CC BY
59
БИОЛОГИЧЕСКИЕ НАУКИ И ФИЗИКА
УДК 577:574.24:612.019:591.1:351.777.61 ББК 28.672:52.84
Плотникова Ольга Михайловна
кандидат химических наук, доцент г. Курган Савинова Ирина Викторовна научный сотрудник г. Курган Матвеев Николай Николаевич научный сотрудник г. Курган Корепин Антон Михайлович научный сотрудник г. Курган
Евдокимов Александр Николаевич
научный сотрудник г. Курган Лунева Светлана Николаевна доктор биологических наук г. Курган Plotnikova Olga Mikhailovna Candidate of Chemistry, Assistant Professor Kurgan Savinova Irina Viktorovna Research Officer Kurgan
Matveev Nikolay Nikolayevich
Research Officer Kurgan
Korepin Anton Mikhailovich
Research Officer Kurgan
Evdokimov Aleksandr Nikolayevich
Research Officer Kurgan
Luneva Svetlana Nikolayevna
Doctor of Biology Kurgan
Особенности влияния различных доз метилфосфоновой кислоты на основные биохимические показатели метаболизма лабораторных мышей Peculiarities of Different Doses of Methylphosphonic Acid Influence on the Main Metabolism Biochemical Factors of the Laboratory Mice
Изучены биохимические показатели крови, мышц и печени у лабораторных мышей через 72 часа после подкожного введения метилфосфоновой кислоты (МФК) в высокой и низкой дозах (2 и 10-15 мг/кг). Показано, что МФК оказывает достоверное влияние на показатели белкового, липидного и энергетического обменов при воздействии как высокой, так и низкой доз МФК, действуя на антиоксидантную систему и приводя, в основном, к окислительной модификации белков.
The article studies biochemical factors of blood, muscles and liver of the laboratory mice in 72 hours after sub-dermal injection of methylphosphonic acid (MPA) in high and low doses (2 and 10-15 mg/kg). It is shown that MPA renders the reliable influence upon the index of protein, lipid and energy metabolism while manipulating by high and low MPA dose; it influences antioxidant system and leads to oxidative protein modification.
Ключевые слова: метилфосфоновая кислота, биохимические показатели крови мышей, белковый, липидный и энергетический обмен.
Key words: methylphosphonic acid, biochemical factors of mice's blood, protein, lipid and energy metabolism.
Необходимость разработки и совершенствования критериев комплексной оценки воздействия на окружающую среду токсичных отходов закреплена Федеральным законом «Об охране окружающей среды» (статья 70). Согласно «Санитарным правилам по определению класса опасности токсичных отходов производства и потребления» экспериментальная оценка степени опасности специфичных загрязняющих веществ, влияющих на теплокровный организм (в том числе по биохимическим показателям), является обязательной, когда возможно действие этих компонентов отхода на здоровье человека [10]. В связи с этим в лаборатории экотоксикологии Регионального центра по обеспечению экологического мониторинга объектов по уничтожению химического оружия по Курганской области проводится изучение биохимических показателей крови лабораторных мышей с целью выявления закономерностей их изменения после воздействия на организм животного специфических загрязняющих веществ.
Целью настоящей работы стало определение биохимических характеристик крови, мышц и печени лабораторных мышей при воздействии высоких и низких доз метилфосфоновой кислоты (МФК).
Объектами исследования являлись кровь, мышечная ткань и печень мышей линии СВА в возрасте 2-х месяцев массой 24±2 г, которые содержались
в стандартных условиях аттестованного вивария. Эвтаназия осуществлялась методом декапитации с соблюдением всех биоэтических правил работы с лабораторными животными [7, 11].
Опытным группам лабораторных мышей (по 10 особей в каждой) подкожно вводили нейтрализованные растворы МФК в дозе 2 мг/кг (высокая доза) и 10-15 мг/кг (низкая доза), контрольным группам - физиологический раствор хлористого натрия. Биохимические показатели плазмы (сыворотки), эритроцитарной массы крови, мышечной ткани и печени мышей определяли через 72 часа (трое суток) после введения МФК.
Совокупности полученных экспериментальных данных в каждой выборке описывали с помощью медианы и процентилей. Данные обрабатывались методами непараметрической статистики, достоверность различий между выборками экспериментальных данных оценивали с использованием критерия для независимых выборок - Вилкоксона-Манна-Уитни при р<0,05 [4].
Методами исследования стали адаптированные методики, по которым в биоматериале лабораторных мышей определяли: в печени и мышцах - гликоген (ГЛпеч, ГЛм) с антроновым реактивом [12], в скелетных мышцах - креатин (Кр) с диацетилом и креатинфосфат (КрФ) по содержанию фосфора [8]; в сыворотке крови - активность креатинкиназы (КК) наборным методом «Витал Диагностикс СПб», лактат (МК) методом с 4-аминоантипирином [6], пируват (ПВК) по реакции с динитрофенилгидразином [1], активность лактатдегидрогеназы (ЛДГ) наборным методом DiaSys Diagnostic (Германия), триглицериды (ТГ) наборным методом «Триглицериды-Ново» (г. Новосибирск), общие липиды (ОЛ) наборным методом «La^ema Diagnostika» (Хорватия), холестерин (ХС) энзиматическим методом Триндера [6], малоновый диальдегид (МДА) с тиобарбитуровой кислотой [9], активность супероксиддисмутазы (СОД) с нитросиним тетразолием (НСТ) [2], активность холинэстеразы (ХЭ) при восстановлении тиохолином окрашенного гексацианоферрата [6], продукты перекисного окисления белков (ПОБ) по концентрации альдегидо- (АФГ или ПОБ270) и кето- (КФГ или ПОБ363+370) 2,4-
динитрофенилгидразонов при длинах волн 270, 363, 370 нм [3], общий белок (ОБ) [6], в плазме крови и эритроцитах - олигопептиды (ОПпл, ОПэр) по методу Лоури [5], вещества низкой и средней молекулярных масс (ВНСММпл, ВНСММэр) и их катаболические фракции (КПпл, КПэр) в плазме и эритроцитах по методу Малаховой [5].
Результаты и их обсуждение
Изменения в ряду важнейших показателей энергетического обмена, перекисного окисления липидов (ПОЛ) и белков (ПОБ), антиоксидантной системы (АОС), маркеров эндогенной интоксикации (ЭИ) у лабораторных мышей через 72 часа после введения МФК в дозах 2 мг/кг и 10-15 мг/кг
приведены на рисунках 1 и 2.
18 17 16
18 17 16
1 а
1 б
1 - ГЛпеч, 2 - ГЛм, 3 - КрФ, 4 - Кр, 5 - КК, 6 - ПВК, 7 - МК, 8 - ЛДГ, 9 - ОЛ, 10 - ХС, 11 - МДА, 12 - СОД, 13 - ПОБ270 (АФГ) , 14 - ПОБ363+370 (КФГ), 15 - ОБ, 16 - ОПпл, 17 - ОПэр, 18 - ВНСММпл, 19 - ВНСММэр, 20 - КПпл, 21 - КПэр.
Примечание. Здесь и далее на рисунках указаны процентные отличия опытных групп относительно контрольных групп только для показателей с достоверным отличием значений при уровне значимости различий: * р<0,05, ** р<0,005, *** р<0,0005._
1
Рис. 1. Изменение биохимических показателей у мышей-самцов опытных групп (в % относительно контрольных групп) через 72 часа после введения МФК в дозе 2 мг/кг: 1а - у самцов, 1б - у самок.
Наибольшие изменения гомеостаза произошли под действием МФК в дозе 2 мг/кг у самок и под действием МФК в дозе 10-15 мг/кг у самцов. Из 21-го изученного показателя изменения на 20% и более были отмечены у самок по 12
показателям после введения МФК в высокой дозе, а у самцов - по 13 показателям после введения МФК в низкой дозе.
При действии МФК в дозе 2 мг/кг (рис. 1) у самцов и у самок уменьшался уровень гликогена печени (на 12 и 31%, соответственно) и увеличивалось содержание ПВК в сыворотке крови (на 24 и 86%, соответственно), что соответствует увеличению скорости гликолиза и гликогенолиза.
При этом, введение самкам МФК в дозе 2 мг/кг вызывало существенное уменьшение содержания гликогена в мышцах (на 79%), повышение уровня ПВК (на 86%) при одновременном достоверном повышении содержания МК (на 20%), что может указывать на дефицит в клетках кислорода, необходимого для глюконеогенеза или окисления ПВК. Косвенным подтверждением этого служит снижение в крови мышей-самок уровня продуктов ПОБ (АФГ - на 19% и КФГ - на 54%), уменьшение ОПпл и ОПэр, ВНСММ в плазме (на 25%) и лишь небольшое повышение ВНСММ в эритроцитах (на 17%). Уровень гликогена в мышцах у мышей-самцов после введения высокой дозы МФК значительно увеличился (на 168%) при уровне МК в пределах нормы, незначительном увеличении ПВК (на 24%) и отсутствии продуктов окисления белков. Это предполагает усиленный синтез гликогена в мышцах мышей-самцов по пути глюконеогенеза.
После введения МФК в дозе 10-15 мг/кг (рис. 2) у мышей-самцов наблюдалось повышение уровня гликогена печени на 55% при одновременном уменьшении в крови концентрации ПВК и МК на 56 и 28% соответственно. Также происходило повышение в крови содержания продуктов ПОБ на 35-75%, ОПпл - на 90% и ВНСММпл и ВНСММэр - на 47 и 20% соответственно.
Можно предположить, что значительный рост продуктов ОМБ и распада белков приводит к увеличению скорости переаминирования и к увеличению уровня глюкогенных аминокислот, из которых легко образуются субстраты цикла Кребса, что приводит к избытку ацетил-коэнзима, регулятора активности пируваткарбоксилазы, и усилению процессов глюко- и гликонеогенеза.
18
17
_12_
18
17
12
2 а
2 б
1 - ГЛпеч, 2 - ГЛм, 3 - КрФ, 4 - Кр, 5 - КК, 6 - ПВК, 7 - МК, 8 - ЛДГ, 9 - ТГ, 10 - ОЛ, 11 - ХС, 12 - МДА, 13 - СОД, 14 - ПОБ270 (АФГ) , 15 - ПОБзбз+з7о (КФГ), 16 - ОБ, 17 - ОПпл, 18 - ОПэр, 19 - ВНСММпл, 20 - ВНСММэр, 21 - КПпл, 22 - КПэр.
1
6
6
7
7
Рис. 2. Изменение биохимических показателей у мышей-самцов опытных групп (в % относительно контрольных групп) через 72 часа после введения МФК в дозе 10-15 мг/кг: 2а - у самцов, 2б - у самок.
У самок в противоположность самцам под действием низкой дозы МФК уровень гликогена в печени и мышцах уменьшался на 26 и 75%, соответственно. При этом снижалось содержание ПВК (на 53% при уровне МК в пределах нормальных значений) и незначительно повышался уровень АФГ (на 13%), а уровень ОП и ВНМММ увеличивался только в эритроцитах (на 30 и 40%, соответственно). В то же время, в крови мышей-самок значительно повышалось содержание триглицеридов (на 59%).
Возможно, такие изменения связаны с усилением утилизации глюкозо-6-фосфата по пентозофосфатному пути с образованием НАДН, который предохраняет ненасыщенные жирные кислоты и белковые молекулы клеточных мембран от аномальных взаимодействий с радикальными частицами. Кроме того, может увеличиваться синтез из глюкозо-1-фосфата глюкуроновой кислоты, которая играет важную роль в обезвреживании и выведении из организма низкомолекулярных токсичных органических веществ.
Таким образом, введение мышам-самцам МФК в низкой дозе приводило к существенному влиянию на систему белкового обмена - росту продуктов ОМБ и распада белков. Введение же мышам-самкам МФК в высокой и низкой дозах
влияло, в основном, на углеводный и липидный обмен - падал уровень гликогена в печени и мышцах, изменялось содержание ПВК и МК.
Для повышения информативности результатов нами были применены интегральные индексы. Так, по интегральным индексам, характеризующим АОС, процессы ПОЛ и ПОБ (рис. 3), видно, что у самцов и у самок при введении высокой дозы МФК интенсивность процессов АОС увеличивалась: коэффициенты антиоксидантной нагрузки СОД/МДА и СОД/ПОБ повышались, причем у самок гораздо значительнее. Так, у самок отношение СОД/МДА и СОД/ПОБ увеличилось по отношению к значениям в контрольных группах мышей на 96 и 93%, а у самцов эти же показатели увеличились на 59 и 26%, соответственно. Такое увеличение активности АОС при введении высокой дозы МФК привело к снижению уровня МДА и продуктов ПОБ: отношение МДА/ОЛ у самок уменьшилось на 26%, %КФК у самок и у самцов - на 29-31%.
220
180
140
%
100
60
20
159**
425*
-69*-
9**
ИТ*
46***
2мг/кг самцы 10-15мг/кг
Ш МДА/ОЛ □ СОД/МДА В %КФГ 5 СОД/ПОБ
3 а
220 180
140
%
100 60 20
2мг/кг самки 10 15мг/кг
□ МДА/ОЛ В %КФГ
□ СОД/МДА В СОД/ПОБ
3 б
Рис. 3. Интегральные индексы системы АОС, ПОЛ и ПОБ в крови мышей опытных групп через 72 часа после введения МФК: 3а - в дозе 2 мг/кг; 3б - в дозе 10-15 мг/кг.
При введении низкой дозы МФК интенсивность процессов АОС в целом увеличивалась больше у самцов (СОД/МДА у самцов и у самок увеличивается на 129 и 55%, соответственно, при незначительном уменьшении СОД/ПОБ). Однако, если увеличение активности АОС у самок при введении НД МФК привело к снижению МДА/ОЛ и %КФГ, то у самцов МДА/ОЛ снизилась (как и у самок), а %КФГ увеличился на 21%. Видимо, АОС у самцов не справилась с нагрузкой, а «удар» на себя приняли белковые молекулы.
Для характеристики синдрома эндогенной интоксикации (ЭИ) были применены: а) индекс интоксикации (ИИ, равен сумме произведений концентрации ВНСММ и ОП в плазме и эритроцитах), позволяющий провести комплексную оценку ЭИ и отразить роль ОП в ее развитии; б) коэффициент эндогенной нагрузки (КЭН, равен произведению отношения концентраций ВНСММ в плазме и эритроцитах на сумму ВНСММ плазы и эритроцитов; г) уровень КП в объеме ВНСММ плазмы и эритроцитов (%КПпл и %КПэр), равное отношению величины катаболического пула к уровню ВНСММ.
300 250
200 %
150
100 50
76*
83*
306***
"228*
гл-15
2мг/кг самцы 10 мг/кг 13 ИИ ЕЗ КЭН 0 %КПпл
%
180 160 140 120 100 80 60 40
73*
64**
135*
178*
2мг/кг самки 10 15мг/кг
Ы ИИ
I КЭН
□ %КПпл
4 а
4 б
Рис. 4. Интегральные индексы синдрома ЭИ в крови опытных
групп мышей через 72 часа после введения МФК:
4а - в дозе 2 мг/кг (ВД); 4б - в дозе 10-15 мг/кг (НД).
Интегральные индексы ИИ, КЭН у самцов и у самок при введении
высокой дозы МФК понижены на 17-24% у самцов и на 27-36% у самок;
однако, %КП у самцов повышен на 33%, а у самок понижен на 27%. При
введении низкой дозы МФК интегральные индексы ЭИ и у самцов и у самок
повысились, но у самцов их повышение гораздо значительнее: ИИ, КЭН,
%КПпл увеличены на 128, 57 и 206%, соответственно.
Таким образом, независимо от доз, МФК оказывала влияние на
активность АОС мышей. При этом, организм самок лучше справлялся с нагрузкой на АОС, а глубина изменений биохимических показателей ОМБ и ЭИ более выражена у самцов при введении МФК в низкой (10-15 мг/кг) дозе.
Изучение активности специфического фермента холинэстеразы (ХЭ) после введения мышам-самцам как высоких, так и низких доз МФК через 72 часа привело к результатам, показанным на рисунке 5. После введения как высокой, так и низкой дозы МФК через 72 часа происходило понижение активности ХЭ в сыворотке крови мышей на 18% при действии МФК в дозе 2 мг/кг и на 43% при действии МФК в дозе 10-15 мг/кг. Эти данные также подтверждают, что МФК в низкой дозе влияет на процессы метаболизма на уровне белковых молекул, в том числе ферментов.
8000
7000
6000 Е/л
5000 4000 3000 2000
□ Контроль Ш 2 мг/кг Ш1Е-15 мг/кг_
5 а
100
90
^
о 80 л н к
§ 70
н о
^ 60
50
40
5 б
Рис. 5. Изменение активности холинэстеразы в сыворотке крови мышей-самцов через 72 часа после введения МФК в дозах 2 и 10-15 мг/кг: 6а -активность ХЭ в Е/л; 6б - активность ХЭ в % относительно контроля.
Таким образом, полученные данные в экспериментальной работе показали, что МФК оказывает достоверное влияние на показатели белкового, липидного и энергетического обменов при воздействии как высокой (2 мг/кг), так и низкой (10-15 мг/кг) доз МФК. В большей степени МФК действует на антиоксидантную систему, приводя, в основном, к окислительной модификации белков.
Результаты этих исследований могут быть использованы для оценки состояния лабораторных мышей как тест-объектов при определении токсичности специфических загрязняющих веществ, как в высоких, так и в малых дозах, и состояния представителей животного мира в районах расположения объектов хранения и уничтожения химического оружия.
Библиографический список
1. Бабаскин Б.С. Определение пировиноградной кислоты модифицированным методом Умбрайта / Б.С. Бабаскин // Лаб. дело. - 1976. № 3. - С. 76.
2. Векслер Б.М. Характеристика системы перекисного окисления липидов крови в семьях больных ишемической болезнью сердца: дис. ...канд. биол. наук / Б.М. Векслер. -СПб.: 1995. - 76 с.
3. Вьюшина А.В. Различия в процессах перекисного окисления белков у крыс, селектированных по порогу возбудимости нервной системы / А.В. Вьюшина, И. А. Вайдо, И.Г. Герасимова, Н.П. Ширяева, М.А. Флеров // Бюллетень экспериментальной биологии и медицины. - 2002. № 3. - С. 292-296.
4. Гланц С. Медико-биологическая статистика / С. Гланц. - М.: Практика, 1998. - 459 с.
5. Малахова М.Я. Методы биохимической регистрации эндогенной интоксикации. Сообщение второе / М.Я. Малахова // Эфферентная терапия. - 1995. Т. 1. № 2. - С. 61-64.
6. Методика выполнения измерений биохимических показателей в плазме (сыворотке) крови мелких теплокровных животных фотометрическим методом. Свидетельство об аттестации МВИ № 22.11.03.052/2009. - Курган: 2009. - 42 с.
7. Правила лабораторной практики в Российской Федерации. Приказ МЗ № 267. -М.: 2003.
8. Практикум по биохимии / Под ред. С.Е. Северина, Г. А. Соловьевой. - М.: Изд-во МГУ, 1989. - 509 с.
9. Современные методы в биохимии / Под ред. В.Н. Ореховича. - М.: Медицина, 1977. - С. 62-68.
10. Санитарные правила по определению класса опасности токсинных отходов производства и потребления. СП 2.1.7.1386-03. Постановление Минздрава № 144. - М.: 2003.
11. Требования Международного комитета по науке по использованию в экспериментальных исследованиях лабораторных животных // Бюллетень ИКЛАС. - 1978. № 24.- С. 4-5.
12. Филиппович Ю.Б. Практикум по общей биохимии / Ю.Б. Филиппович, Т.А. Егорова, Г.А. Севастьянова. - М.: Просвещение, 1982. - 311 с.
Bibliography
1. Babaskin, B.S. Determination of Pyruvic Acid by a Modified Umbrayt Method / B.S. Babaskin // Laboratory Work. - 1976. - № 3. - P. 76
2. Filippovich, Yu.B. Workshop on General Biochemistry / Yu.B. Filippovich, T.A. Egorova, G.A. Sevastyanova. - M.: Prosveshchenie, 1982. - 311 p.
3. Glantz, S. Medico-Biological Statistics / S. Glantz. - M.: Practika, 1998. - 459 p.
4. Malakhova, M.Ya. Methods of Biochemical Registration of Endogenous Intoxication. The Second Message / M.Ya. Malakhova // Efferent Therapy. - 1995. - V. 1. - № 2. - P. 61-64.
5. Methods of Biochemical Parameters Measurement in Blood Plasma (Serum) of Small Warm-Blooded Animals by Photometric Method. Certificate № 22.11.03.052/2009. - Kurgan: 2009. - 42 p.
6. Modern Methods of Biochemistry / Ed. by V.N. Orekhovich. - M.: Meditsina, 1977. - P.
62-68.
7. Practical Work on Biochemistry / Ed. by S.E. Severin, G.A. Solovyeva. - M.: MSU, 1989. - 509 p.
8. Requirements of the International Committee on Science on the Use of Laboratory Animals in Research / / Bulletin of IKLAS. - 1978. - № 24. - P. 4-5.
9. Sanitary Rules of Dangerous Toxins Class Definition of Waste Production and Consumption. SP 2.1.7.1386-03. Health Ministry Decree № 144. - M., 2003.
10. The Rules of Laboratory Practice in the Russian Federation: Ministry of Health Order № 267. - М., 2003.
11. Vyushina, A.V. Differences in the Processes of Protein Peroxide Oxidation of Rats, Selected on the Excitability Threshold of the Nervous System / A.V. Vyushina, I.A. Vaydo, I.G. Gerasimova, N.P. Shiryaeva, M.A. Flerov // Bulletin of the Experimental Biology and Medicine. -2002. - № 3. - P. 292-296.
12. Weksler, B.M. Characteristics of Blood Lipid Peroxidation in the Families of Patients with Coronary Heart Disease: Dis. ... Cand. of Biol. / B.M. Weksler. - SPb.: 1995. - 76 p.
