма растительных клеток составляла 0,25 г. Следует отметить, что все образцы, как каллусы, так и вегетирующие растения срезали стерильно extempore для бактериологического анализа, а также для фиксации в экспериментах по изучению биопленок и гистологии тканей (биоматериал не подвергался консервации и хранению)[ 6, c.298].
Для изучения формирования биопленки на каллусных культурах листового салата пробоподготовку наружно контаминированных образцов (106 м.к./г) осуществляли путем фиксации по Ito-Karnovsky с последующим напылением слоя золота или углерода толщиной 5 nm с помощью напылительной установки (SPI Inc, USA). Препараты анализировались
методом сканирующей электронной микроскопии (СЭМ) в микроскопе Quanta 200 3D (FEI Compani, USA)[ 6, c.298].
Заражение вегетирующих растений и каллусов для бактериологических исследований проводили с помощью шприца, вводя бактериальную суспензию в агар под каждый образец, в зависимости от задачи опыта, в дозах от 10 до 10 м.к./мл. Посевы исследовали в динамике (через 1-3-5-7 суток после заражения) путем высева суспензии из гомогенизированных в изотоническом растворе хлористого натрия образцов (Disperser T 10 basic IKA, Germany) на среду Эндо для количественного учета по колониеобразующим единицам (КОЕ) (рис.1). Перед измельчением каждый образец отмывали гентамицином (100 мкг/г) для элиминации наружных контаминантов [6, c.298].
Рисунок 1. Учет численности эшерихий по КОЕ на среде Эндо Фиксация образцов осуществлялась в течение 3 суток при комнатной температуре в растворах уксусной кислоты и этилового спирта (95%) в соотношении 3:1, с последующей промывкой тканей в дистиллированной воде. Затем следовала проводка образцов через “батарею спиртов” от 70 до 96°С для обезвоживания. После обработки смолами и отвердителями образцы подвергались резке на микротоме Reichert-jung (Германия), после чего полученные срезы препарата помещались на предметное стекло и подсушивались в течение 5 мин.
Микроскопические исследования образцов проводили в проходящем свете с помощью микроскопа Axio Imager М1 (Zeiss, Германия) при максимальном увеличении х2000. Микрофотоснимки сделаны цифровой камерой AxioCamMRm и обработаны с использованием программы AxioVision [6, с.298].
Опыты по оценке динамики численности популяций E.coli EHEC и K12 в почвенной вытяжке при 30°С показали способность токсин-продуцирующего штамма не только сохранять высокую численность на протяжении срока наблюдений (7 суток), но и несколько увеличивать ее (рис. 2), тогда как лабораторный штамм не способен выживать в естественной среде - почвенной вытяжке - более пяти суток.
Сутки
—■—E.coli EHEC - - E.coli K12
Рисунок 2. E.coli в почвенной вытяжке (30 °С)
Далее необходимо было выявить механизм адгезии эшерихий к растительным тканям овощных культур, как начальный этап формирования биопленки на моделях листового салата, наиболее часто входящего в рацион “фаст-фуда”. Ранее доказано, что эпидемиологическую опасность представляют не единичные бактерии - возбудители пищевых инфекций, а их сообщества, колонизирующие различные продукты питания, размножаясь на их поверхности и формируя устойчивые биопленки [5, с.44].
При контаминации каллусов культурой эшерихий обоих штаммов уже через 6 часов можно наблюдать начальный этап формирования биопленки -адгезию бактерий, не равноценную на различных участках тканей (от нескольких десятков до нескольких тысяч клеток) (рис. 3).
Рисунок 3. Образование биопленки на листовом салате: а - E.coli EHEC (х24000); б
- E.coli К12 (х12000)
Образцы интактных каллусов (контроль) демонстрируют скопление клеток на плотной питательной среде: каллусная культура гетерогенна и представлена как молодыми клетками, так и более старыми (рис. 4).
Рисунок 4. Интактный каллус листового салата - (х2000)
Интересно было исследовать возможность проникновения E. coli внутрь вегетирующих растений на модели базилика, выращенного до стадии листообразования. После инокуляции бактериальной суспензии в ризосферу проростков через сутки отмечали логарифмическую стадию роста
численности популяций: для штамма EHEC - до 7 суток, для K12 - до 5 суток (рис. 5).
Рисунок 5. E.coli в ассоциации с базиликом (30оС).
Культуральные, морфологические и биохимические свойства изолятов эшерихий, полученных в ходе экспериментов, не изменялись. Взаимодействие эшерихий с растительными тканями (пекинская капуста) исследовали гистологическим методом в динамике: через 18, 24 и 36 часов после заражения. В первые сутки морфология каллусов, зараженных обоими штаммами, оставалась сходной. Однако уже в ранние сроки отмечено проникновение как энтеропатогенных, так и непатогенных эшерихий в межклеточное пространство без повреждения клеток-хозяев. В более поздние сроки (48-72 часа) воздействия E. coli EHEC встречались растительные клетки увеличенных размеров c деформированными клеточными стенками, образующими значительное число выпячиваний, либо втягиваний внутрь клетки-хозяина (рис. 6).
Рисунок 6. E.coli EHEC в толще каллусной ткани (*2000) Исследование взаимодействия с клетками каллуса E. coli штамма K12 не выявило проникновения за пределы клеточных стенок; бактерии ло-кализовались в межклеточном пространстве, не оказывая цитопатогенного воздействия (рис.7).
Рисунок 7. E.coli К12 в толще каллусной ткани (*2000)
Таким образом, культивирование E. coli штамма O157:H7 в почвенной вытяжке выявило более длительное существование бактерий в высокой численности в отличие от лабораторного штамма.
Популяционная динамика E. coli, как токсин-продуцирующих, так и авирулентных, колонизирующих ткани растений, носила сходный характер. Статистическая обработка показала достоверность полученных результатов в пределах доверительных интервалов (рис. 5).
Взаимодействие с каллусными культурами, исследованное с помощью СЭМ, продемонстрировало формирование бактериальной биопленки с выраженным экзополисахаридным матриксом уже через сутки, что, по-видимому, происходит благодаря мощному флагеллярному аппарату эшерихий: жгутикам, пилям, фимбриям [7, с.53]. Популяционная динамика патогенных E.coli, инокулированных в ризосферу базилика показала накопление эшерихий в вегетативных органах и сохранение их на
протяжении срока наблюдений. Полимеразная цепная реакция подтвердила длительное сохранение токсина.
Микроскопия в проходящем свете гистологических срезов обнаружила слабое цитопатогенное воздействие на отдельные клетки бактерий, не относящихся к паразитам растений, однако вызывающих тяжелые инфекции у человека и животных при алиментарном пути заражения. Напротив, лабораторный штамм, не оказывал видимого воздействия на модельную культуру, хотя бактерии проникали в межклеточное пространство, сохраняясь в высокой концентрации.
Список литературы
1. Годова, Г.В., Овод, А.А., Калашникова, Е.А., Князев, А.Н., Пушкарева В.И., Диденко Л.В., Ермолаева С.А. Образование биопленок Listeria monocytogenes при взаимодействии с растительными клетками // ХХ! век: итоги прошлого и проблемы настоящего плюс: Научно-методический журнал. - 2013. - № 09(13) Том 2 - Пенза: Изд-во ПензГТУ, 2013. - С. 62-70.
2. Годова, Г.В., Пушкарева, В.И., Калашникова, Е.А., Овод, А.А., Диденко, Л.В., Князев, А.Н., Ермолаева, С.А. Формирование биопленок Listeria monocytogenes при взаимодействии с клетками овощных культур // Известия ТСХА №5, 2013. - С. 50-59.
3. Литвин, В.Ю., Гинцбург, А.Л., Пушкарева, В.И. и др. Эпидемиологические аспекты экологии бактерий. / В.Ю. Литвин, А.Л. Гинцбург, В.И. Пушкарева. - М.: Фармарус, 1998. 256с.
4. Пушкарева, В.И., Литвин, В.Ю., Ермолаева, С.А. Растения как резервуар и источник возбудителей пищевых инфекций // Эпидемиология и вакцинопрофилактика. 2012. № 2. С. 10-20.
5. Пушкарева, В.И., Диденко, Л.В., Годова, Г.В., Овод, А.А., Калашникова, Е.А., Ермолаева, С.А. Listeria monocytogenes - взаимодействие с агрокультурами и стадии формирования биопленки // Эпидемиология и Вакцинопрофилактика. 2013. №1. - С.42-49.
6. Пушкарева, В.И., Диденко, Л.В., Овод, А.А., Ермолаева, С.А. Взаимодействие Escherichia coli с растениями на популяционном и клеточном уровнях // Успехи современной биологии. 2015. Т. 135. № 3. - С. 297-306.
7. Рыбальченко, О.В., Бондаренко, В.М., Добрица, В.П. Атлас ультраструктуры микробиоты кишечника человека. СПб.: ИИЦ ВМА, 2008. 112с.
8. Brandl M.T. Fitnes of human enteric pathogens on plants and implications for food safety // Ann. Review of Phytopathol. 2006. V. 44. P. 367369.
9. Brandl M.T. Plant lesions promote the rapid multiplication of
Escherichia coli O157:H7 on postharvest lettuce // Appl. Environ. Microbiol. 2008. V. 74 (17). P. 5285-5289.
10. Cooley M.D., Carychao I., Mandrell R.E. Incidence and tracking of Escherichia coli 0157:H7 in a watershed associated with a major produce production region in California // PLoS One. 2008. V. 2. P. 1159.
11. Dong Y., Iniguez A.L., Ahmer B.M. Kinetics and strain specificity of rhizosphere and endophytic colonization by enteric bacteria on seedlings of Medicago sativa and Medicago truncatula // Appl. Environ. Microbiol. 2003. V. 69 (3). P. 1783-1790.
12. Heaton J.S., Jones K. Microbial contamination of fruit and vegetables and the behavior of enteropathogens in the phyllosphere // J. Appl. Microbiol. 2008. V. 104.P. 613-626.
13. Martinez J.L. Bacterial pathogens: from natural ecosystems to human hosts // Environ. microbiol. 2013. V. 15.P. 325-333.
14. Tyler H.L., Triplett E.W. Plants as a habitat for beneficial and/or human pathogenic bacteria // Ann. Rev. Phytopathol.2008. V. 46. P. 53-73.
